Hình 3.8: Sắc đồ mẫu nấm HKG 406
Hình 3.10: Sắc đồ mẫu nấm TH04 3.2. Nghiên cứu định lượng vitamin C
3.2.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin C
Tiến hành xây dựng đường chuẩn như sau: dung dịch chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm; 10ppm; 20ppm và 50ppm.
Hình 3.11: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm
Hình 3.12: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 10ppm
Hình 3.14: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 50ppm
Kết quả thu được ở bảng 3.6.
Bảng 3.6: Diện tích của vitamin C tương ứng với từng nồng độ chuẩn TT Nồng độ chuẩn ppm Diện tích pic
3 5 78,061
1 10 160,626
4 20 346,783
2 50 898,867
Từ kết quả đã xác định được ở bảng 3.6, vẽ đồ thị sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ ta có đường chuẩn của vitamin C như sau:
Phương trình đường chuẩn vitamin C có dạng: Y= 18,1277 x -11,3043 Hệ số tương quan R2 = 0,9997
Hình 3.15: Đường chuẩn vitamin C
3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tích
3.2.2.1. Giới hạn phát hiện LOD
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tính hiệu đo.
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu a là độ dốc của đường chuẩn
Chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm; 10ppm; 20ppm và 50ppm qua 4 lần đo và lặp lại 3 lần được thể hiện qua bảng 3.7.
Bảng 3.7: Nồng độ chuẩn của vitamin C qua 3 lần đo Nồng độ chuẩn ppm Diện tích pic SD SDtb Lần 1 Lần 2 Lần 3 5 78,061 78,428 78,260 0,184 0,175 10 160,626 160,840 160,424 0,208 20 346,783 346,903 346,532 0,189 50 898,867 898,690 898,915 0,118
Giá trị LOD của chuẩn vitamin C:
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết qủa có độ chụm mong muốn.
Do đó, giới hạn định lượng của chuẩn vitamin C qua 4 lần đo và được lặp lại 3 lần với các nồng độ khác nhau 5ppm; 10ppm; 20ppm và 50ppm là 0,097 ppm.
3.2.3. Xác định hàm lượng vitamin C trong nấm
Qua số liệu LOD và LOQ ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát hiện và khoảng giới hạn định lượng rất nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, có thể phát hiện được hàm lượng vitamin C dưới dạng vết có trong mẫu phân tích.
Hàm lượng vitamin C (ppm) có trong mẫu nấm được tính theo công thức sau:
Trong đó: C là hàm lượng vitamin C có trong mẫu, tính theo ppm. Co là hàm lượng vitamin C có trong dịch chiết thông qua đường chuẩn, mmg/l.
f là hệ số pha loãng (nếu có) m là khối lượng mẫu thử (g)
Vdm là thể tích bình định mức mẫu (ml)
Ta có bảng kết quả phân tích hàm lượng vitamin C trong các mẫu nấm
Bảng 3.8: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin C trong nấm Mẫu Co (ppm) Khối lượng
mẫu (g) Thể tích mẫu (ml) Diện tích pic C ( ppm) Nấm 01 16,091 10 25 290,563 40,228 Nấm lỗ 55,109 10 25 987,699 137,773 HKG 406 13,524 10 25 233,851 33,810 HKG 401 42,625 10 25 761,399 106,563 TH 04 18,157 10 25 317,846 45,393
3.2.4. Đánh giá phương pháp
3.2.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp
Theo lý thuyết thống kê, các đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại là độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo các công thức sau:
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn n là số lần thí nghiệm
Xi là giá trị tính được của lần thực hiện thứ i là giá trị trung bình của các lần thực hiện
Thực hiện phân tích 10g nấm, tiến hành phân tích lặp lại 3 lần trong cùng một điều kiện. Kết quả phân tích lặp lại 3 lần và độ lặp lại của phương pháp được nêu ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các mẫu nấm TT HKG 406 Nấm lỗ HKG 401 TH 04 Nấm 01 Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Th ể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ 1 10 33,810 10 137,773 10 106,563 10 45,39 3 10 40,228 2 10 33,698 10 137,461 10 106,259 10 45,14 7 10 40,196 3 10 34,018 10 138,02 1 10 106,895 10 45,58 2 10 40,314 33,842 137,752 106,572 45,374 40,246 SD 0,162 0,281 0,318 0,218 0,061
C V
0,47% 0,2% 0,3% 0,48% 0,15%
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm HKG 406 là = 33,842
Độ lệch chuẩn: = 0,162 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm lỗ là = 137,752
Độ lệch chuẩn: = 0,281 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm HKG 401 là = 106,572
Độ lệch chuẩn: = 0,318 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm TH04 là = 45,375
Độ lệch chuẩn: = 0,218 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm 01 là = 40,246
Độ lệch chuẩn: = 0,061 Hệ số biến thiên:
Nhận xét: Theo AOAC độ lặp lại của phương pháp CV nằm trong khoảng ±1,67%. Độ lặp lại của các mẫu nấm đều cao đáp ứng được yêu cầu định lượng.
3.2.4.2. Xác định độ thu hồi
Độ thu hồi được tính theo công thức sau: Trong đó: R% là độ thu hồi, %
Cm+c là nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm là nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Cc là nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Ta có bảng kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ
Bảng 3.10. Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm 01
TT Nồng độ (ppm) Cm+c - Cm Cc (ppm) %R
Cm+c Cm
1 88,937 40,227 48,71 47,6 102,33%
2 88,926 40,196 48,73 47,6 102,37%
3 89,064 40,314 48,75 47,6 102,42%
Từ bảng kết quả trên ta có giá trị trung bình %R của mẫu nấm 01 là: = 102,37%
Độ lệch chuẩn = 0,04 Hệ số biến thiên: = 0,039%
Nhận xét: Dựa vào kết quả đã tính được ta thấy độ thu hồi của 3 phép đo lặp lại lớn đều trên 102% nằm trong giới hạn cho phép của AOAC (91-108). Điều này chứng tỏ rằng phương pháp phân tích hàm lượng vitamin C trong nấm có độ chính xác cao. Đáp ứng được nhu cầu phân tích.
Hình 3.16: Sắc đồ của nấm HKG 406
Hình 3.18: Sắc đồ của nấm 01 thêm chuẩn
Hình 3.20: Sắc đồ của nấm lỗ 3.3. Nghiên cứu định lượng vitamin E
3.3.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin E
Tiến hành xây dựng đường chuẩn như sau: dung dịch chuẩn vitamin E có nồng độ 2ppm; 4ppm; 10ppm; 20ppm và 40ppm.
Hình 3.22: Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E có nồng độ 10ppm
Hình 3.24: Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E có nồng độ 40ppm
Kết quả thu được ở bảng 3.11.
Bảng 3.11: Diện tích của vitamin E tương ứng với từng nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn Diện tích pic
2 97,936
4 121,699
10 357,460
20 969,863
40 1924,540
Từ kết quả đã xác định được ở bảng 3.11, vẽ đồ thị sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ ta có đường chuẩn của vitamin E như sau:
Phương trình đường chuẩn vitamin E có dạng: Y= 48,9606 x - 41,5855 Hệ số tương quan R2 = 0,9975
Hình 3.25: Đường chuẩn vitamin E
3.3.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương phápphân tích phân tích
3.3.2.1. Giới hạn phát hiện LOD
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tính hiệu đo.
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu a là độ dốc của đường chuẩn
Giá trị LOD của phương pháp qua 5 lần đo và được lặp lại 3 lần ở các nồng độ khác nhau 2ppm; 4ppm; 10ppm; 20ppm và 40ppm được thể hiện qua bảng 3.12.
Nồng độ chuẩn ppm Diện tích pic SD SDtb Lần 1 Lần 2 Lần 3 2 97,936 97,815 98,018 0,102 0,078 4 121,699 121,584 121,699 0,066 10 357,460 357,531 357,459 0,042 20 969,863 969,705 969,865 0,092 40 1924,540 1924,690 1924,538 0,087
Giá trị LOD của chuẩn vitamin E:
3.3.2.2. Giới hạn định lượng LOQ
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết qủa có độ chụm mong muốn.
Do đó, giới hạn định lượng của chuẩn vitamin E qua 5 lần đo và được lặp lại 3 lần với các nồng độ khác nhau 2ppm; 4ppm; 10ppm; 20ppm và 40ppm là 0,016ppm.
3.3.3. Xác định hàm lượng vitamin E trong nấm
Qua số liệu LOD và LOQ ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát hiện và khoảng giới hạn định lượng rất nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, có thể phát hiện được hàm lượng vitamin E dưới dạng vết có trong mẫu phân tích.
Hàm lượng vitamin E (ppm) có trong mẫu nấm được tính theo công thức sau:
Trong đó: C là hàm lượng vitamin E có trong mẫu, tính theo ppm. Co là hàm lượng vitamin E có trong dịch chiết thông qua đường chuẩn, mg/l.
m là khối lượng mẫu thử (g)
Vdm là thể tích bình định mức mẫu (ml)
Ta có bảng kết quả phân tích hàm lượng vitamin E trong các mẫu nấm
Bảng 3.13: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin E trong nấm Mẫu Co (ppm) Khối lượng
mẫu (g) Thể tích mẫu (ml) Diện tích pic C (ppm) HKG 406 1,809 15 10 46,968 1,206 Nấm lỗ 34,896 15 10 1673,659 23,264 HKG 401 40,736 15 10 1952,864 27,157 TH 04 5,873 15 10 245,967 3,915 01 92,500 15 10 4487,170 61,667 3.3.4. Đánh giá phương pháp
3.3.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp
Thực hiện phân tích 15g nấm, tiến hành phân tích lặp lại 3 lần trong cùng một điều kiện. Kết quả phân tích lặp lại 3 lần và độ lặp lại của phương pháp được nêu ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các mẫu nấm TT HKG 406 Nấm lỗ HKG 401 TH 04 01 Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ 1 10 1,206 10 23,264 10 27,157 10 3,915 10 61,667 2 10 1,226 10 23,204 10 27,196 10 3,875 10 61,695
3 10 1,186 10 23,297 10 27,118 10 3,966 10 61,608
1,206 23,255 27,157 3,919 61,657
SD 0,02 0,047 0,039 0,045 0,044
CV 1,66% 0,2% 0,14% 1,17% 0,07%
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E trong mẫu nấm HKG 406 là = 1,206
Độ lệch chuẩn: = 0,02 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E trong mẫu nấm lỗ là = 23,255
Độ lệch chuẩn: = 0,047 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E trong mẫu nấm HKG 401 là = 27,157
Độ lệch chuẩn: = 0,039 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E trong mẫu nấm TH04 là = 3,919
Độ lệch chuẩn: = 0,046 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E trong mẫu nấm HKG 01 là = 61,657
Độ lệch chuẩn: = 0,044 Hệ số biến thiên:
Nhận xét: Theo AOAC hệ số biến thiên CV của phép đo nằm trong
khoảng ±10,5%. Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao đáp ứng
được yêu cầu định lượng.
Độ thu hồi được tính theo công thức sau: Trong đó: R% là độ thu hồi, %
Cm+c là nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm là nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Cc là nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Ta có bảng kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ
Bảng 3.15. Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ
TT Nồng độ (ppm) Cm+c - Cm Cc (ppm) %R
Cm+c Cm
1 27,115 23,264 3,851 4 96,28%
2 27,118 23,264 3,854 4 96,33%
3 27,120 23,2672 3,853 4 96,33%
Từ bảng kết quả trên ta có giá trị trung bình %R của mẫu nấm lỗ là: = 96,31%
Độ lệch chuẩn = 0,03 Hệ số biến thiên: = 0,03%
Nhận xét: Dựa vào kết quả đã tính được ta thấy độ thu hồi của 3 phép đo lặp lại trên 96% nằm trong giới hạn cho phép của AOAC (96 - 108%) . Điều này chứng tỏ rằng phương pháp phân tích hàm lượng vitamin E trong nấm có độ chính xác cao. Đáp ứng được nhu cầu phân tích.
Hình 3.26: Sắc đồ mẫu nấm 01
Hình 3.28: Sắc đồ mẫu nấm lỗ không thêm chuẩn
KẾT LUẬN
Trên cơ sở các nhiệm vụ đã đặt ra và những kết quả đã đạt được chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Đã khảo sát và xác định khoảng tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của vitamin B2 là 0,1-50ppm, vitamin C là 5-50ppm và vitamin E là 2-40ppm. 2. Đã xây dựng phương trình đường chuẩn đầy đủ thể hiện mối quan hệ giữa
diện tích pic và nồng độ của vitamin B2, vitamin C và vitamin E.
3. Đã đánh giá LOD, LOQ cho thấy đủ tiêu chuẩn xác định lượng vết các vitamin với độ lặp lại tốt và giới hạn phát hiện bé.
Vitamin B2 có giới hạn phát hiện LOD là 0,003; giới hạn định lượng LOQ là 0,009. Vitamin C có giới hạn phát hiện LOD là 0,032; giới hạn định lượng LOQ là 0,097. Vitamin E có giới hạn phát hiện LOD là 0,0053; giới hạn định lượng LOQ là 0,016.
4. Đã áp dụng kết quả nghiên cứu để xác định ba loại vitamin B2, vitamin C và vitamin E trong nấm cho kết quả như sau:
+ Hàm lượng vitamin B2 đã xác định được trong các nấm HKG 406 là 1,135ppm; nấm lỗ là 1,060ppm; nấm HKG 401 là 1,590ppm; nấm TH 04 là 0,525ppm và nấm 01 là 0,750ppm.
+ Hàm lượng vitamin C đã xác định được trong các nấm HKG 406 là 3,3810ppm; nấm lỗ là 137,773ppm; nấm HKG 401 là 106,563ppm; nấm TH 04 là 45,393ppm và nấm 01 là 40,228ppm.
+ Hàm lượng vitamin E đã xác định được trong các nấm HKG 406 là 1,206ppm; nấm lỗ là 23,264ppm; nấm HKG 401 là 27,157ppm; nấm TH 04 là 3,915ppm và nấm 01 là 61,667ppm.
Từ các kết quả thu được tôi thấy có thể áp dụng phương pháp phân tích hàm lượng vitamin B2, C và E trong các mẫu nấm với độ tin cậy cao và đề nghị được áp dụng phương pháp phân tích vitamin B2, vitamin C và vitamin E cho nhiều đối tượng thực phẩm khác. Đây là một phương pháp có nhiều ưu điểm trong phân tích các vitamin B2, vitamin C và vitamin E. Nếu có thể, chúng tôi mong muốn được tiếp tục nghiên cứu để hoàn chỉnh và mở rộng trong những đề tài khác, tiếp tục đánh các kết quả để có thể so sánh được hàm lượng vitamin trong những loài nấm khác nhau từ đó đánh giá được giá trị của các loài nấm và bổ sung số liệu vào bảng thành phần thực phẩm Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1 Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn Quốc gia, Trung tâm khuyến nông Quốc gia (2008), Nấm ăn cơ sở khoa học và công nghệ nuôi trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
2 Hoàng Minh Châu (2001), Hóa phân tích, NXB Giáo dục.
3 Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mạc, Từ Vọng Nghi (2002), Cơ sở phân tích
hóa học hiện đại, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
4 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1999), Hóa sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
5 Nguyễn Tinh Dung (2000), Hóa học phân tích, các phương pháp phân tích định lượng hóa học, NXB Giáo dục.
6 Nguyễn Bá Hai (2009), Bài giảng kỹ thuật trồng nấm, Trường ĐH Nông lâm Huế.
7 Trần Tứ Hiếu (2000), Hóa học phân tích, NXB Đại học quốc gia Hà Nội. 8 Trần Tứ Hiếu, Đặng Ứng Vận, Mai Xuân Trường (2007), Phương pháp
trắc quang định lượng đồng thời các vitamin B1, B2, B3, B6, B12 và vitamin PP trong hỗn hợp theo phương pháp lọc KALMAN, Tạp chí phân tích hóa lý và sinh học, tập 12 (2), p.21-24.
9 Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam tập I, NXB Khoa học tự
