Đề tài được tiến hành để nghiên cứu chiết xuất và phân lập lycorin trong lá Náng hoa trắng làm chất chuẩn đối chiếu cho nghiên cứu định tính và định lượng lycorin trong dược liệu và chế phẩm chứa lycorin.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP LYCORIN TỪ NÁNG HOA TRẮNG (CRINUM ASIATICUM ROXB AMARYLLIDACEAE) LÀM CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM Nguyễn Ngọc Quỳnh**, Nguyễn Hữu Phúc**, Trần Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu chiết xuất phân lập lycorin Náng hoa trắng làm chất chuẩn đối chiếu cho nghiên cứu định tính định lượng lycorin dược liệu chế phẩm chứa lycorin Phương pháp: Dược liệu chiết phương pháp ngấm kiệt với cồn 95% bốc áp suất giảm thu cao chiết Cao chiết chiết phân bố lỏng – lỏng với dung mơi có độ phân cực khác thu cao phân đoạn Các phân đoạn tách lập chất tinh khiết phương pháp sắc ký cột cổ điển Chất tinh khiết tinh chế phương pháp kết tinh lại Chất phân lập được, xác định cấu trúc kỹ thuật phổ NMR MS Độ tinh khiết lycorin đánh giá HPLC với detector UV Kết quả: Đã phân lập 3,5 g hợp chất tinh khiết, xác định cấu trúc lycorin kiểm tra độ tinh khiết đạt 99 % Kết luận: Đã phân lập lycorin với độ tinh khiết dùng làm chất chuẩn đối chiếu kiểm nghiệm dược liệu chế phẩm có chứa lycorin Từ khóa: Náng hoa trắng, Crinum asiaticum, lycorin, phân lập, cấu trúc, HPLC-PDA ABSTRACT ISOLATION OF LYCORINE FROM CRINUM ASIATICUM ROXB AMARYLLIDACEAE – ORIENT AS REFERENCE SUBSTANCE Nguyen Ngoc Quynh, Nguyen Huu Phuc, Tran Hung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 602 - 605 Objectives: Extraction and isolation study of lycorine from Crinum asiaticum leaves for using as reference standard for quality control of herbs and lycorine-containing preparations Methods: leaves powder of Crinum asiaticum was percolated with 95% alcohol, percolate obtained was evaporated under reduced pressure to give a liquid extract The extract was fractionated by distribution with solvents The fractions were then chromatographed on silica gel 60 (0.40 – 0.063 mm) Lycorine was isolated, purified and elucidated by NMR spectra The purity of lycorine was determined by HPLC-PDA Results: fractions (Q1, Q2, Q3) were obtained from alcoholic extract of Crinum asiaticum leaves Lycorine (3.5 g) was isolated from fraction Q3 and its purity was detemined as pure as 99 % Conclusions: Lycorine was isolated with the purity suitable for using as reference standard for quality control of herbs and lycorine-containing preparations Key words: Crinum asiaticum, lycorine, isolation, structure, HPLC-PDA đông Đông nam Á, để điều trị viêm khớp ĐẶT VẤN ĐỀ dùng làm thuốc kháng khuẩn(4,5) Náng hoa Náng hoa trắng sử dụng y học cổ trắng biết thuốc chứa nhiều truyền dân gian Việt nam số nước alkaloid số alkaloid nhóm có *Đại học Y Dược TPHCM **Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Tác giả liên hệ: PGS TS Trần Hùng ĐT: 0918057096 Email: tranhung@uphcm.edu.com 602 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 tác dụng kháng viêm, kháng khối u, cải thiện trí nhớ tuổi già, tác dụng y học đại quan tâm đặc biệt(1,2,3,4) Đề tài thực với mục đích phân lập lycorin để sử dụng làm chất chuẩn đối chiếu cho việc xây dựng phương pháp kiểm nghiệm dược liệu, chế phẩm chứa lycorin nghiên cứu tác dụng sinh học lycorin sau NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU - PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Đối tượng Náng hoa trắng thu hái Tp Cần Thơ (tháng 6/2008) Mẫu định danh lưu mẫu Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM Phương pháp nghiên cứu Dược liệu chiết phương pháp ngấm kiệt với dung môi cồn 95%.Cao chiết tách thành phân đoạn đơn giản cách chiết phân bố lỏng – lỏng Sau phân đoạn tách phân lập hợp chất phương pháp sắc ký cột cổ điển, chất tinh khiết tinh chế phương pháp kết tinh lại Cấu trúc chất phân lập xác định phổ MS thực máy Quattro Micro API, phổ NMR với máy Bruker Avance 500 sử dụng CDCl3 Chất phân lập kiểm tra độ tinh khiết sắc ký lỏng áp cao, thực HPLC Hitachi L – 2000 EZChrom Elite, đầu dò UV – Vis, với máy điều kiện sắc ký sau: Cột sắc ký: LiChro Cart RP C18 (250 mm x 4,6 mm, 5μm) Pha động: Ammonium acetat 1% (kl/tt) pH 8,0 – Acetonitril (90: 10) Tốc độ dòng: 1,5ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 20μl Bước sóng phát hiện: 290nm Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng Thời gian phân tích: 18 phút Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Chiết tách hợp chất Náng hoa trắng Bột dược liệu khô (12 kg) làm ẩm cồn 95% khoảng giờ, vào bình ngấm kiệt, sau thêm dung mơi ngập mặt dược liệu khoảng 2-3 cm Ngâm 24 giờ, rút dịch chiết kiểm tra giấy lọc không cho vết vàng cam với thuốc thử Dragendorff Dịch chiết cô thu hồi dung môi thu cao lỏng thêm đồng lượng nước Chiết phân bố lỏng – lỏng cao chiết n-hexan sau chloroform thu cao tương ứng Q1 (20 g), Q2 (15g) Dịch chiết sau chiết với CHCl3 kiềm hóa NH4OH đđ đến pH 10 chiết tiếp CHCl3 cất thu hồi dung môi thu 23 g cao chiết Q3 Phân lập lycorin từ Q3 23 g cao Q3 nhồi lên cột (40 × cm) với 120g Silica gel (0,040-0,063mm), triển khai sắc ký với hệ dung môi chloroform chloroform – methanol với lượng methanol tăng dần Kết thu 11 phân đoạn, phân đoạn VLC-01.6 thu có hàm lượng chất E cao VLC-01.6 thu được để kết tinh phân đoạn sau tinh chế cách kết tinh lại nhiều lần hỗn hợp dung môi CHCl3–MeOH (1:1) 5oC Lọc lấy tinh thể rửa lại nhiều lần MeOH thu tinh thể alkaloid E khơng màu, hình khối nhỏ (3,5 g) Alkaloid E thu được kiểm tra sắc ký lớp mỏng nhiều hệ dung môi, phát đèn UV 365-254 thuốc thử Dragendorff E cho vết sắc ký đồ Xác định cấu trúc hợp chất E E chất kết tinh dạng tinh thể hình khối, khơng màu, có độ phân cực trung bình, tan tốt dung môi DMSO, cho phản ứng đặc trưng alkaloid Cấu trúc M xác định chủ yếu liệu phổ MS cộng hưởng từ hạt nhân 603 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 3,99 Các liệu phổ NMR cho thấy E có 16 HO carbon cho tín hiệu phổ từ 20 ppm – 150 ppm Trong có carbon bậc IV, carbon bậc III, 10 H 5,95 H 104,99 4,85 71,67 145,59 10a 6a 145,48 O 6,69 H 145,15 ppm) 129,60 2,46 4a 129,70 2,52 4,02 11 H N 28,07 2,63 H 53,24 H H H 3,21 2,22 3,34 Tương tác H-H COSY Tương tác H-C HMBC hóa sp2 nối đơi có carbon vòng thơm [δC 106,94 d; δH 6,68 (1H, s) 104,99 d; δH 6,82 (1H, s) ppm] nối đôi Hình Tương tác H C cấu trúc chất E ngồi vòng thơm [δC 118,41 d; δH 5,38 (1H, s) Bảng So sánh độ dịch chuyển hóa học chất E lycorin ppm] carbon sp3 mang nhóm oxy (δC 71,68 70,17 ppm) C E Phổ khối ESI-MS positive cho biết khối 4a δC 70,16 d 71,68 d 118,41 d 141,68 s 60,74 d lượng phân tử E 287 E có số khối lẻ 56,65 t chứng tỏ có số lẻ nguyên tử nitơ phân tử, 6a 10 10a 10b 11 Trong số carbon bậc E, có carbon chuyển dịch vùng trường thấp (δC 100,49 ppm) đặc trưng nhóm methylendioxy tương ứng với cơng thức ngun C16H17NO4 Độ bất bão hòa phân tử tính Với đặc điểm trên, dự đốn E alkaloid có nitơ, vòng thơm, nối đơi ngồi vòng, nhóm methylendioxy, nhóm OH tự vòng có vòng mang nhóm methylendioxy với kiểu cấu trúc lycorin Cấu trúc E xác định lycorin liệu phổ NMR xác nhận so sánh với liệu chuyển dịch hóa học lycorin báo cáo tài liệu(1) Cấu trúc tương tác tìm phổ COSY HMBC E trinh bày Hình Chuyển dịch hóa học proton carbon E, so sánh với lycorin trình bày Bảng 604 2,46 12 H H H 106,94 5,38 141,68 40,15 56,65 H 118,41 60,72 có carbon mang nhóm oxy (δC 145,59 Trong số Carbon bậc III, có carbon lai 10b O 5,95 70,16 dịch vùng trường thấp (δC từ 120 – 150 ppm) đặc trưng carbon lai hóa sp2 Trong số OH H 4,29 H 6,82 carbon bậc II khơng có carbon bậc Tất carbon bậc IV E chuyển H 4,75 12 13 δH ppm 4,29 (1H, s) 3,99 (1H, s) 5,38 (1H, s) 2,63 (1H, d) 4,02 (1H, d); 3,34 (1H, d) 129,70 s 106,94 d 6,69 (1H, s) 145,48 s 145,59 s 104,09 d 6,82 (1H, s) 129,60 s 40,15 d 2,52 (1H, m) 28,07 t 2,46 (2H, m) 3,21 (1H, t); 53,24 t 2,22 (1H, q) 5,96 (1H, s) 100,07 t 5,95 (1H, s) Lycorin(1) δC δH ppm 70,21 d 4,27 (1H, s) 71,72 d 3,97 (1H, s) 118,48 d 5,37 (1H, s) 141,68 s 60,83 d 2,60 (1H, d) 3,32 (1H, d); 56,73 t 4,02 (1H, d) 129,75 s 107,01 d 6,68 (1H, s) 145,20 s 145,65 s 105,06 d 2,50 (1H, s) 129,57 s 40,18 d 2,50 (1H, m) 2,83 t 2,44 (2H, m) 3,18 (1H, t); 5,31 t 2,19 (1H, q) 100,07 t 5,94 (1H, s) Kiểm tra độ tinh khiết lycorin phân lập Lycorin phân lập được xác định độ tinh khiết sắc ký hệ thống sắc ký lỏng cao áp với Detector PDA Kết sắc ký cho thấy lycorin phân lập cho đỉnh sắc ký đồ với độ tinh khiết tương ứng 99 % Kết thể Hình Với độ tinh khiết này, lycorin phân lập làm chất Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 chuẩn nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính định lượng lycorin dược liệu chế phẩm có lycorin 60 60 UV-VIS 50 40 40 30 30 20 20 1.520 10 0 10 12 14 phân tích phổ đại NMR, MS Với độ tinh khiết 99% (HPLC-PDA), lycorin thu làm chất chuẩn sử dụng kiểm nghiệm dược liệu chế phẩm có lycorin Phương pháp định lượng lycorin dược liệu HPLC báo cáo báo sau TÀI LIỆU THAM KHẢO mAU 50 14.193 Lycorine mAU Retention Time Name 10 16 18 Minutes Hình Sắc ký đồ lycorin nồng độ 100μg/ml HPLC nồng độ 100μg/ml KẾT LUẬN Đề tài phân lập lycorin từ Náng hoa trắng với lượng lớn (3,5g) Cấu trúc lycorin xác nhận phương pháp Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học Hitwrayawljid K., Indyk C., Ebyuncghai A.H., Pezzuto J.M., Cordel G.A (1993), Cytotoxic and antimalarial alkaloid from bulbs of Crinum amabile, J Nat Prod., 56(8), 1331-38 Manske R.H.F (1975), Amaryllidaceae alkaloids, The alkaloids chemistry and physiology, XV, Academic Press, 83-164 Satoru Yui, Masaaki Mikami, Mikio Kitahara, Masatoshi Yamazaki (1998), “The inhibitory effect of Lycorine on tumor cell apoptosis induced by polymorphonuclear leukocytederived calprotectin”, Immunopharmacology, 42, 151-162 Tram N T N., Tz.V Titorenkova, V.St Bankova, N.V Handjieva, S.S Popov (2002 ), “Crinum L Amaryllidaceae”, Fitoterapia 73, 183-208 Võ văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, trang 265 605 ... đích phân lập lycorin để sử dụng làm chất chuẩn đối chiếu cho việc xây dựng phương pháp kiểm nghiệm dược liệu, chế phẩm chứa lycorin nghiên cứu tác dụng sinh học lycorin sau NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU... độ phân tích: nhiệt độ phòng Thời gian phân tích: 18 phút Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Chiết tách hợp chất Náng hoa trắng Bột dược liệu khô (12 kg) làm. .. này, lycorin phân lập làm chất Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 chuẩn nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính định lượng lycorin dược liệu chế phẩm có lycorin