Phương pháp xác định Melamine trong sữa bằng HPLC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ KỸ THUẬT HĨA HỌC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỀ TÀI: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MELAMINE TRONG SỮA BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP HPLC NỘI DUNG BÁO CÁO 1.PHƯƠNG PHÁP HPLC TỔNG QUAN VỀ CHẤT MELAMINE THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 4.KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 5.TÀI LIỆU THAM KHẢO Có nhiều phương pháp để xác định melamine sữa như: máy sắc ký khí khối phổ GC/MS Dùng pháp Dumas  Phương Phương pháp Kjedal Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC  Tại lại chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC ? HPLC sử dụng rộng rãi phân tích lương thực thực phẩm xác định hóa chất bị cấm, chất tồn dư kiểm soát chất lượng, mang lại độ xác cao thời gian tiến hành ngắn thỏa mãn tiêu chí:       High speed – tốc độ nhanh Low detection limit - giới hạn phát thấp Simple method – phương pháp đơn giản Efficient – hiệu Cheap – giá rẻ Not labor intensive – không tốn lao động PHƯƠNG PHÁP HPLC Cơ sở lý thuyết phương pháp: HPLC: kĩ thuật tách chất phân tích di chuyển qua cột chứa hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác liên quan đến lực tương đối chất với pha tĩnh pha động Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột điều chỉnh để rửa giải chất phân tích với thời gian hợp lý Nguyên lý hoạt động: Sắc ký lỏng phân thành: ký lỏng pha thường ( Normal phase chromatography ) • Sắc ký lỏng pha đảo ( Reversed phase chromatography ) • Sắc ký trao đổi ion ( Ion exchange chromatography ) • Sắc • Sắc ký lỏng lọc gel ( Size exclusion chromatography )  • • Sắc ký lỏng pha đảo: sử dụng nhiều (>90%) Pha tĩnh : Cột nhồi không phân cực ( C18, C8, C3, phenyl… ) Pha động: hỗn hợp nước – dung môi ( methanol, acetonitrile ) Sử dụng phân tích: • • • • • • Thuốc kháng sinh, an thần, giảm đau, steroid Axit amin, protein, hydrat cacbon, lipid… Đường nhân tạo, chất chống oxi hóa, chất phụ gia, aflatoxin… Chất thơm, chất điện hoạt, hóa chất công nghiệp… Thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, phenol, dẫn xuất phenol… Thuốc, chất độc, cồn máu… THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HĨA CHẤT Bộ lọc 0.45µm (màng Nylon) Hệ thống Q-pod Millipore Máy HPLC đầu dò UV THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HĨA CHẤT Hóa chất thuốc thử: • Chất chuẩn: Melamine (99,0%) • Dung mơi: Methanol • Dung mơi rửa giải: Trifluoroacetic Methanol • Mẫu thử : sữa dạng bột lỏng • Nước sử dụng cho việc chuẩn bị pha động pha loãng lọc hệ thống Qpod Millipore Hệ thống sắc ký – detector: Đầu dò UV, cột C18 (150mm x 32mm ID, kích thước hạt 5µm)  Pha dung dịch Dung mơi: Dung mơi 50% methanol (về thể tích) chuẩn bị cách pha thể tích methanol nước Dung dịch chuẩn Melamine  C = 1000 µgm 100ml Hịa tan metanol 50% Cân 100mg 30 phút melamine Định mức Hút 5ml  C = 10 µgm  C = 100 µgm Hút 5ml Chuẩn làm việc 50ml 50ml Định mức metanol Định mức metanol 50% 50% Chuẩn bị mẫu 100ml 50ml Methanol 50% 100ml 10 ml DD melamine 10ml mẫu lỏng 1,0g mẫu khô 1000 µg/mL 30 phút Làm lạnh nhiệt độ phịng 3ml đầu dung dịch lọc bị loại bỏ, lấy phần lọc lại cho vào lọ HPLC để phân tích Lọc qua lọc Dịch ly tâm 0.45µm C = 100µg/mL 100ml 50ml Định mức Metanol 50% Ly tâm ≥ 3200 rpm Định mức Metanol 50%  Các thông số cài đặt: Các tham số dùng HPLC (Theo tiêu chuẩn FDA): • • • Cột hấp phụ: VenusilASBC8 kích thước: 4.6 x 250 mm Pha động: buffer: acetonitrile (ACN) = 85:15; 10mM citric acid; 10mM sodium octane, pH=3.0   • • • • Tốc độ chảy: 1.0 mL/min Bước sóng tia UV: 240nm Nhiệt độ: C Detector: DAD Kết quả, thảo luận   Một đường hiệu chỉnh tuyến tính thu dải hiệu chuẩn từ 1,0 đến 80 µgmL -1  với hệ số tương quan () 0,999 Giá trị R.S.D lần tiêm mẫu lặp lại < 0,02% nồng độ hệ số lệch chuẩn y < 2% Độ xác phương pháp đánh giá nồng độ bốn mức độ melamine (5, 10, 20 40 -1 µgmL ) với việc sử dụng g khô hoặc10ml mẫu chất lỏng Hiệu suất thu hồi phản ánh trung bình cộng sáu lần phân tích nồng độ báo cáo bảng sau: Bảng kết phục hồi melamine trung bình lần phân tích nồng độ khác Melamine Những sắc phổ khơng có nhiễu tín hiệu melamine phân biệt rõ ràng 3,7 phút Một đường cong hiệu chuẩn tuyến tính thể hình sau: LOD (giới hạn phát hiện) xác định 0,1 µgmL-1  LOQ (giới hạn định lượng) xác định 0,2 µgmL-1  Giá trị % R.S.D (độ lệch chuẩn) nghiên cứu xác mức độ LOQ khoảng 5% Hiệu suất thu hồi tỷ lệ melamine mẫu dao động từ 97,2% đến 101,2% CƠNG THỨC TÍNH a: tỉ lệ diện tích Dựa vào đường chuẩn ta có:    b: độ dốc W: phần khối lượng c: hệ số tự Hàm lượng chất cần phân tích   : diện tích pic CPT   : diện tích pic chất chuẩn nội b: độ dốc c: hệ số tự : khối lượng chất chuẩn nội :khối lượng mẫu thử KẾT LUẬN  Trong ngày ngày tính lặp lại 1,0% R.S.D LOD LOQ tương ứng 0.1 mLmin-1 và 0,2 mLmin-1 Phương pháp phân tích cung cấp độ nhạy cảm tuyệt vời, khả tái lặp, xác cao Phát định lượng melamine thực nhanh chóng dễ dàng cách sử dụng HPLC / UV Phương pháp thường sử dụng kiểm tra tiêu chuẩn melamine để tránh sản phẩm sữa chết người vào thị trường 6.TÀI LIỆU THAM KHẢO • • • • Gopalakrishnan Venkatasami, John R Sowa Jr. ∗ Department of Chemistry and Biochemistry, Seton Hall University, 400 South Orange Ave., South Orange, NJ 07079, USA http://phantichmoitruong.com/detail/phuong-phap-xac-dinh-melamine-trong-thuc-pham-thuc-an-chan-nuoiva-sua-bang-sac-ky-long-cao-ap-hplc.html   Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9048:2012 (ISO/TS 15495:2010) sữa, sản phẩm sữa thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh - Hướng dẫn định lượng melamine axit xyanuric sắc ký lỏng- khối phổ hai lần (LC-MS/MS) http://www.voer.edu.vn/module/melamine-ung-dung-va-tac-hai THANK YOU ... pháp Dumas  Phương Phương pháp Kjedal ? ?Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC  Tại lại chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC ? HPLC sử dụng rộng rãi phân tích lương thực thực phẩm xác định. ..NỘI DUNG BÁO CÁO 1.PHƯƠNG PHÁP HPLC TỔNG QUAN VỀ CHẤT MELAMINE THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 4.KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 5.TÀI LIỆU THAM KHẢO Có nhiều phương pháp để xác định melamine sữa như: máy sắc ký... hạn phát hiện) xác định 0,1 µgmL-1  LOQ (giới hạn định lượng) xác định 0,2 µgmL-1  Giá trị % R.S.D (độ lệch chuẩn) nghiên cứu xác mức độ LOQ khoảng 5% Hiệu suất thu hồi tỷ lệ melamine mẫu dao