Xác định hàm lượng crinamidin trong một số thực phẩm chức năng bằng GC-MS/MS

Bài viết tiến hành xây dựng phương pháp nhằm xác định hàm lượng Crinamidin trong các sản phẩm thực phẩm chức năng bằng sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS). Từ đó góp phần kiểm soát chất lượng của các chế phẩm Trinh nữ hoàng cung trên thị trường, nâng cao hiệu quả cho người sử dụng.

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CRINAMIDIN TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG GC-MS/MS Lê Thị Liên1, Bạch Thúy Anh2, Cao Công Khánh2, Trần Nguyên Hà1, Lê Thị Hồng Hảo2 Trường đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (Ngày đến tòa soạn: 22/1/2018; Ngày sửa sau phản biện: 2/3/2018; Ngày chấp nhận đăng: 9/3/2018) Tóm tắt HƯƠNG pháp xác định hàm lượng Crinamidin sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) xây dựng thẩm định mẫu thực phẩm chức Phương pháp thực cột DB5-MS, kết hợp với detector khối phổ ba tứ cực Phương pháp đánh giá độ đặc hiệu, đường chuẩn, độ đúng, độ chụm, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Đường chuẩn xây dựng khoảng nồng độ từ 5ppm-50ppm với hệ số tương quan 0,9970 Độ thu hồi với ba mức nồng độ đạt 90,1% Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp 10 mg/kg Tất kết thu đáp ứng yêu cầu AOAC mẫu thực phẩm chức Phương pháp ứng dụng để phân tích 34 mẫu thực tế địa bàn Hà Nội Từ khóa: Crinamidin, sắc ký khí khối phổ hai lần (GS-MS/MS) I ĐẶT VẤN ĐỀ Trinh nữ hoàng cung (TNHC) loại dược liệu sử dụng ngày nhiều Việt Nam Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh tác dụng TNHC u xơ tử cung, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, dày, phổi [2] Ngoài TNHC cịn có khả chống ngưng kết tiểu cầu, chống độc tế bào, ức chế hình thành mạch máu tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (HUVECs) điều hòa hệ miễn dịch thể Hiện thực phẩm chức chứa TNHC xuất thị trường phong phú đa dạng Việc tiêu chuẩn hóa chế phẩm đóng vai trị vơ quan trọng kiểm soát chất lượng Crinamidin alkaloid đại diện lựa chọn để xác định hàm lượng nhằm đánh giá tiêu chuẩn chế phẩm Mặc dù Dược điển Việt Nam có phương pháp xác định hàm lượng Crinamidin HPLC mẫu dược liệu, nhiên gặp khó khăn q trình phân tích hạn chế độ nhạy độ đặc hiệu, mẫu phức tạp thực phẩm chức Trong nghiên cứu này, xây dựng phương pháp nhằm xác định hàm lượng Crinamidin sản phẩm thực phẩm chức sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) Từ góp phần kiểm sốt chất lượng chế phẩm TNHC thị trường, nâng cao hiệu cho người sử dụng II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Crinamidin Mẫu sử dụng nghiên cứu thực phẩm chức năng: viên nang cứng, trà túi lọc 2.2 Thiết bị dụng cụ Thiết bị phân tích sử dụng nghiên cứu hệ thống GC-MS/MS gồm máy GC 7890A khối phổ MS 7000B (ba tứ cực) Agilent Cột sắc ký khí DB5MS (30m x 0,25mm x 0,25 µm) sử dụng để phân tích Crinamidin 2.3 Hóa chất chất chuẩn - Dung dịch chuẩn Crinamidin 200 µg/mL (Bộ mơn Hóa phân tích kiểm nghiệm, Trường Đại học y dược thành phố Hồ Chí Minh, 93,1%) pha chloroform, bảo quản 2-8οC - Nội chuẩn (IS) Cafein 1000 µg/mL (Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương), pha chloroform, bảo quản 2-8οC P Điện thoại: 0912111463 Email: lelien274@gmail.com Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 1-2018) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC - Các dung môi gồm chloroform, methanol, acid hydrochloric, ammoniac thuộc loại tinh khiết phân tích (Merck) 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu Đồng mẫu: Viên nang cứng, lấy 20 viên, loại bỏ vỏ nang gộp mẫu đồng Nền mẫu thực phẩm chức mẫu phức tạp chứa nhiều loại dược liệu khác tá dược nên việc lựa chọn dung mơi chiết quy trình xử lý mẫu quan trọng Crinamidin alkaloid, dạng bazơ tan tốt dung môi hữu cơ, không tan nước; chuyển sang dạng muối lại tan tốt nước khơng tan dung mơi hữu Vì vậy, chúng tơi dựa tính chất tham khảo tài liệu [1,2,4,5] để chiết Crinamidin khỏi mẫu Quá trình đun hồi lưu mẫu: điều kiện dung môi chiết, thời gian số lần chiết khảo sát lựa chọn quy trình chiết Crinamidin tối ưu Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng để loại tạp làm giàu mẫu 2.4.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần Crinamidin nội chuẩn Cafein tối ưu sử dụng ng̀n ion hóa va chạm electron (EI), chế độ qt lựa chọn đa phản ứng (MRM) Mỗi chất chọn ion mẹ thực tối ưu điều kiện phân mảnh để chọn 2-3 ion con, ion sử dụng để định lượng ion lại sử dụng để xác nhận Điều kiện GC đươc khảo sát cột sắc ký DB5-MS III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện tối ưu để phân tích Crinamidin GC-MS/MS Sử dụng dung dịch chuẩn 10 ppm để thực khảo sát điều kiện tối ưu khối phổ Crinamidin lựa chọn ion Nội chuẩn Cafein lựa chọn ion Một ion sử dụng để định lượng, ion lại sử dụng để khẳng định Các kết xác định tóm tắt bảng Bảng Thời gian lưu điều kiện MS/MS để phân tích Crinamidin STT Hͫp ch̭t Crinamidin Cafein (IS) Thͥi gian l˱u (phút) 16,7 8,0 Ion ḿ (m/z) Ion (m/z) Năng l˱ͫng b̷n phá (eV) Ghi 317 217 30 Ĉӏnh lѭӧng 317 244 25 Xác nhұn 317 288 20 Xác nhұn 194 82 30 Ĉӏnh lѭӧng 194 109 25 Xác nhұn Crinamidin tách qua cột sắc ký khí DB5-MS với thơng số sau: Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 250οC, chế độ tiêm mẫu chia dịng (10:1) Khí mang Heli, tốc độ dịng 1,0 mL/phút Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ ban đầu 100οC (giữ phút), tăng 20οC/phút lên 240οC (giữ phút), tăng 5οC/phút lên 290οC (giữ phút) Tổng thời gian phân tích 27 phút Nguồn ion hóa EV 70 eV, với nhiệt độ nguồn ion 270οC Hình giới thiệu sắc đồ chuẩn Crinamidin nội chuẩn Cafein nồng độ 10 ppm Hình Sắc đồ tổng (TIC) chuẩn Crinamidin nội chuẩn Cafein nồng độ 10 ppm Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 1-2018) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu Mẫu kiềm hóa dung dịch amoniac, sau đun hồi lưu với hỗn hợp dung mơi hữu Sử dụng dung môi với pH khác để loại tạp Sau mẫu làm giàu phân tích GC-MS/MS Trong q trình xử lí mẫu trên, loại dung môi chiết, thời gian số lần đun hồi lưu mẫu ảnh hưởng đến hiệu suất chiết khảo sát tối ưu Lựa chọn dung môi chiết mẫu Tiến hành khảo sát dung môi chiết với 100% methanol hỗn hợp dung môi chiết chloroform: methanol tỷ lệ: 1:3, 1:1, 3:1 (v/v), nhận thấy sử dụng hỗn hợp chloroform : methanol (3:1) cho tín hiệu cao q trình phân tích Lựa chọn số lần thời gian đun hồi lưu mẫu Crinamidin chiết khỏi mẫu kĩ thuật chiết hồi lưu với hệ dung môi chloroform: methanol (3:1) (v/v) Các yếu tố cần khảo sát gồm: số lần thời gian đun hồi lưu mẫu Số lần chiết lần, lần, lần với thời gian đun 60 phút thời gian đun 30 phút, 60 phút, 90 phút 120 phút khảo sát Kết cho điều kiện tối ưu đun hồi lưu mẫu lần, lần 60 phút Quy trình chiết mẫu tối ưu sau: Cân xác khoảng 1-5 g mẫu đồng vào bình cầu 250 mL Kiềm hóa mẫu đến pH = dung dịch ammoniac đặc, để yên 60 phút Thêm 100 mL hỗn hợp dung mơi chloroform : methanol (3:1) vào bình cầu đun hồi lưu 60 phút Gạn dịch chiết vào bình quay đun hồi lưu lần Gộp dịch chiết mẫu đến cắn Hịa cắn 20 mL acid chlohydric 0,1N chuyển vào ống ly tâm 50 mL Thêm 20 mL chloroform, lắc ngang 30 phút, ly tâm 6000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch chloroform Kiềm hóa dịch acid đến pH = 9,4 dung dịch ammoniac Thêm 15 mL chloroform vào ống ly tâm, lắc ngang 30 phút Mẫu sau ly tâm 6000 vịng/phút phút Thu lấy phần dịch chloroform vào bình định mức 25 mL Chiết lặp lần với mL chloroform Gộp dịch chiết, thêm 0,1 mL nội chuẩn cafein 125 µg/mL định mức đến vạch chloroform Lọc dịch phân tích GC-MS/MS 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc Trong nghiên cứu này, Crinamidin đặc trưng ion mẹ ion con, số điểm IP đạt yêu cầu EC nhận dạng pic Ngoài ra, mẫu thêm chuẩn có xuất pic với thời gian lưu tương tự chuẩn; mẫu trắng không thấy có pic Crinamidin Hình minh họa phổ khối chuẩn Crinamidin nội chuẩn Cafein Phổ khối Crinamidin Phổ khối Cafein Hình Phổ khối chuẩn Crinamidin nội chuẩn Cafein 3.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) LOD, LOQ phương pháp xác định cách phân tích mẫu trắng thêm chuẩn nồng độ thấp để thu tỷ số tín hiệu nhiễu (S/N) tương ứng 10 Kết thu LOD LOQ tương ứng mg/kg 10 mg/kg Hình thể sắc đồ Crinamidin mức LOQ Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 1-2018) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Hình Giới hạn định lượng (LOQ) Crinamidin 3.3.3 Xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn Crinamidin xây dựng từ 5-50 µg/mL, diện tích pic phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ theo phương trình y = 0,089074x – 0,44413 với hệ số biến thiên R2 = 0,9970 3.3.4 Độ lặp lại Để khảo sát độ lặp lại phương pháp, phân tích lặp lại lần mẫu TPCN dạng viên nang cứng dạng trà túi lọc Đây mẫu chủ yếu có chứa Crinamidin thị trường Xử lý mẫu tiêm mẫu vào máy GC-MS/MS theo điều kiện khảo sát Độ lặp lại phương pháp đánh giá thông qua hệ số biến thiên RSD (%) Các kết thu cho thấy phương pháp có độ chụm tốt với hệ số biến thiên RSD (%) nằm khoảng từ 4,5% - 4,9% đạt yêu cầu AOAC 3.3.5 Độ thu hồi Độ phương pháp đánh giá cách thêm chuẩn nồng độ khác (80%, 100%, 120% so với hàm lượng mẫu thực) mẫu TPCN dạng viên nang cứng đánh giá hiệu suất thu hồi Kết thể bảng Bảng Kết phân tích độ thu hồi Crinamidin mẫu viên nang cứng Crinamidin/m̳u (μg/g) Kh͙i l˱ͫng chu̱n thêm vào (μg) 82,4 Ĉ͡ thu h͛i (%) 160 90,1 – 96,0 200 91,5 – 97,2 240 92,8 – 99,4 Kết phân tích có độ thu hồi R% nằm khoảng từ 90,1% - 99,4%, cho thấy phương pháp có độ đáp ứng theo yêu cầu AOAC 3.4 Áp dụng phương pháp tiến hành phân tích số mẫu thị trường Kết phân tích hàm lượng Crinamidin 29 mẫu thực phẩm chức mẫu nguyên liệu lấy địa bàn Hà Nội bảng bảng Bảng Hàm lượng Crinamidin 29 mẫu thực phẩm chức STT Mүu thӵc Hàm lѭӧng (μg/viên) 15 M15 (viên nang cӭng) (-) M1 (viên nang cӭng) 206,9 16 M16 (viên nang cӭng) (-) M2 (viên nang cӭng) 45,0 17 M17 (viên nang cӭng) (-) M3 (viên nang cӭng) (-) 18 M18 (viên nang cӭng) (-) M4 (viên nang cӭng) 40,1 19 M19 (viên nang cӭng) (-) M5 (viên nang cӭng) 33,4 20 M20(viên nang cӭng) 60,2 M6 (viên nang cӭng) 42,2 21 M21 (viên nang cӭng) 105,3 M7 (viên nang cӭng) 19,5 22 M22 (viên nang cӭng) 54,0 M8 (viên nang cӭng) 18,3 23 M23 (viên nang cӭng) (-) M9 (viên nang cӭng) 35,6 24 M24 (viên nang cӭng) 223,7 10 M10 (viên nang cӭng) 103,8 25 M25 (viên nén) 117,8 11 M11 (viên nang cӭng) (-) 26 M26 (viên nén) 110,5 12 M12 (viên nang cӭng) (-) 27 M27 (viên nén) (-) 13 M13 (viên nang cӭng) 42,9 28 M28 (viên nén) 181,4 14 M14 (viên nang cӭng) 94,9 29 M29 (viên nén) 54,6 Chú thích: (-): khơng phát Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 1-2018) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Bảng Hàm lượng Crinamidin mẫu nguyên liệu STT M̳u th͹c Hàm l˱ͫng (mg/100g) Nguyên liӋu (cao khô) 14,2 Nguyên liӋu (cao phun sҩy) 0,065 Nguyên liӋu (cao lӓng) 0,26 Nguyên liӋu (cao khô) 1,56 Nguyên liӋu (cao khô) 6,33 Qua khảo sát sơ 29 mẫu thực phẩm chức thị trường cho thấy hàm lượng Crinamidin dao động khoảng từ 18,3 µg/viên đến 381,4 µg/viên, có 10 mẫu khơng phát Crinamidin Đối với mẫu nguyên liệu, hàm lượng Crinamidin dao động khoảng từ 0,065 mg/100g (mẫu phun sấy) đến 14,2 mg/100g (mẫu cao khô) Điều cho thấy chất lượng nguyên liệu ban đầu trước đưa vào sản xuất khơng đồng Trong đó, hầu hết sản phẩm TPCN chứa trinh nữ hoàng cung công bố nhãn hàm lượng cao nguyên liệu Do đó, cần thiết phải tiêu chuẩn hóa nguyên liệu TNHC để người tiêu dùng lựa chọn sản phẩm phù hợp, có chất lượng IV KẾT LUẬN Phương pháp xác định Crinamidin thực phẩm chức xây dựng gồm quy trình chiết mẫu quy trình phân tích Crinamidin GC-MS/MS Phương pháp sử dụng nội chuẩn Cafein giúp kết phân tích xác ổn định Phương pháp thẩm định độ đặc hiệu, đường chuẩn, độ lặp lại, độ xác giới hạn phát Kết thẩm định phương pháp cho thấy quy trình xây dựng phù hợp để áp dụng nhằm xác định hàm lượng Crinamidin thực phẩm chức TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y Tế Dược điển Việt Nam IV Bản bổ sung, NXB Y học, Hà Nội, 2015, pp 1182 - 1184 Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 2015, pp 510 - 512 Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Ngô Vân Thu, Delome Frederic, Daniel F Michel Bechi, "Khảo sát alcaloid chiết từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceae) kỹ thuật GCMS", Tạp chí Dược học, 4, 1999, pp 9-11 Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Hồng Thiên Thanh, Võ Thị Bạch Huệ, "Phân lập xây dựng chất chuẩn crinamidin từ trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L.", Tạp chí Dược học, 441, (2013), pp 38 - 41 John Refaat, Mohamed S Kamel, Mahmoud A Ramadan and Ahmed A Ali, "Crinum; an endless source of bioactive principles: A review Part V Biological profile", International journal of pharmaceutaical sciences and research, (4), 2013, pp 1239 - 1252 Summary DETERMINATION OF CRINAMIDINE IN DIETARY SUPPLEMENTS BY GC-MS/MS Le Thi Lien1, Bach Thuy Anh2, Cao Cong Khanh2, Tran Nguyen Ha1, Le Thi Hong Hao2 Hanoi University of Pharmacy National Institute for Food Control The determination of crinamidine in dietary supplements content by mass spectrometry (GC-MS/MS) was developed and validated The method was performed on the DB5MS column (30m x 0,25mm; 0,25 μm), in combination with the tandem mass spectrometry The parameters of the method were evaluated for selectivity, calibration curve, accuracy, precision, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) The calibration curve was highly linear (the coefficient of determination 0.9970) within the concentration range of 5ppm-50ppm The recovery at three concentrations were above 90,1% The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the methods were and 10 mg/kg, respectively All obtained results were acceptable according to the AOAC for dietary supplements The method was applied to analyze 34 samples in Hanoi Keywords: Crinamidine, Gas chromatography tandem mass spectrometry (GS-MS/MS) Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 1-2018) ... tích số mẫu thị trường Kết phân tích hàm lượng Crinamidin 29 mẫu thực phẩm chức mẫu nguyên liệu lấy địa bàn Hà Nội bảng bảng Bảng Hàm lượng Crinamidin 29 mẫu thực phẩm chức STT Mүu thӵc Hàm lѭӧng... sơ 29 mẫu thực phẩm chức thị trường cho thấy hàm lượng Crinamidin dao động khoảng từ 18,3 µg/viên đến 381,4 µg/viên, có 10 mẫu khơng phát Crinamidin Đối với mẫu nguyên liệu, hàm lượng Crinamidin. .. tiêu dùng lựa chọn sản phẩm phù hợp, có chất lượng IV KẾT LUẬN Phương pháp xác định Crinamidin thực phẩm chức xây dựng gồm quy trình chiết mẫu quy trình phân tích Crinamidin GC-MS/MS Phương pháp