Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LIÊN XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LIÊN XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Nguyên Hà PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực luận văn này, may mắn nhận giúp đỡ tận tình thầy giáo, chun gia, nghiên cứu viên, anh chị kỹ thuật viên tình cảm khích lệ mà gia đình bạn bè dành cho tơi Tơi xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Nguyên Hà PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo giao đề tài, tâm huyết tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt thời gian thực hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành tới TS Trần Cao Sơn cho lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian tạo điều kiện tối đa giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Cao Công Khánh anh chị, bạn khoa Nghiên cứu thực phẩm, khoa Độc học & dị nguyên, khoa Chất lượng, phụ gia chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện nhiệt tình giúp đỡ tơi thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học, mơn Hóa phân tích – trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô giảng dạy giúp đỡ q trình học tập trường Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè – người đồng hành thiếu học tập sống động viên khích lệ tơi ngày qua Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 03 năm 2018 Học viên Lê Thị Liên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan trinh nữ hoàng cung 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Nguồn gốc phân bố, phận sử dụng 1.1.3 Thành phần hóa học Crinum latifolium L 1.1.4 Tác dụng sinh học 1.2 Tổng quan crinamidin 1.3 Một số nghiên cứu xác định crinamidin PHẦN ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 15 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 15 2.2.1 Chất chuẩn 15 2.2.2 Hóa chất, dung mơi 16 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 16 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng crinamidin thuốc TPBVSK 17 2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng crinamidin kỹ thuật GC-MS/MS 19 2.4 Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin thuốc TPBVSK 21 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 21 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1 Xây dựng phƣơng pháp phân tích 22 3.1.1 Kết khảo sát điều kiện tối ưu cho phương pháp định lượng crinamidin GC-MS/MS 22 3.1.2 Kết khảo sát trình xử lý mẫu cho phương pháp định lượng crinamidin GC-MS/MS 29 3.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 39 3.2.1 Tính thích hợp hệ thống 39 3.2.2 Tính đặc hiệu, chọn lọc 40 3.2.3 Khoảng tuyến tính 44 3.2.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 45 3.2.5 Độ lặp lại 46 3.2.6 Độ thu hồi 48 3.3 So sánh phƣơng pháp xây dựng với phƣơng pháp tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV 52 3.3.2 So sánh giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) hai phương pháp 54 3.3.3 So sánh hiệu suất quy trình chiết mẫu TNHC hai phương pháp 55 3.4 Kết xác định hàm lƣợng crinamidin số mẫu thuốc TPBVSK 57 PHẦN BÀN LUẬN 61 4.1 Về phƣơng pháp chiết xuất crinamidin từ chế phẩm chứa TNHC 61 4.2 Về xác định hàm lƣợng crinamidin GC-MS/MS 61 4.3 Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin mẫu thực 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 Kết luận 64 Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Việt (tiếng Anh) ACN Acetonitril AOAC Hiệp hội cộng đồng phân tích thức (Association of Official Analytical Communities) CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis) CHCl3 Cloroform DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV EI Bắn phá electron (Electron ionization) GC Sắc ký khí (Gas Chromatography) HCl Acid hydrocloric H3PO4 Acid phosphoric HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantification) MEKC Sắc ký điện động micell (Micellar electrokinetic chromatography) MeOH Methanol m/z Tỷ số khối lượng điện tích ion (Mass-to-charge ratio) MRM Giám sát đa phản ứng (Multiple reaction monitoring) MS Khối phổ (Mass Spectrometry) NH3 Amoniac NXB Nhà xuất PDA Dãy diod quang (Photodiode array) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) SFE Chiết lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction) tR Thời gian lưu TNHC Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe UV-VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tính chất lý hóa tác dụng sinh học crinamidin Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định crinamidin nhận xét Bảng 3.1: Các mảnh ion mẹ ion crinamidin sau bắn phá 23 Bảng 3.2: Các mảnh ion mẹ ion cafein sau bắn phá 23 Bảng 3.3: Điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS .28 Bảng 3.4: Khảo sát quy trình xử lý mẫu 29 Bảng 3.5: Kết khảo sát quy trình xử lý mẫu .30 Bảng 3.6: Kết khảo sát số lần chiết mẫu 33 Bảng 3.7: Kết khảo sát thời gian chiết mẫu .35 Bảng 3.8: Kết khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 37 Bảng 3.9: Thời gian lưu diện tích pic qua lần tiêm mẫu 40 Bảng 3.10: Tỷ lệ ion crinamidin dung dịch thêm chuẩn crinamidin 43 Bảng 3.11: Phương trình đường chuẩn crinamidin hệ số tương quan tuyến tính 44 Bảng 3.12: Giá trị LOD LOQ crinamidin .45 Bảng 3.13: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp viên nang cứng 46 Bảng 3.14: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp trà túi lọc 47 Bảng 3.15: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp cao lỏng 47 Bảng 3.16: Kết độ thu hồi crinamidin viên nang cứng 49 Bảng 3.17: Kết độ thu hồi crinamidin trà túi lọc 50 Bảng 3.18: Kết độ thu hồi crinamidin cao lỏng 51 Bảng 3.19: Quy trình xử lý mẫu điều kiện sắc ký phương pháp tiêu chuẩn phương pháp xây dựng 52 Bảng 3.20: Giá trị LOD LOQ crinamidin .54 Bảng 3.21: Kết phân tích hàm lượng crinamidin mẫu chuẩn thử phương pháp tiêu chuẩn phương pháp xây dựng 56 Bảng 3.22: Kết xác định hàm lượng crinamidin từ mẫu thuốc TPBVSK 58 Bảng 3.23: Kết xác định hàm lượng crinamidin từ mẫu cao trà túi lọc.59 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cây trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.) Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo crinamidin Hình 2.1: Hệ thống sắc ký khí khổi phổ lần (GC-MS/MS) 18 Hình 3.1: Phổ khối crinamidin sau bắn phá ion 23 Hình 3.2: Phổ khối cafein sau bắn phá ion 23 Hình 3.3: Sắc ký đồ tổng (TIC) crinamidin chuẩn nội cafein .24 Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL dung mơi MeOH 25 Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL dung mơi ACN 25 Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn crinamidin 20 µg/mL chế độ tiêm khơng chia dòng 26 Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chương trình nhiệt độ (*) 27 Hình 3.8: Sắc đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL dung mơi CHCl3, chế độ tiêm chia dòng 10 : 1, chương trình nhiệt độ (**) 27 Hình 3.9: Biểu đồ kết khảo sát quy trình xử lý mẫu ba mẫu .31 Hình 3.10: Sơ đồ quy trình chiết xuất crinamidin từ chế phẩm TNHC 32 Hình 3.11: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin số lần chiết mẫu 34 Hình 3.12: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin thời gian chiết mẫu .36 Hình 3.13: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin tỷ lệ dung môi chiết 38 Hình 3.14: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 39 Hình 3.15: Sắc ký đồ dung môi CHCl3 .41 Hình 3.16: Sắc ký đồ placebo viên nang thêm chuẩn nội cafein 41 Hình 3.17: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chuẩn nội cafein 42 Hình 3.18: Sắc ký đồ dung dịch thêm chuẩn crinamidin 42 Hình 3.19: Sắc ký đồ tỷ lệ ion crinamidin cafein dung dịch chuẩn 20 µg/mL 43 Hình 3.20: Đồ thị đường chuẩn crinamidin, chuẩn nội cafein 44 Hình 3.21: Sắc ký đồ crinamidin LOD 0,3 µg/mL 45 Hình 3.22: Sắc ký đồ độ lặp lại viên nang cứng 48 Hình 3.23: Sắc ký đồ độ lặp lại trà túi lọc 48 Hình 3.24: Sắc ký đồ độ lặp lại cao lỏng 48 Hình 3.25: Sắc ký đồ mẫu thực viên nang cứng .49 Hình 3.26: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 160 µg chuẩn crinamidin .49 Hình 3.27: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 200 µg chuẩn crinamidin .50 Hình 3.28: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 240 µg chuẩn crinamidin .50 Hình 3.29: Sắc ký đồ crinamidin LOD µg/mL (HPLC) .55 Hình 3.30: Sắc ký đồ crinamidin LOD 0,3 µg/mL (GC-MS/MS) 55 Hình 3.31: Đường chuẩn crinamidin từ 10 đến 100 µg/mL (HPLC) .57 Hình 3.32: Đường chuẩn crinamidin từ đến 50 µg/mL, chuẩn nội cafein (GC-MS/MS) 57 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với phát triển xã hội, mô hình bệnh tật ngày trở nên phức tạp Bệnh tật khơng làm rút ngắn tuổi thọ mà ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sống người Khoa học y – dược học ngày có bước tiến vượt bậc đạt nhiều thành tựu to lớn việc ngăn ngừa điều trị bệnh Sự phát triển góp phần phong phú hóa số lượng đa dạng hóa chủng loại thuốc thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) thị trường, thuốc sản phẩm có nguồn gốc thảo dược ngày tỏ ưu chiếm niềm tin người sử dụng an toàn hợp chất thiên nhiên Tại Việt Nam, với mục tiêu bảo vệ, chăm sóc nâng cao sức khỏe nhân dân, nhiều sách, chiến lược quốc gia lĩnh vực y – dược học đưa ra, bảo tồn phát triển ngành dược liệu Việt Nam định hướng quan trọng thời gian tới [6], [15] Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) loại dược liệu quý biết đến với tác dụng hỗ trợ điều trị u xơ tử cung, phì đại tuyến tiền liệt ung thư tuyến tiền liệt [10] Lá trinh nữ hoàng cung (TNHC) chứa nhiều thành phần, đáng quan tâm nhóm alkaloid có tác dụng sinh học, điển crinamidin, ambellin, lycorin, Sự diện TNHC biểu thị qua hoạt chất đặc trưng điển hình, đồng thời hoạt chất cho tác dụng sinh học crinamidin Chế phẩm chứa TNHC bán nhà thuốc, quầy thuốc, cửa hàng đơng y, chí cửa hàng tạp hóa kênh bán hàng online Mỗi chế phẩm lại có cơng thức bào chế khác nhau, từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, hệ hàm lượng crinamidin chế phẩm không Trong tiêu chuẩn cho chế phẩm chưa hoàn thiện, nhà sản xuất lợi dụng kẽ hở để trục lợi, sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu không rõ nguồn gốc đưa vào sản xuất, sử dụng ngun liệu khác thay mà khơng có tác dụng sinh học theo công bố nhãn Đây mấu chốt vấn nạn thuốc TPBVSK thật hay giả chủ đề mang tính thời sự, nhận nhiều quan tâm báo chí dư Sắc ký đồ khảo sát thời gian chiết Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi Sắc ký đồ đường chuẩn Sắc ký đồ độ lặp lại crinamidin trà túi lọc Sắc ký đồ độ lặp lại crinamidin viên nang cứng Sắc ký đồ độ lặp lại crinamidin cao lỏng 11 Sắc ký đồ độ thu hồi trà túi lọc 11 Sắc ký đồ độ thu hồi cao lỏng 12 Sắc ký đồ blank (HPLC) mAU 285nm4nm (1.00) 22.5 20.0 17.5 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 -2.5 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 13 Sắc ký đồ đường chuẩn mẫu thử (HPLC) 2.5 mAU 285nm,4nm (1.00) mAU 285nm4nm (1.00) 2.6 2.4 2.4 /35.707 2.3 2.3 /20.504 2.2 2.1 /36.239 2.5 2.2 2.1 2.0 2.0 1.9 1.9 1.8 1.8 1.7 1.7 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 5.0 Dung dịch chuẩn crinamidin 2ppm 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 Dung dịch chuẩn crinamidin ppm mAU 285nm,4nm (1.00) mAU 3.75 285nm4nm (1.00) 15.0 3.50 12.5 /38.673 3.25 3.00 10.0 2.75 /35.204 7.5 2.50 5.0 2.25 2.00 2.5 1.75 0.0 1.50 -2.5 0.0 5.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 min Dung dịch chuẩn crinamidin 10 ppm Dung dịch chuẩn crinamidin 20 ppm mAU 285nm,4nm (1.00) mAU 285nm,4nm (1.00) 15.0 15.0 12.5 12.5 10.0 10.0 7.5 /35.195 /35.204 7.5 5.0 5.0 2.5 2.5 0.0 0.0 -2.5 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 Dung dịch chuẩn crinamidin 40 ppm -2.5 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 Dung dịch chuẩn crinamidin 50 ppm min mAU 285nm4nm (1.00) mAU 285nm,4nm (1.00) 15.0 45 40 Crinamidin/35.034 12.5 10.0 35 30 25 7.5 Crinamidin/35.192 20 5.0 15 10 2.5 0.0 -2.5 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 5.0 10.0 15.0 Dung dịch chuẩn crinamdin 100 ppm 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 50.0 55.0 60.0 Mẫu thử HPLC mAU 285nm,4nm (1.00) mAU 285nm,4nm (1.00) 45 30.0 40 27.5 25.0 35 22.5 30 20.0 17.5 25 15.0 20 12.5 Crinamidin/35.214 10 10.0 /35.140 15 7.5 5.0 2.5 0.0 -2.5 -5 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 Mẫu thử HPLC 50.0 55.0 60.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 Mẫu thử HPLC 16 Sắc ký đồ mẫu ứng dụng: ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LIÊN XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ... đảm bảo quyền lợi người sử dụng chặt chẽ quản lý, thực đề tài nghiên cứu: Xác định hàm lượng crinamidin thuốc thực phẩm bảo vệ sức khỏe sắc ký khí khối phổ , với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định. .. Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng crinamidin thuốc thảo dược TPBVSK sắc ký khí khối phổ Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng crinamidin thuốc thảo dược TPBVSK Phần TỔNG