kiểm định melamine trong sữa bằng phương pháp hplc

Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - - TIỂU LUẬN KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: KIỂM ĐỊNH MELAMINE TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Hà Nội, tháng năm 2017 Page Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm Mục lục Sữa vấn đề cần kiểm định Melamine ảnh hưởng 2.1 Melamine 2.2 Tác hại Melamine 2.3 Tại cho Melamine vào sữa ? Phương pháp kiểm định Melamine sữa 3.1 Giới thiệu hệ thống HPLC 3.2 Sơ đồ hoạt đồng HPLC 3.3 Xác định hàm lượng melamine phương pháp HPLC .11 3.4 Xử lý kết 12 Kết luận 14 Tài liệu tham khảo 15 Page Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm LỜI NÓI ĐẦU: Vấn đề an toàn thực phẩm vấn đề nhức nhối nhận quan tâm lớn toàn xã hội, song hành với vấn đề việc không trung thực với nguồn gốc thực phẩm nhiều người tiêu dùng thông thái quan tâm Nó tạo sóng phản đối kịch liệt từ phía người tiêu dùng kết liên quan đến sách kinh tế trị Với lý đó, việc xác định hay kiểm tra chất lượng, nguồn gốc thực phẩm xem có bị pha trộn hay giả mạo thay đổi phẩm cấp hay không vấn đề quan trọng đòi hỏi kỹ sư thực phẩm tương lai cần có kỹ xử lý tốt vấn đề Hiểu mức độ quan trọng việc kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm trình học tập Bộ môn quản lý chất lượng công nghệ thực phẩm Viện Công nghệ Sinh Học Công nghệ Thực Phẩm trường ĐH Bách Khoa Hà Nội, chương trình đào tạo kỹ sư chuyên nghành Quản lý chất lượng công nghệ thực phẩm chúng em đăng ký Môn Kiểm định nguồn gốc thực phẩm nghiên cứu tìm hiệu phương pháp phân tích HPLC việc làm giả protein sữa việc cho melamine vào Page Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm Sữa vấn đề cần kiểm định Sữa sản phẩm từ sữa thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng Sữa đáp ứng nhu cầu thể acid amin không thay thế, acid béo không no, khoáng (đặc biệt canxi phốt pho) vitamin Sữa bổ dưỡng mà có tác dụng giải độc Trong số thức ăn tự nhiên người, sản phẩm mà chất cần thiết cho thể lại phối hợp cách hiệu sữa.Chính nhờ giá trị dinh dưỡng với tiện lợi mà sữa người ưa chuộng sử dụng ngày Do mức độ phổ biến giá trị kinh tế mà sữa mang lại nên sữa sản phẩm từ sữa sản phẩm bị thay bổ sung thành phần chất lượng, lấy thành phần có giá trị sản phẩm Vì việc kiểm định nguồn gốc sữa sản phẩm từ sữa quan trọng Nhìn chung, vấn đề kiểm định nguồn gốc sữa sản phẩm từ sữa bao gồm: - Không tuân thủ theo yêu cầu quy định pháp luật (tiêu chuẩn sản phẩm) +) Các giới hạn max/ hàm lượng nước, chất rắn hòa tan chất béo, chất béo vài sản phẩm từ sữa (bơ, phomat, yoghurt ) +) Nguồn gốc địa lý sản phẩm - Bổ sung thành phần khác sữa thành phần sữa chất lượng bổ sung nước vào sữa, sữa khác loài, protein từ sữa( protein từ thực vật, melamine ), bổ sung chất chất béo thực vật động vật vào làm tăng hàm lượng chất béo sữa, bổ sung sữa hoàn nguyên vào sữa tươi, hay bổ sung chất phụ gia cấm borie acid/ borate - Không tuân thủ yêu cầu trình công nghệ xử lý nhiệt, ủ chín phomat Melamine ảnh hưởng Melamine ảnh hưởng Năm 2008, sữa nhiễm melamine coi vụ bê bối tồi tệ Trung Quốc vòng nhiều năm Đã có gần 300.000 trẻ em chịu ảnh hưởng, 860 trường hợp nhập viện trường hợp tử vong liên quan đến việc sử dụng loại Vậy meliamine tác động đến sức khỏe nào, lợi nhuận cho melamine vào sữa? 2.1 Melamine Melamine (tên đầy đủ 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) bazơ hữu có công thức hóa học C3H6N6 tạo thành từ phân tử cyanamide (CN2H2), tổng hợp lần năm 1984 từ chất urê - chất có thành phần nitrogen cao Nếu Page Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm tính tỷ lệ nguyên tố cácbon (C), nitơ (N) hydro (H) nitơ chiếm tới 66% tính theo khối lượng Melamine màu trắng, tan nước, chịu nhiệt độ cao đến 350°C, có khả giải phóng N gặp nhiệt độ cao Melamine thành phần công nghệ sản xuất vật dụng gia đình (chén đĩa), formica (dùng công nghệ bàn ghế, vách ), bao bì, nhựa melamine dùng làm chất keo dán, sử dụng làm chất chống cháy 2.2 Tác hại melamine Nếu ăn, uống thực phẩm có lẫn melamine dẫn tới tổn thương khả sinh sản, gây sỏi thận sỏi bàng quang, dẫn tới ung thư bàng quang Đã có năm công trình nghiên cứu giới vấn đề Một nghiên cứu chó báo cáo năm 1953 cho thấy: nuôi dưỡng có 3% melamine, sau năm có thay đổi nước tiểu: giảm độ đậm đặc tăng lượng nước tiểu lên (do tổn thương ống thận), nước tiểu chó có diện tinh thể melamine, chất đạm nhiều hồng cầu Tại hội nghị vào năm 2007 Đại học bang Michigan - Hoa Kỳ, phó giáo sư Wilson Rumbeyha, thuộc Trung tâm Chẩn đoán sức khỏe cộng đồng vật nuôi, bình luận kết nghiên cứu mình: “Tai hại thay, tinh thể muối cyanurat melamine không hòa tan cách dễ dàng, bị thải trừ thể chậm Cho nên cuối tích tụ dần thể gây độc” Melamine có độc tính qua thử nghiệm: gây ngộ độc cấp chuột với liều chết (LD50) qua đường uống 3.000mg cho kg Melamin gây sỏi thận dẫn đến suy thận trẻ Khi melamine kết hợp với acid cyanuric cho muối cyanurat melamine độc hại nhiều lần so với melamine dùng đơn độc hay acid cyanuric dùng đơn độc Vấn đề thực nhiễm melamine mức độ không tốt cho người, mà chất dùng để sản xuất nhựa chí gây hại cho lợn gia cầm lại có mặt thực phẩm cho người 2.3 Tại cho melamine vào sữa? Sữa chất giàu dinh dưỡng, đặc biệt hàm lượng protein cao Do nhãn hiệu sản phẩm sữa, thông tin hãng sản xuất, nguyên liệu, trọng lượng thông tin cần thể hàm lượng protein Hàm lượng protein tiêu chí đánh giá chất lượng sữa Trong phương pháp xác định protein chủ yếu Kjeldahl Dumas Hai phương pháp dựa vào giả định rằng: a, carbohydrat mỡ không chứa nitrogen Page Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm b, hầu hết nitrogen thực phẩm diện dạng amino acid protein c, tính trung bình lượng nitrogen protein khoảng 16% Dựa vào giả định này, hai phương pháp đo lượng nitrogen thực phẩm ( Kjeldahl xem xét thông qua lượng amoni, dumas đo nitrogen thông qua lượng nito thoát đốt cháy mẫu) nhân lượng nitrogen với hệ số 1/0.16 hàm lượng protein Như biết hàm lượng nitrogen melamine chiếm 66%, nắm nguyên tắc hai phương pháp nên nhà sản xuất cố tình bổ sung melamine vào sữa, mẫu sữa kiểm nghiệm hai phương pháp hàm lượng protein sữa gia tăng, đồng nghĩa với việc giá sữa tăng theo Sau bê bối sữa nhiễm melamine gây nên, phân tích hàm lượng melamine thêm vào tiêu đánh giá chất lượng sữa Theo tiêu chuẩn an toàn thực phẩm ủy ban luật quốc tế chất lượng an toàn thực phẩm LHQ (CAC) công bố ngày 5/7/2012 hàm lượng melamine tối đa cho phép sữa 0,15 mg/kg với sữa nước dành cho trẻ em, 1mg/kg với sữa bột dành cho trẻ em 2,5 mg/kg với thức ăn động vật thực phẩm khác Ở Việt Nam hàm lượng quy định 2,5 mg/kg tất loại sữa sản phẩm từ sữa Phương pháp kiểm định melamine Để kiểm tra hàm lượng melamine sữa, nhiều phương pháp phân tích nghiên cứu ứng dụng như: - GC/MS Kít thử ELISA HPLC Do HPLC phương pháp thuận lợi để định lượng chất hỗn hợp chất tách khỏi chất khác HPLC sử dụng rộng rãi phân tích lương thực thực phẩm xác định hóa chất bị cấm,các chất tồn dư kiểm soát chất lượng, mang lại độ xác cao thời gian tiến hành ngắn thỏa mãn tiêu chí: ¬ Not labor intensive – không tốn lao động ¬ Efficient – hiệu ¬ Cheap – giá rẻ ¬ Low detection limit - Giới hạn phát thấp Page Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm ¬ Simple method – phương pháp đơn giản Hiện Việt Nam chủ yếu dùng phương pháp để xác định melamine Vì giới hạn tiểu luận này, nhóm sâu vào tìm hiểu phương pháp phân tích melamine HPLC 3.1 Giới thiệu HPLC - Khái niệm: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đời năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Thay để dung môi nhỏ giọt qua cột sắc ký tác dụng trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất lớn để di chuyển xảy nhanh Phương pháp cho phép sử dụng hạt có kích thước nhỏ vào cột hấp phụ làm tăng bề mặt tiếp xúc pha tĩnh phân tử qua Từ làm tưng khả phân tích chất có hỗn hợp Phương pháp ngày sử dụng rộng rãi phổ biến nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả định lượng tốt, thích hợp tách hợp chất khó bay dễ phân hủy nhiệt Phạm vi ứng dụng phương pháp HPLC rộng, phân tích hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, chất phụ gia thực phẩm lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… - Phân loại: dựa độ phân cực tương đối pha tĩnh pha động HPLC phân thành loại: • sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography): cột hấp phụ chứa hạt silic dioxit nhỏ, dung môi chất không phân cực hexan Các chất không phân cực di chuyển qua ống nhanh chất phân cực • sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography): cột hấp phụ hạt silica biến trở thành không phân cực cách gắn chuỗi hydrocacbon lên hạt Dung dịch chất phân cực nước, rượu Các hợp chất không phân cực hỗn hợp có xu hướng gắn kết với nhóm hydrocacbon nhờ lực van de waals Các hợp chất không phân cực khó hòa tan dung môi phân cực Do chất không phân cực di chuyển qua ống chậm hợp chất phân cực Page Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm 3.2 Sơ đồ hoạt động Hình 1: sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Trong đó: 1: Bình chứa pha động 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp 4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cộ sắc ký (pha tĩnh) 6: Đầu dò 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý liệu điều khiển hệ thống 8: In liệu • Bình chứa pha động : Máy HPLC thường có đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép sử dụng bình chứa dung môi lần để rửa giải theo tỉ lệ Page Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm mong muốn tổng tỉ lệ đường 100% Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, sử dụng đường dung môi lúc mà thường sử dụng đường hệ pha động pha trộn đồng hơn, hệ pha động đơn giản giúp ổn định trình rửa giải Lưu ý: Tất dung môi dùng cho HPLC phải dung môi tinh khiết sử dùng cho HPLC Tất hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu pha hệ đệm phải hóa chất tích khiết dùng cho phân tích • Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên peak tạp trình phân tích Bộ khử khí Degases Mục đích sử dụng khử khí nhằm lọai trừ bọt nhỏ sót lại dung môi pha động, tránh xảy số tượng có sau: Tỷ lệ pha động đường dung môi không làm cho thời gian lưu peak thay đổi Trong trường hợp bọt nhiều, khử khí lọai trừ hết bơm cao áp không hút dung môi, ảnh hưởng đến áp suất hoạt động hệ thống HPLC Trong trường hợp dẫn đến sai kết phân tích • Bơm cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực trình chia tách sắc ký Bơm phải tạt áp suất cao khỏang 250-600bar tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút • Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm thay đồi Có cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu tự động (autosamper) • Cột sắc ký Page Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm Cột chứa pha tĩnh coi trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Cột pha tĩnh thông thường làm thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,… Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột kiểu sắc ký • Đầu dò Là phận phát chất chúng khỏi cột cho tín hiệu ghi sắc ký đồ để định tính định lượng Tùy theo tính chất chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp Tín hiệu đầu dò thu là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,… Trên sở đó, người ta sản xuất lọai đầu dò sau: - Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát UV - Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát chất hấp thụ quang Đây lọai đầu dò thông dụng - Đầu dò hùynh quang (RF) để phát chất hữu chứa huỳnh quang tự nhiên dẫn suất có huỳnh quang - Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả quét chồng phổ để định tính chất theo độ hấp thụ cực đại chất - Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng loại đường - Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn - Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,… • Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận ghi tín hệiu đầu dò phát Đối với hệ thống HPLC đại, phần phần mềm hệ thống ghi nhận, lưu thông số, sắc ký đồ, thông số liên quan đến peak tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính tóan, xử lý thông số liên quan đến kết phân tich • In liệu Sau phân tích xong, liệu in qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển Page 10 Tiểu luận Kiểm định nguồn gốc thực phẩm 3.3 Sử dụng phương pháp HPLC để xác định melamine sữa 3.3.1 Hóa chất thuốc thử Chất chuẩn : Melamine (99,0 %) Dung môi: Methanol Dung môi rửa giải :Trifuloroacetic methanol Mẫu thử: Sữa dạng bột sữa dạng lỏng 3.3.2 Hệ thống sắc ký detector - Cột sác ký có C18 (150 mm x 3,2 mm ID, kích thước hạt 5µm) - Đầu dò UV bước sóng 240 nm - Giới hạn phát (LOD) : 0,1 µg/mL - Giới hạn định lượng (LOQ) : 0,2 µg/mL - Pha động: 0,1% Trifuloroacetic – TFA/methanol 90:10 3.3.3 Chuẩn bị mẫu Cho 10 ml (mẫu dạng lỏng) 1,0 g (mẫu khô) vào bình định mức 100 ml Mẫu pha với 10 ml dung dịch melamine 1000 µgmL-1, pha loãng với 50ml dung dịch methanol 50% rung siêu âm 30 phút Sau làm lạnh nhiệt độ phòng, lên thể tích 100 ml dung dịch methanol 50% thu dung dịch hỗn hợp với nồng độ melamine 100 µgmL-1 Cho dung dịch mẫu thu vào ống ly tâm ly tâm ( ≥ 3200 rpm) lấy phần dung dịch phía ống (5 ml) chuyển sang bình định mức 50ml, lên thể tích 50 ml dung dịch methanol 50% Mẫu lọc qua lọc 0.45 µm (màng Nylon) Nghiên cứu dịch lọc lọc hấp thụ melamine mức sau: 22% (cho 1ml ban đầu), 10% (2 mL),