- Dung dịch chuẩn gốc 1000µg/ml (ppm): Cân chính xác 10mg axit ascorbic vào bình định mức 10ml. Hòa và định mức đến vạch bằng axit photphoric pH = 3 ta thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 1000µg/ml.
- Dung dịch chuẩn trung gian 100µg/ml (ppm): Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc 1000ppm cho vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng dung môi pha động.
- Dung dịch chuẩn làm việc: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 5ppm; 10ppm; 20ppm và 50ppm.
Cân 10g mẫu
Cho mẫu vào ống ly tâm, lắc đều 5 phút bằng máy vortex
Siêu âm mẫu 10 phút, lắc đều 5 phút (5000 vòng/phút)
Định mức vào bình 25ml, lọc qua giấy lọc và màng lọc 0,45µm
Cho vào vial và đem phân tích trên máy HPLC
Cho vào bình định mức 25ml, lặp lại quá trình trên với 10ml axit photphoric pH=3
2.3.3.2. Sơ đồ xử lý mẫu vitamin C
2.3.3.3. Cách tiến hành
Cân chính xác 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml. Thêm 15ml dung dịch axit photphoric pH = 3 vào ống ly tâm và lắc đều 5 phút bằng máy lắc Vortex. Siêu âm 10 phút và ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút trong 5 phút. Gạn dịch trong ở trên vào bình định mức 25ml. Lặp lại quá trình trên với 10ml dung dịch axit photphoric pH = 3. Lấy lớp dịch vào bình định mức 25ml Thêm 15ml axit photphoric pH=3
ở trên, và định mức đến vạch. Lọc dịch qua giấy lọc và màng lọc 0,45µm. Cho dịch vào vail và đem vào máy phân tích HPLC.
2.3.3.4. Điều kiện sắc ký
- Chạy sắc ký với detector UV – VIS bước sóng 254nm.
- Dung môi pha động: MeOH/ axit photphoric (pH =3) = 60:40(V/V) - Cột sắc ký pha ngược RP-18.
-Tốc độ dòng 0,7ml/phút. - Nhiệt độ 30oC
2.3.4. Vitamin E
2.3.4.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin E cho phép đo HPLC
- Dung dịch chuẩn gốc 400ppm: Cân 40mg (±0,1mg) chất chuẩn α- tocopherol ≥ 96% (M(C29H50O2) = 430,7g/mol) vào bình định mức 100ml, hòa tan và định mức đến vạch bằng pha động.
- Dung dịch chuẩn làm việc của vitamin E: Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ lần lượt là 2ppm; 4ppm; 10ppm; 20ppm và 40ppm.
Cân 15g mẫu nấm
40ml etanol, 3g KOH và 1g axit ascorbic
Xà phòng hóa ở 100oC, 30 phútChuyển sang bình tam giác, tráng bằng nước cất và cho vào phễu chiết
Chiết 3 lần với đietylete (30ml/lần), lắc 30 phút, để yên 30 phút, chiết Loại bỏ dung dịch phần dưới
Giữ lại dung dịch phía trên Lọc qua phễu có Na2SO4 khan
Cất quay chân không đến cô cạn
Dung dịch Màng lọc Mẫu bơm vào HPLC
Rửa bằng 10ml pha động
2.3.4.2. Sơ đồ xử lý mẫu vitamin E
2.3.4.3. Cách tiến hành
- Cân khoảng 15g nấm đã được nghiền nhỏ cho vào bình cầu thủy tinh có cổ nhám và tiến hành xà phòng hóa.
- Vitamin E từ dung dịch đã xà phòng hóa được lọc qua giấy lọc rồi chiết 3 lần bằng đietylete, mỗi lần 30ml, lắc 30 phút để yên 30 phút rồi chiết lấy phần trên, bỏ phần dưới.
- Tập trung lớp ete chiết được vào một bình chiết.
- Loại nước còn sót trong dịch chiết ete bằng cách lọc qua lớp dày Na2SO4 khan.
- Gộp tất cả lớp ete vào bình quả lê. Cô quay đến cạn. Cặn còn lại hòa tan trong 10ml pha động.
- Lọc dịch đục qua màng lọc 13mm, 0,45µm và thu dịch lọc và tiến hành phân tích trên máy HPLC.
2.3.4.4. Điều kiện sắc ký
- Chạy sắc ký với detector FLD (huỳnh quang) bước sóng kích thích 254nm, bước sóng phát xạ 330nm.
- Cột sắc ký: Cột sắc ký pha đảo RP-18 - Tốc độ dòng: 0,5ml/ phút
- Pha động: 1,4 đioxan: n-hexan = 1,2: 98,8 - Nhiệt độ lò cột: 30oC
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu định lượng vitamin B2
3.1.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin B2
Tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn như sau: dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1ppm; 0,2ppm; 0,5ppm; 10ppm; 20ppm; 50ppm.
Hình 3.1: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 0,1ppm
Hình 3.3: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 0,5ppm
Hình 3.5: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 20ppm
Kết quả thu được ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Diện tích của vitamin B2 tương ứng với từng nồng độ chuẩn TT Nồng độ chuẩn ppm Diện tích pic
1 0,1 11,643 4 0,2 23,113 2 0,5 57,824 3 10 1160,964 5 20 2482,087 6 50 5909,919
Từ kết quả đã xác định được ở bảng 3.1, vẽ đồ thị sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ ta có đường chuẩn của vitamin B2 như sau:
Phương trình đường chuẩn vitamin B2 có dạng: Y= 122,9877 x -7,7537 Hệ số tương quan R2 = 0,9995
Hình 3.7: Đường chuẩn vitamin B2
3.1.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương phápphân tích phân tích
3.1.2.1. Giới hạn phát hiện LOD
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiên được nhưng chưa thể định lượng được.
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tính hiệu đo.
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu a là độ dốc của đường chuẩn
Chuẩn vitamin B2 ở các nồng độ 0,1ppm; 0,2ppm; 0,5ppm; 10ppm; 20ppm; 50ppm qua 6 lần đo và lặp lại 3 lần được thể hiện qua bảng 3.2.
Bảng 3.2: Nồng độ chuẩn của vitamin B2 qua 3 lần đo Nồng độ chuẩn ppm Diện tích pic SD SDtb Lần 1 Lần 2 Lần 3 0,1 11,643 11,543 11,716 0,087 0,113 0,2 23,113 23,110 23,126 0,009 0,5 57,824 57,758 57,944 0,094 10 1160,964 1160,795 1161,025 0,119 20 2482,087 2482,123 2481,978 0,076 50 5909,919 5909,355 5909,764 0,291
Giá trị LOD của chuẩn vitamin B2:
3.1.2.2. Giới hạn định lượng LOQ
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết qủa có độ chụm mong muốn.
Do đó, giới hạn định lượng của chuẩn vitamin B2 qua 6 lần đo và được lặp lại 3 lần với các nồng độ khác nhau 0,1ppm; 0,2ppm; 0,5ppm; 10ppm; 20ppm; 50ppm là 0,009ppm.
3.1.3. Xác định hàm lượng vitamin B2 trong nấm
Qua số liệu LOD và LOQ ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát hiện và khoảng giới hạn định lượng rất nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, có thể phát hiện được hàm lượng vitamin B2 dưới dạng vết có trong mẫu phân tích.
Hàm lượng vitamin B2 (ppm) có trong mẫu nấm được tính theo công thức sau:
Trong đó: C là hàm lượng vitamin B2 có trong mẫu, tính theo ppm Co là hàm lượng vitamin B2 có trong dịch chiết thông qua đường chuẩn, ppm.
f là hệ số pha loãng (nếu có) m là khối lượng mẫu thử (g)
Vdm là thể tích bình định mức mẫu (ml)
Ta có bảng kết quả phân tích hàm lượng vitamin B2 trong các mẫu nấm
Bảng 3.3: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin B2 trong nấm Mẫu Co (ppm) Khối lượng
mẫu (g) Thể tích mẫu (ml) Diện tích pic C (ppm) HKG 406 0,227 10 50 20,218 1,135 Nấm lỗ 0,212 10 50 18,288 1,060 HKG 401 0,518 10 50 55,899 2,590
TH 04 0,105 10 50 5,108 0,525
01 0,150 10 50 10,701 0,750
3.1.4. Đánh giá phương pháp
3.1.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp
Theo lý thuyết thống kê, các đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại là độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo các công thức sau:
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn n là số lần thí nghiệm
Xi là giá trị tính được của lần thực hiện thứ i là giá trị trung bình của các lần thực hiện
Thực hiện phân tích 10g nấm, tiến hành phân tích lặp lại 3 lần trong cùng một điều kiện. Kết quả phân tích lặp lại 3 lần và độ lặp lại của phương pháp được nêu ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các mẫu nấm TT HKG 406 Nấm lỗ HKG 401 TH 04 01 Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ 1 10 1,135 10 1,060 10 2,590 10 0,525 10 0,750 2 10 1,124 10 1,041 10 2,308 10 0,507 10 0,772 3 10 1,106 10 1,063 10 2,272 10 0,549 10 0,731 1,122 1,055 2,390 0,527 0,751 SD 0,015 0,011 0,174 0,02 0,02 CV 1,34% 1,04% 7,28% 3,80% 2,66%
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 trong mẫu nấm HKG 406 là = 1,1223
Độ lệch chuẩn: = 0,015 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 trong mẫu nấm lỗ là = 1,055
Độ lệch chuẩn: = 0,012 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 trong mẫu nấm HKG 401 là = 2,39
Độ lệch chuẩn: = 0,174 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 trong mẫu nấm TH 04 là = 0,527
Độ lệch chuẩn: = 0,02 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 trong mẫu nấm 01 là
= 0,751
Độ lệch chuẩn: = 0,02 Hệ số biến thiên:
Nhận xét: Theo AOAC hệ số biến thiên CV của phép đo nằm trong khoảng ±10,5%. Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao đáp ứng được yêu cầu định lượng.
3.1.4.2. Xác định độ thu hồi
Trong đó: R% là độ thu hồi, %
Cm+c là nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm là nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Cc là nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Ta có bảng kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ
Bảng 3.5. Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ
TT CNồng độ (ppm) Cm+c - Cm Cc (ppm) %R
m+c Cm
1 2,037 1,059 0,978 1 97,8%
2 2,013 1,041 0,972 1 97,2%
3 2,036 1,063 0,973 1 97,3%
Từ bảng kết quả trên ta có giá trị trung bình %R của mẫu nấm lỗ là: = 97,43%
Độ lệch chuẩn = 0,321 Hệ số biến thiên: = 0,329%
Nhận xét: Dựa vào kết quả đã tính được ta thấy độ thu hồi của 3 phép đo lặp lại lớn khoảng 97% nằm trong giới hạn cho phép của AOAC (90 ± 8%) . Điều này chứng tỏ rằng phương pháp phân tích hàm lượng vitamin B2 trong nấm có độ chính xác cao. Đáp ứng được nhu cầu phân tích.
Hình 3.8: Sắc đồ mẫu nấm HKG 406
Hình 3.10: Sắc đồ mẫu nấm TH04 3.2. Nghiên cứu định lượng vitamin C
3.2.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin C
Tiến hành xây dựng đường chuẩn như sau: dung dịch chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm; 10ppm; 20ppm và 50ppm.
Hình 3.11: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm
Hình 3.12: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 10ppm
Hình 3.14: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 50ppm
Kết quả thu được ở bảng 3.6.
Bảng 3.6: Diện tích của vitamin C tương ứng với từng nồng độ chuẩn TT Nồng độ chuẩn ppm Diện tích pic
3 5 78,061
1 10 160,626
4 20 346,783
2 50 898,867
Từ kết quả đã xác định được ở bảng 3.6, vẽ đồ thị sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ ta có đường chuẩn của vitamin C như sau:
Phương trình đường chuẩn vitamin C có dạng: Y= 18,1277 x -11,3043
Hệ số tương quan R2 = 0,9997
Hình 3.15: Đường chuẩn vitamin C
3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tích
3.2.2.1. Giới hạn phát hiện LOD
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tính hiệu đo.
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu a là độ dốc của đường chuẩn
Chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm; 10ppm; 20ppm và 50ppm qua 4 lần đo và lặp lại 3 lần được thể hiện qua bảng 3.7.
Bảng 3.7: Nồng độ chuẩn của vitamin C qua 3 lần đo Nồng độ chuẩn ppm Diện tích pic SD SDtb Lần 1 Lần 2 Lần 3 5 78,061 78,428 78,260 0,184 0,175 10 160,626 160,840 160,424 0,208 20 346,783 346,903 346,532 0,189 50 898,867 898,690 898,915 0,118
Giá trị LOD của chuẩn vitamin C:
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết qủa có độ chụm mong muốn.
Do đó, giới hạn định lượng của chuẩn vitamin C qua 4 lần đo và được lặp lại 3 lần với các nồng độ khác nhau 5ppm; 10ppm; 20ppm và 50ppm là 0,097 ppm.
3.2.3. Xác định hàm lượng vitamin C trong nấm
Qua số liệu LOD và LOQ ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát hiện và khoảng giới hạn định lượng rất nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, có thể phát hiện được hàm lượng vitamin C dưới dạng vết có trong mẫu phân tích.
Hàm lượng vitamin C (ppm) có trong mẫu nấm được tính theo công thức sau:
Trong đó: C là hàm lượng vitamin C có trong mẫu, tính theo ppm. Co là hàm lượng vitamin C có trong dịch chiết thông qua đường chuẩn, mmg/l.
f là hệ số pha loãng (nếu có) m là khối lượng mẫu thử (g)
Vdm là thể tích bình định mức mẫu (ml)
Ta có bảng kết quả phân tích hàm lượng vitamin C trong các mẫu nấm
Bảng 3.8: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin C trong nấm Mẫu Co (ppm) Khối lượng
mẫu (g) Thể tích mẫu (ml) Diện tích pic C ( ppm) Nấm 01 16,091 10 25 290,563 40,228 Nấm lỗ 55,109 10 25 987,699 137,773 HKG 406 13,524 10 25 233,851 33,810 HKG 401 42,625 10 25 761,399 106,563 TH 04 18,157 10 25 317,846 45,393
3.2.4. Đánh giá phương pháp
3.2.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp
Theo lý thuyết thống kê, các đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại là độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo các công thức sau:
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn n là số lần thí nghiệm
Xi là giá trị tính được của lần thực hiện thứ i là giá trị trung bình của các lần thực hiện
Thực hiện phân tích 10g nấm, tiến hành phân tích lặp lại 3 lần trong cùng một điều kiện. Kết quả phân tích lặp lại 3 lần và độ lặp lại của phương pháp được nêu ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các mẫu nấm TT HKG 406 Nấm lỗ HKG 401 TH 04 Nấm 01 Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Th ể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ 1 10 33,810 10 137,773 10 106,563 10 45,39 3 10 40,228 2 10 33,698 10 137,461 10 106,259 10 45,14 7 10 40,196 3 10 34,018 10 138,02 1 10 106,895 10 45,58 2 10 40,314 33,842 137,752 106,572 45,374 40,246 SD 0,162 0,281 0,318 0,218 0,061
C V
0,47% 0,2% 0,3% 0,48% 0,15%
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm HKG 406 là = 33,842
Độ lệch chuẩn: = 0,162
Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm lỗ là = 137,752
Độ lệch chuẩn: = 0,281 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm HKG 401 là = 106,572
Độ lệch chuẩn: = 0,318 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm TH04 là = 45,375
Độ lệch chuẩn: = 0,218 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm 01 là = 40,246
Độ lệch chuẩn: = 0,061 Hệ số biến thiên:
Nhận xét: Theo AOAC độ lặp lại của phương pháp CV nằm trong khoảng ±1,67%. Độ lặp lại của các mẫu nấm đều cao đáp ứng được yêu cầu định lượng.
3.2.4.2. Xác định độ thu hồi
Độ thu hồi được tính theo công thức sau: Trong đó: R% là độ thu hồi, %
Cm+c là nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm là nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
