a. Phương pháp đường chuẩn
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào phương trình cơ bản của phép đo A = k.C và một dãy mẫu đầu (ít nhất 3 mẫu đầu) để dựng một đường chuẩn, sau đó nhờ vào đường chuẩn này và giá trị Ax để xác định nồng độ Cx của chất cần phân tích trong mẫu đo sắc ký, rồi từ đó tính được nồng độ của nó trong mẫu phân tích.
Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy mẫu đầu có nồng độ của chất X cần xác định là C1, C2, C3, C4, C5 và các mẫu phân tích có nồng độ Cx1, Cx2... Sau đó chọn các điều kiện phù hợp và đo nồng độ của chất cần phân tích trong tất cả các mẫu đầu và mẫu phân tích ta thu được các giá trị tương ứng A1, A2, A3, Ax1, Ax2... và lập đồ thị chuẩn A=f(C).
Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và rất thích hợp với việc phân tích hàng loạt mẫu của cùng một chất. Song, trong nhiều trường hợp chúng ta không thể chuẩn bị được một dãy mẫu đầu thỏa mãn các điều kiện đã quy định
cho phương pháp này cho nên không thể xác định được vị trí chính xác của đường chuẩn. Nghĩa là khi mẫu phân tích có thành phần phức tạp và chúng ta chưa biết chính xác thì không thể chuẩn bị được một dãy mẫu đầu đúng nên sẽ bị ảnh hưởng của nền, thành phần của mẫu [10].
b. Phương pháp nội chuẩn [22]
Người ta thêm vào mẫu (có khối lượng cố định là E) một lượng xác định mr của chất đã được chọn làm chất nội chuẩn.
Chất nội chuẩn có thể là một chất lạ hoặc cũng có thể là một cấu tử nào đó có sẵn trên sắc đồ. Nếu là chất lạ thì thời gian lưu của nó phải gần thời gian lưu của cấu tử cần được phân tích định lượng. Hàm lượng của cấu tử cần xác định đó được tính như sau:
Trong trường hợp sắc đồ không còn chỗ hở cho việc đưa thêm chất nội chuẩn vào nữa, người ta áp dụng phương pháp nội chuẩn, tức là chuẩn bằng chính cấu tử cần xác định. Người ta thêm vào hỗn hợp mẫu (có khối lượng ban đầu E) một lượng cấu tử i đã biết là miz. Sau đó người ta so sánh pic của cấu tử I đó giữa hai sắc đồ trước và sau khi cho thêm chất nội chuẩn (Ai1 và Ai2). Mặt khác người ta cũng so sánh sự thay đổi của một diện tích pic của cấu tử x khác (Ax1 và Ax2).
Hàm lượng phần trăm khối lượng của cấu tử i cần xác định sẽ là:
Trong trường hợp này người ta không cần đến hệ số f nữa và đồng thời cũng không nhất thiết phải có kỹ thuật bơm lặp lại như phương pháp ngoại chuẩn. Phương pháp này còn gọi là phương pháp thêm
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Trang thiết bị và dụng cụ
- Cân phân tích độ chính xác ±0,001g. - Bếp cách thủy. - Máy đo pH. - Máy li tâm. - Ống ly tâm 50ml. - Máy lắc vortex. - Bình nón 250ml. - Bình định mức 100ml, 200ml. - Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45µm. - Pipet 5ml, 10ml, 20ml. - Micropipet. - Vial đựng mẫu. - Bộ lọc dung môi. 2.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng là loại tinh khiết PA
- Dung dịch vitamin B2 chuẩn gốc 100ppm.
- Dung dịch chuẩn làm việc vitamin B2 nồng độ lần lượt là 0,1ppm; 0,2ppm; 0,5ppm; 10ppm; 20ppm; 50ppm.
- Dung dịch chuẩn vitamin C (Merk)
- Dung dịch chuẩn làm việc vitamin C có nồng độ lần lượt là 5ppm, 10ppm, 20ppm và 50ppm.
- Dung dịch chuẩn gốc vitamin E.
- dung dịch chuẩn làm việc vitamin E có nồng độ lần lượt là 4ppm, 10ppm, 20ppm và 40ppm.
- Dung dịch axit clohidric 1N. - Dung dịch natri axetat 0,05M. - Dung môi methanol (Merk).
- Men amilase. - Axit axetic (Merk). - Axit photphoric (Merk) - Đietylete - Etanol - Kalihydroxyt - Na2SO4 khan - n –Hexan (Merk). - 1,4 đioxan 2.3. Thực nghiệm 2.3.1. Hình mẫu
Các mẫu nấm được lấy ở vùng Bắc Trung Bộ và nuôi cấy tại phòng thí nghiệm vi sinh của trường Đại học Vinh.
- Mẫu nấm 01 (Ganoderma lucidum)
- Mẫu nấm lỗ (Hexagonia apiaria)
- Mẫu nấm HKG 406 (Amauroderma schmburgkii) - Mẫu nấm TH04 (Ganoderma nigrolucidum) - Mẫu nấm HKG 401 (Ganoderma pfleifferi)
Hình 2.4: Nấm HKG406 Hình 2.5: Nấm HKG 401
2.3.2. Vitamin B2
2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin B2 cho phép đo HPLC
- Dung dịch chuẩn 100ppm: Cân chính xác 0,0250g chuẩn vitamin B2 dạng riboflavin cho vào bình định mức 250ml, hòa tan và định mức tới vạch bằng nước cất.
- Dung dịch chuẩn làm việc: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ lần lượt là 0,1ppm; 0,2ppm; 0,5ppm; 10ppm; 20ppm; 50ppm.
Cân 10g mẫu
Cho vào bình 250ml Thêm 30ml HCl
Thủy phân trong 1 giờ ở 100oC
Lấy ra, để nguội, điều chỉnh pH = 4,5 bằng CH3COONa
Ủ ở 37oC trong 18 giờ
0,1g men amilaze
Định mức vào bình 50ml. Lọc qua giấy lọc và màng lọc 0,45µm
Cho vào vial và phân tích trên máy HPLC
2.3.2.3. Cách tiến hành
Cân chính xác 10g mẫu cho vào bình nón 250ml. Thêm vào mỗi bình 30ml HCl 0,1N. Sau đó đem thủy phân trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ. Lấy ra để nguội và điều chỉnh pH của dung dịch thủy phân đến pH = 4,5 bằng dung dịch natri axetat 2,5M. Thêm vào mỗi bình 0,1g men amilase. Rồi đặt vào tủ ủ ấm ở 37oC trong 18 giờ. Định mức dung dịch đến 50ml bằng nước cất và lọc. Dịch lọc mẫu và chuẩn được bơm vào máy HPLC.
2.3.2.4. Điều kiện sắc ký
- Chạy sắc ký với detector FLD bước sóng kích thích 422nm và bước sóng phát xạ 522nm.
- Dung môi pha động: CH3COONa 0,05M: MeOH = 70:30(V/V) - Cột sắc ký pha ngược C18.
-Tốc độ dòng 1ml/phút. - Nhiệt độ phòng.
2.3.3. Vitamin C
2.3.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin C cho phép đo HPLC
- Dung dịch chuẩn gốc 1000µg/ml (ppm): Cân chính xác 10mg axit ascorbic vào bình định mức 10ml. Hòa và định mức đến vạch bằng axit photphoric pH = 3 ta thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 1000µg/ml.
- Dung dịch chuẩn trung gian 100µg/ml (ppm): Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc 1000ppm cho vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng dung môi pha động.
- Dung dịch chuẩn làm việc: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 5ppm; 10ppm; 20ppm và 50ppm.
Cân 10g mẫu
Cho mẫu vào ống ly tâm, lắc đều 5 phút bằng máy vortex
Siêu âm mẫu 10 phút, lắc đều 5 phút (5000 vòng/phút)
Định mức vào bình 25ml, lọc qua giấy lọc và màng lọc 0,45µm
Cho vào vial và đem phân tích trên máy HPLC
Cho vào bình định mức 25ml, lặp lại quá trình trên với 10ml axit photphoric pH=3
2.3.3.2. Sơ đồ xử lý mẫu vitamin C
2.3.3.3. Cách tiến hành
Cân chính xác 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml. Thêm 15ml dung dịch axit photphoric pH = 3 vào ống ly tâm và lắc đều 5 phút bằng máy lắc Vortex. Siêu âm 10 phút và ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút trong 5 phút. Gạn dịch trong ở trên vào bình định mức 25ml. Lặp lại quá trình trên với 10ml dung dịch axit photphoric pH = 3. Lấy lớp dịch vào bình định mức 25ml Thêm 15ml axit photphoric pH=3
ở trên, và định mức đến vạch. Lọc dịch qua giấy lọc và màng lọc 0,45µm. Cho dịch vào vail và đem vào máy phân tích HPLC.
2.3.3.4. Điều kiện sắc ký
- Chạy sắc ký với detector UV – VIS bước sóng 254nm.
- Dung môi pha động: MeOH/ axit photphoric (pH =3) = 60:40(V/V) - Cột sắc ký pha ngược RP-18.
-Tốc độ dòng 0,7ml/phút. - Nhiệt độ 30oC
2.3.4. Vitamin E
2.3.4.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin E cho phép đo HPLC
- Dung dịch chuẩn gốc 400ppm: Cân 40mg (±0,1mg) chất chuẩn α- tocopherol ≥ 96% (M(C29H50O2) = 430,7g/mol) vào bình định mức 100ml, hòa tan và định mức đến vạch bằng pha động.
- Dung dịch chuẩn làm việc của vitamin E: Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ lần lượt là 2ppm; 4ppm; 10ppm; 20ppm và 40ppm.
Cân 15g mẫu nấm
40ml etanol, 3g KOH và 1g axit ascorbic
Xà phòng hóa ở 100oC, 30 phútChuyển sang bình tam giác, tráng bằng nước cất và cho vào phễu chiết
Chiết 3 lần với đietylete (30ml/lần), lắc 30 phút, để yên 30 phút, chiết Loại bỏ dung dịch phần dưới
Giữ lại dung dịch phía trên Lọc qua phễu có Na2SO4 khan
Cất quay chân không đến cô cạn
Dung dịch Màng lọc Mẫu bơm vào HPLC
Rửa bằng 10ml pha động
2.3.4.2. Sơ đồ xử lý mẫu vitamin E
2.3.4.3. Cách tiến hành
- Cân khoảng 15g nấm đã được nghiền nhỏ cho vào bình cầu thủy tinh có cổ nhám và tiến hành xà phòng hóa.
- Vitamin E từ dung dịch đã xà phòng hóa được lọc qua giấy lọc rồi chiết 3 lần bằng đietylete, mỗi lần 30ml, lắc 30 phút để yên 30 phút rồi chiết lấy phần trên, bỏ phần dưới.
- Tập trung lớp ete chiết được vào một bình chiết.
- Loại nước còn sót trong dịch chiết ete bằng cách lọc qua lớp dày Na2SO4 khan.
- Gộp tất cả lớp ete vào bình quả lê. Cô quay đến cạn. Cặn còn lại hòa tan trong 10ml pha động.
- Lọc dịch đục qua màng lọc 13mm, 0,45µm và thu dịch lọc và tiến hành phân tích trên máy HPLC.
2.3.4.4. Điều kiện sắc ký
- Chạy sắc ký với detector FLD (huỳnh quang) bước sóng kích thích 254nm, bước sóng phát xạ 330nm.
- Cột sắc ký: Cột sắc ký pha đảo RP-18 - Tốc độ dòng: 0,5ml/ phút
- Pha động: 1,4 đioxan: n-hexan = 1,2: 98,8 - Nhiệt độ lò cột: 30oC
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu định lượng vitamin B2
3.1.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin B2
Tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn như sau: dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1ppm; 0,2ppm; 0,5ppm; 10ppm; 20ppm; 50ppm.
Hình 3.1: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 0,1ppm
Hình 3.3: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 0,5ppm
Hình 3.5: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 20ppm
Kết quả thu được ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Diện tích của vitamin B2 tương ứng với từng nồng độ chuẩn TT Nồng độ chuẩn ppm Diện tích pic
1 0,1 11,643 4 0,2 23,113 2 0,5 57,824 3 10 1160,964 5 20 2482,087 6 50 5909,919
Từ kết quả đã xác định được ở bảng 3.1, vẽ đồ thị sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ ta có đường chuẩn của vitamin B2 như sau:
Phương trình đường chuẩn vitamin B2 có dạng: Y= 122,9877 x -7,7537 Hệ số tương quan R2 = 0,9995
Hình 3.7: Đường chuẩn vitamin B2
3.1.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương phápphân tích phân tích
3.1.2.1. Giới hạn phát hiện LOD
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiên được nhưng chưa thể định lượng được.
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tính hiệu đo.
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu a là độ dốc của đường chuẩn
Chuẩn vitamin B2 ở các nồng độ 0,1ppm; 0,2ppm; 0,5ppm; 10ppm; 20ppm; 50ppm qua 6 lần đo và lặp lại 3 lần được thể hiện qua bảng 3.2.
Bảng 3.2: Nồng độ chuẩn của vitamin B2 qua 3 lần đo Nồng độ chuẩn ppm Diện tích pic SD SDtb Lần 1 Lần 2 Lần 3 0,1 11,643 11,543 11,716 0,087 0,113 0,2 23,113 23,110 23,126 0,009 0,5 57,824 57,758 57,944 0,094 10 1160,964 1160,795 1161,025 0,119 20 2482,087 2482,123 2481,978 0,076 50 5909,919 5909,355 5909,764 0,291
Giá trị LOD của chuẩn vitamin B2:
3.1.2.2. Giới hạn định lượng LOQ
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết qủa có độ chụm mong muốn.
Do đó, giới hạn định lượng của chuẩn vitamin B2 qua 6 lần đo và được lặp lại 3 lần với các nồng độ khác nhau 0,1ppm; 0,2ppm; 0,5ppm; 10ppm; 20ppm; 50ppm là 0,009ppm.
3.1.3. Xác định hàm lượng vitamin B2 trong nấm
Qua số liệu LOD và LOQ ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát hiện và khoảng giới hạn định lượng rất nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, có thể phát hiện được hàm lượng vitamin B2 dưới dạng vết có trong mẫu phân tích.
Hàm lượng vitamin B2 (ppm) có trong mẫu nấm được tính theo công thức sau:
Trong đó: C là hàm lượng vitamin B2 có trong mẫu, tính theo ppm Co là hàm lượng vitamin B2 có trong dịch chiết thông qua đường chuẩn, ppm.
f là hệ số pha loãng (nếu có) m là khối lượng mẫu thử (g)
Vdm là thể tích bình định mức mẫu (ml)
Ta có bảng kết quả phân tích hàm lượng vitamin B2 trong các mẫu nấm
Bảng 3.3: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin B2 trong nấm Mẫu Co (ppm) Khối lượng
mẫu (g) Thể tích mẫu (ml) Diện tích pic C (ppm) HKG 406 0,227 10 50 20,218 1,135 Nấm lỗ 0,212 10 50 18,288 1,060 HKG 401 0,518 10 50 55,899 2,590
TH 04 0,105 10 50 5,108 0,525
01 0,150 10 50 10,701 0,750
3.1.4. Đánh giá phương pháp
3.1.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp
Theo lý thuyết thống kê, các đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại là độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo các công thức sau:
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn n là số lần thí nghiệm
Xi là giá trị tính được của lần thực hiện thứ i là giá trị trung bình của các lần thực hiện
Thực hiện phân tích 10g nấm, tiến hành phân tích lặp lại 3 lần trong cùng một điều kiện. Kết quả phân tích lặp lại 3 lần và độ lặp lại của phương pháp được nêu ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các mẫu nấm TT HKG 406 Nấm lỗ HKG 401 TH 04 01 Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ 1 10 1,135 10 1,060 10 2,590 10 0,525 10 0,750 2 10 1,124 10 1,041 10 2,308 10 0,507 10 0,772 3 10 1,106 10 1,063 10 2,272 10 0,549 10 0,731 1,122 1,055 2,390 0,527 0,751 SD 0,015 0,011 0,174 0,02 0,02 CV 1,34% 1,04% 7,28% 3,80% 2,66%
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 trong mẫu nấm HKG 406 là = 1,1223
Độ lệch chuẩn: = 0,015 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 trong mẫu nấm lỗ là = 1,055
Độ lệch chuẩn: = 0,012 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 trong mẫu nấm HKG 401 là = 2,39
Độ lệch chuẩn: = 0,174 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 trong mẫu nấm TH 04 là = 0,527
Độ lệch chuẩn: = 0,02 Hệ số biến thiên:
- Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 trong mẫu nấm 01 là = 0,751
Độ lệch chuẩn: = 0,02 Hệ số biến thiên:
Nhận xét: Theo AOAC hệ số biến thiên CV của phép đo nằm trong khoảng ±10,5%. Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao đáp ứng được yêu cầu định lượng.
3.1.4.2. Xác định độ thu hồi
Trong đó: R% là độ thu hồi, %
Cm+c là nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm là nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Cc là nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Ta có bảng kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ
Bảng 3.5. Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ
TT CNồng độ (ppm) Cm+c - Cm Cc (ppm) %R
m+c Cm
1 2,037 1,059 0,978 1 97,8%
2 2,013 1,041 0,972 1 97,2%