Xây dựng được phương pháp phân lập isoflavonoid từ rễ củ Sắn dây bằng nhựa hấp phụ H103. Phương pháp sử dụng nhựa hấp phụ H103 là một phương pháp mới, đơn giản, hiệu quả và kinh tế để phân lập các isoflavonoid từ rễ củ Sắn dây.
EC N KH G NG VI N S C NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP ISOFLAVONOID TỪ RỄ CỦ SẮN DÂY BẰNG NHỰA HẤP PHỤ H103 Vũ Văn Tuấn1, Nguyễn Văn Minh1, Vũ Thị Trâm1, Quách Văn Thắng1 TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng phương pháp phân lập isoflavonoid từ rễ củ Sắn dây nhựa hấp phụ H103 Phương pháp: Phương pháp quang phổ tử ngoại sử dụng để định lượng isoflavonoid toàn phần Khảo sát ảnh hưởng yếu tố: Nồng độ, thể tích dịch hấp phụ, loại dung mơi thể tích dung môi giải hấp phụ đến hiệu suất hàm lượng isoflavonoid sản phẩm phân lập Kết quả: Đã khảo sát lựa chọn điều kiện thích hợp để phân lập isoflavonoid nhựa hấp phụ H103 Kết luận: Phương pháp sử dụng nhựa hấp phụ H103 phương pháp mới, đơn giản, hiệu kinh tế để phân lập isoflavonoid từ rễ củ Sắn dây Từ khóa: Isoflavonoid; nhựa hấp phụ H103; sắn dây SUMMARY: STUDY ON SEPARATION OF ISOFLAVONOIDS FROM PUERARIA ROOT BY USING ADSORBTION H103 RESIN Objective: To establish the method to separate isoflavonoids from kudzu root by using H103 adsorption resin Methods: UV spectrophotometry was applied to determine the total isoflavonoid Study on influence of concentration, volume of adsorption solution, volume and kind of elute on the yield and contents of isoflavonoids in the separation products Results: Parameters were investigated and selected to separate isoflavonoids by using adsorption H103 resin Conclusion: Using H103 adsorption resin was a new, simple, efficient and economic method to separate isoflavonoids from kudzu root Key words: Isoflavonoid; H103 adsorption resin; Kudzu I ĐẶT VẤN ĐỀ Rễ củ Sắn dây dùng y học cổ truyền với tên gọi Cát căn, với tác dụng nhiệt, giải biểu, sinh tân dịch[1], [2], [7] Nhiều nghiên cứu cho thấy thành phần có tác dụng sinh học rễ củ Sắn dây isoflavonoid, chúng biết đến với tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch, [2], [3] Để tăng tác dụng sinh học khả ứng dụng nhóm hoạt chất dạng bào chế đại việc nâng cao hàm lượng hoạt chất, loại bỏ tạp chất công việc thiết yếu Nhựa hấp phụ macroporous nhóm vật liệu phát triển từ nghiên cứu B A Adams E L Holmes năm 1930 Trong năm gần đây, chúng quan tâm nhiều việc ứng dụng để phân lập hợp chất từ thiên nhiên Phương pháp phân lập loại nhựa hướng có nhiều triển vọng tính hiệu quả, đơn giản kinh tế H103 nhựa macroporous có lỗ xốp lớn có đường kính 50nm[6] Nó có cấu trúc khơng phân cực, sử dụng nhiều xử lý nước, thu hồi chất độc chất hữu từ nước thải H103 phù hợp để phân lập hợp chất có nhóm phenol (đặc điểm quan trọng khung cấu trúc isoflavonoid Sắn dây) Nghiên cứu nhằm mục tiêu xây dựng phương pháp phân lập isoflavonoid Sắn dây nhựa hấp phụ H103 II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu thiết bị - Củ Sắn dây tươi năm tuổi thu hái Đơng Hưng, Thái Bình vào tháng 02 năm 2016 Nguyên liệu rửa sạch, thái lát, sấy khô nhiệt độ 70oC Củ sắn khô nghiền nhỏ chiết phương pháp ngâm điều kiện thường với ethanol 60% Chiết lần với tỉ lệ dung môi : nguyên liệu (tt/kl) 10:1 Dịch chiết tập trung cô chân không đến thể chất cao đặc Cao sử dụng để pha dung dịch isoflavonoid Sắn dây dùng cho thí nghiệm nghiên cứu Trường Đại học Đại Nam Tác giả Vũ Văn Tuấn: tuanvv@dainam.edu.vn Ngày nhận bài: 01/05/2020 Ngày phản biện: 15/05/2020 Ngày duyệt đăng: 23/05/2020 SỐ (57) - Tháng 07-08/2020 Website: yhoccongdong.vn 41 JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE - Nhựa hấp phụ H103 có diện tích bề mặt 11001200m2/g, đường kính lỗ xốp trung bình 86 - 95Å, tỷ trọng ướt 0,70 - 0,80 g/ml Nhựa cung cấp công ty Anhui Sanxing Resin Technology Co., Ltd (Trung Quốc) - Hóa chất: Ethanol 96% (TCCS, Việt Nam); - Chất chuẩn Puerarin (C21H20O9) (Nguồn gốc: Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.; Hàm lượng: 99,2 % nguyên trạng); - Thiết bị: Máy quang phổ JASCO V730 (Nhật Bản), cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thuỵ Sỹ) có độ xác 0,1mg Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp định lượng: Hàm lượng isoflavonoid mẫu phân tích xác định phương pháp quang phổ tử ngoại Dung dịch thử pha lỗng cách hịa tan mẫu phân tích ethanol 70% pha lỗng nước đến nồng độ nằm khoảng tuyến tính (1,6-8,0 µg/ml, R2=0,9998) Dung dịch puerarin 4,0 µg/ml sử dụng làm chuẩn So sánh độ hấp thụ 250nm dung dịch thử dung dịch chuẩn để tính nồng độ isoflavonoid mẫu[8] Nồng độ isoflavonoid dung dịch thử tính theo puerarin Trong đó: CS nồng độ puerarin dung dịch chuẩn đo quang (µg/ml), AT, AS độ hấp thụ dung dịch thử dung dịch chuẩn - Phương pháp phân lập [4], [5]: + Lựa chọn dung môi hấp phụ: Dựa khả hấp phụ tĩnh nước dung dịch ethanol có nồng độ khác 10 bình nón có nút mài thêm vào bình 30ml dung dịch isoflavonoid Sắn dây dung môi nước ethanol nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 96% Thêm vào bình nón 1,0 gam nhựa H103 (tính theo khối lượng ướt) Các bình nón lắc nhẹ máy lắc để trình đạt cân Nồng độ isoflavonoid dung dịch trước sau hấp phụ xác định Dung lượng hấp phụ nhựa H103 (Q) tính theo cơng thức: 30 Trong đó: Cb, Ca nồng độ isoflavonoid dung dịch trước sau hấp phụ (mg/ml); mr khối lương nhựa H103 cho vào bình nón (gam) + Khảo sát trình hấp phụ: Một cột thủy tinh (3 x 60cm) chuẩn bị Nhồi vào cột 80 gam nhựa H103, chiều cao nhựa cột 25cm, thể tích khối nhựa cột BV=150cm3 Các dung dịch isoflavonoid Sắn dây có nồng độ 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 mg/ml cho chảy qua cột với tốc độ không đổi 4BV/giờ Theo dõi nồng độ isoflavonoid dịch sau cột phương pháp quang phổ từ ngoại + Lựa chọn dung môi giải hấp phụ: 10g nhựa H103 thêm vào cốc có chứa 300ml dung dịch isoflavonoid Sắn dây nước nồng độ 3,0 mg/ml Cốc khuấy từ 100 vịng/phút để q trình hấp phụ đạt cân Lọc lấy nhựa, cân vào bình định mức 100ml có nút mài, bình 1,0 gam nhựa vừa lọc Thêm vào bình nón 30ml nước ethanol 10, 30, 50, 70, 96% Lắc nhẹ bình máy lắc Xác định nồng độ isoflavonoid dung dịch trước, sau hấp phụ dung dịch giải hấp phụ + Khảo sát trình hấp phụ: Sau hấp phụ theo điều kiện thích hợp khảo sát, cột nhựa giải hấp phụ cách cho dung mơi thích hợp qua cột với tốc độ không đổi 2BV/giờ Xác định nồng độ isoflavonoid dịch sau cột để xác định điểm giải hấp phụ III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết lựa chọn dung môi hấp phụ Thêm vào 10 bình nón có nút mài dung dịch isoflavonoid Sắn dây 3mg/ml có nồng độ ethanol tăng dần từ 10 đến 96% Cân vào bình nón xác 1,0gam nhựa H103 xử lý, đạy nắp lắc nhẹ máy lắc Xác định nồng độ isoflavonoid dung dịch trước sau hấp phụ để tính dung lượng hấp phụ Kết thể Hình Hình 1: Ảnh hưởng nồng độ ethanol dịch nạp đến khả hấp phụ 42 SỐ (57) - Tháng 07-08/2020 Website: yhoccongdong.vn 2020 EC N KH G NG VI N S C NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Kết Hình cho thấy: Khi tăng nồng độ ethanol nước từ lên 70% dung lượng hấp phụ tĩnh giảm từ 32,00 xuống 10,38 mg/g Tiếp tục tăng nồng độ ethanol dịch hấp phụ từ 70 lên 96% dung lượng hấp phụ tĩnh tăng lên 13,53mg/g Dung lượng hấp phụ tĩnh nhựa cao nước (32 mg/g) thấp ethanol 70% (10,38mg/g) Vì vậy, nước chọn làm dung môi hấp phụ isoflavonoid Sắn dây lên nhựa H103 Kết khảo sát trình hấp phụ So sánh trình hấp phụ dung dịch isoflavonoid nồng độ tăng dần từ 0,5 đến mg/ml Điểm dừng trình hấp phụ thể tích dịch nạp nồng độ isoflavonoid dịch sau cột đạt cân Kết thể Hình Hình 2: Ảnh hưởng nồng độ dịch nạp đến dung lượng hiệu suất hấp phụ Khi tăng nồng độ dịch nạp từ 0,5 lên 5,0 dung lượng hấp phụ nhựa tăng nhanh từ 18,88 lên 45,18mg/g Ngược lại, hiệu suất hấp phụ lại giảm nhẹ từ 49,5 xuống 46,8% Để tối ưu hóa trình hấp phụ, nồng độ dịch nạp xác định 5,0mg/ml Khảo sát trình giải hấp phụ So sánh khả giải hấp phụ dung dịch ethanol nước có nồng độ khác Kết thể Hình Hình 3: Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến khả giải hấp phụ Kết hình cho thấy: Khi nồng độ ethanol tăng từ lên 70% tỉ lệ giải hấp phụ tăng từ 27,7 lên 60,55% Nếu tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 96% tỉ lệ hấp phụ lại giảm xuống 32,02% Khả giải hấp phụ nước thấp sử dụng để loại tạp chất, khả giải hấp phụ ethanol 70% tốt nên chọn làm dung môi giải hấp phụ isoflavonoid Sắn dây từ nhựa H103 Kết loại tạp nước giải hấp phụ ethanol 70% thể hình hình SỐ (57) - Tháng 07-08/2020 Website: yhoccongdong.vn 43 2020 JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE Hình Ảnh hưởng thể tích nước rửa đến hàm lượng IF cắn Hình trình giải hấp phụ nước, thể tích nước tăng lên đến 1,5 lần thể tích nhựa cột (BV) hàm lượng isflavonoid (IF) cắn cô từ dịch sau cột đạt tối đa, tiếp tục tăng thể tích nước rửa khơng làm tăng hàm lượng IF cắn từ dịch sau cột Vì vậy, thể tích nước cần cho q trình rửa cột 1,5 BV Hình Ảnh hưởng thể tích ethanol 70% đến hiệu suất giải hấp phụ Kết hình cho thấy: Khi thể tích ethanol 70% sử dụng tăng lên nồng độ IF dịch sau cột giảm dần tiến không Sau giải hấp phụ 10BV ethanol 70% nồng độ ethanol cịn lại khơng đáng kể (0,14mg/ml Vì vậy, q trình giải hấp phụ dừng lại thời điểm 10BV Tiến hành phân lập isoflavonoid từ Sắn dây nhựa hấp phụ H103 quy mô 20kg nguyên liệu / mẻ Kết thể bảng Bảng 1: Kết phân lập IF Sắn dây quy mô 20kg nguyên liệu/mẻ Rễ củ Sắn dây Cao đặc cô từ dịch chiết Isoflavonoid Sắn dây 17800 1185 34 1,17 6,28 56,34 Khối lượng (g) Hàm lượng IF tính theo khối lượng khô (%) Kết bảng cho thấy: Sau trình phân lập, hàm lượng isflavonoid sản phẩm phân lập 56,34% Kết cao 48 lần rễ củ Sắn dây 44 SỐ (57) - Tháng 07-08/2020 Website: yhoccongdong.vn (1,17%) cao gần lần cao cô đặc từ dịch chiết Sắn dây (6,28%) EC N KH G NG VI N S C NGHIÊN CỨU KHOA HỌC IV KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân lập isoflavonoid Sắn dây nhựa hấp phụ H103 Theo đó, 10BV dịch chiết Sắn dây có nồng độ 5,0mg/ml nước cho chảy cột nhựa H103, giải hấp phụ với 1,5BV nước 10BV ethanol 70% Thu lấy dịch giải hấp phụ ethanol, cô loại dung môi để thu sản phẩm Sản phẩm phân lập có hàm lượng IF tồn phần đạt 56,34% tính theo puerarin TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học Hà Nội, tr 1310 Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc, tập 2, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, tr 680-686 Chen S et al (2007), “Seasonal Variations in the isoflavonoids of radix Puerariae”, Phytochemical analysis, 18, pp.245-250 Guo H.D et al (2015), “Large scale purification of puerarin from Puerariae Lobatae Radixthrough resins adsorption and acid hydrolysis”, Journal of chromatography B, 980, pp.8-15 He X et al (2004), “Separation and purification of puerarin using cyclodextrin-coupled agarose gel media”, J Chromatogr A, 1022, pp.77-82 Li J., Howard A.C (2010), “Development of adsorptive (non-ionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologically-active natural products from plant sources”, Natural product reports, 27, pp.1493–1510 The State Pharmacopoeia commission (2010), Pharmacopoeia of the people’s republic of china, vol I, pp.469-503 Zhang Z.T et al (1991), “Studies on isoflavonoid constituents of roots of Qinmountain Taibai Pueraria lobata”, Chinese pharmaceutical journal, 34 (5), pp.301-302 SỐ (57) - Tháng 07-08/2020 Website: yhoccongdong.vn 45 ... C NGHIÊN CỨU KHOA HỌC IV KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân lập isoflavonoid Sắn dây nhựa hấp phụ H103 Theo đó, 10BV dịch chiết Sắn dây có nồng độ 5,0mg/ml nước cho chảy cột nhựa H103, ... làm dung môi hấp phụ isoflavonoid Sắn dây lên nhựa H103 Kết khảo sát trình hấp phụ So sánh trình hấp phụ dung dịch isoflavonoid nồng độ tăng dần từ 0,5 đến mg/ml Điểm dừng trình hấp phụ thể tích... giải hấp phụ 10BV ethanol 70% nồng độ ethanol cịn lại khơng đáng kể (0,14mg/ml Vì vậy, q trình giải hấp phụ dừng lại thời điểm 10BV Tiến hành phân lập isoflavonoid từ Sắn dây nhựa hấp phụ H103