Nghiên cứu phân lập thành công 2 flavonoid từ khổ sâm bắc tại Việt Nam. 2 chất phân lập được có tác dụng sinh học đáng chú ý Xây dựng sơ bộ quy trình định lượng 2 chất này trong khổ sâm bắc Thực hiện đề tài tại Viên kiểm nghiệm thuốc TP.HCM
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỮU MINH QUÂN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT FLAVONOID TỪ KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỮU MINH QUÂN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT FLAVONOID TỪ KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS Trần Anh Vũ DS Phan Nguyễn Trƣờng Thắng Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 XÁC NHẬN CỦA GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN Nội dung TĨM TẮT Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ đại học – Năm học 2017-2018 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT FLAVONOID TỪ KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.) NGUYỄN HỮU MINH QUÂN Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS Trần Anh Vũ DS Phan Nguyễn Trƣờng Thắng Đặt vấn đề Khổ sâm bắc có thành phần chủ yếu alkaloid flavonoid từ lâu đƣợc sử dụng y học Trung Hoa để chữa nhiều bệnh, đồng thời dƣợc điển Hồng Kơng 2012 có chun luận khổ sâm bắc dựa thành phần alkaloid Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy thành phần flavonoid khổ sâm bắc có nhiều tác dụng sinh học đáng ý đƣợc nhiều nhà nghiên cứu đề nghị cần đánh giá thành phần flavonoid kiểm nghiệm dƣợc liệu Do đó, đề tài tiến hành phân lập flavonoid từ rễ khổ sâm bắc để có nguồn chất đối chiếu cho việc đánh giá Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu Đối tượng: Rễ khổ sâm bắc Công ty cổ phần sản xuất chế biến nông lâm sản Dƣợc liệu Đăk Nông, thu hái tháng 7/2017, đƣợc định danh kỹ thuật DNA nhóm nghiên cứu 2017 Phương pháp nghiên cứu: (1) Chiết xuất, phân lập tinh chế flavonoid từ rễ khổ sâm bắc (2) Kiểm tra tinh khiết xác định cấu trúc chất thu đƣợc phƣơng pháp phổ nghiệm (3) Xác định hàm lƣợng chất phân lập phƣơng pháp quy phần trăm diện tích peak HPLC với quy trình đƣợc thẩm định Kết (1) Từ 4,05 kg rễ khổ sâm bắc chiết đƣợc 903 g cao ethanol toàn phần Từ 302 g cao ethanol toàn phần thu đƣợc 3,30 g cao phân đoạn Từ cao phân đoạn tinh chế thu đƣợc 316 mg SF1 91 mg SF2 (2) Xác định cấu trúc SF1 SF2 phƣơng pháp phổ nghiệm lần lƣợt isoxanthohumol sophoraflavanone G (3) Hàm lƣợng theo phƣơng pháp quy phần trăm diện tích peak HPLC cùa isoxanthohumol sophoraflavanone G phân lập lần lƣợt 98,76% 95,70% với quy trình đƣợc thẩm định đạt tƣơng thích hệ thống, đƣờng tuyến tính, độ đặc hiệu, độ lặp lại độ xác trung gian Kết luận Phân lập thành công flavonoid với độ tinh khiết cao, xác định đƣợc cấu trúc thu đƣợc lƣợng đáng kể để tiếp tục thiết lập chất đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm thành phần flavonoid rễ khổ sâm bắc ABSTRACT Final essay for the degree of BS Pharm – Academy year: 2017-2018 STUDY ON ISOLATION OF A FLAVONOID CONSTITUENT FROM KUSHEN (Sophora flavescens Ait.) NGUYEN HUU MINH QUAN Supervisor: Assoc Prof Dr Tran Anh Vu Ph Phan Nguyen Truong Thang Introduction Sophora flavescens Ait has two main constituents are alkaloids and flavonoids and has been used in oriental medicines in China for thousands years to treat various of diseases, and Hong Kong pharmacopeia 2012 has a monograph for Sophora flavescens in evaluating alkaloids constituents However, it has been recently recorded by lots of scientists that the remarkably biological effects of flavonoids constituents and they has also suggested the requirement for assessing the quality of Sophora flavescens in flavonoids contents According to this issue, we conduct a study on isolation of a flavonoid constituent from root of Sophora flavescens Materials and methods Materials: Roots of Sophora flavescens was collected in Dak Nong in July, 2017 Methods: (1) Extract, isolate and pure one flavonoid from roots of Sophora flavescens (2) Test for purity and identify structure of isolated substances (3) Determine the content of isolated compounds by calculating percentage of peak area on High performance liquid chromatography method, the using method is validated Results (1) 903 g ethanol extract from 4,05 kg Roots of Sophora flavescens was chromatographed to acquire 3,3 g IV fraction This fraction continued to chormatograph and pure on HPLC preparation to acquire 316 mg SF1 and 91 mg SF2 (2) Identify structures of isolated compounds by NMR spectrum was carried out to define SF1 is isoxanthohumol and SF2 is sophoraflavanone G (3) The content of isolated isoxanthohumol and sophoraflavanone G by calculating percentage of peak area on HPLC method were determined respectively as 98,76% and 95,70% The using method was completely validated Conclusion Isolate successfully flavonoids compounds from roots of Sophora flavescens with high purity, determined structures and significant amounts to establish references standards for evaluating quality of flavonoid contents in roots of Sophora flavescens Khóa luận tốt nghiệp DSĐH MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH & SƠ ĐỒ vi CHƢƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan khổ sâm bắc 2.1.1 Tổng quan thực vật học 2.1.2 Tổng quan thành phần hóa học 2.1.3 Tác dụng dƣợc lý .6 2.1.4 Công dụng liều dùng 2.2 Các phƣơng pháp chiết xuất phân lập .8 2.2.1 Các phƣơng pháp chiết xuất 2.2.2 Các phƣơng pháp phân lập, tinh chế 2.2.3 Các phƣơng pháp đánh giá hợp chất phân lập đƣợc CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu .13 3.1.1 Nguyên liệu .13 3.1.2 Hóa chất, dung mơi 13 3.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị .13 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 3.2.1 Chiết xuất, phân lập tinh chế flavonoid 14 3.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trúc chất phân lập 16 3.2.3 Xây dựng quy trình xác định hàm lƣợng chất phân lập phƣơng pháp HPLC quy phần trăm diện tích peak 17 3.2.4 Sơ xác định hàm lƣợng chất phân lập dƣợc liệu rễ khổ sâm .19 i Khóa luận tốt nghiệp DSĐH CHƢƠNG KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 21 4.1 Chiết xuất, phân lập tinh chế flavonoid .21 4.1.1 Khảo sát dung môi chiết xuất 21 4.1.2 Chiết xuất cao rễ khổ sâm bắc 22 4.1.3 Phân lập flavonoid 22 4.2 Kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trúc hợp chất phân lập 29 4.2.1 Đánh giá hợp chất SF1 phân lập 29 4.2.2 Đánh giá hợp chất SF2 phân lập 35 4.3 Xây dựng quy trình xác định hàm lƣợng chất phân lập phƣơng pháp HPLC quy phần trăm diện tích peak 41 4.3.1 Xác định hàm lƣợng hợp chất isoxanthohumol (SF1) phân lập đƣợc .41 4.3.2 Xây dựng quy trình xác định hàm lƣợng hợp chất sophoraflavanone G (SF2) phân lập đƣợc 48 4.4 Sơ xác định hàm lƣợng isoxanthohumol sophoraflavanone G dƣợc liệu rễ khổ sâm 54 4.4.1 Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu .54 4.4.2 Tiến hành định lƣợng sơ isoxanthohumol sophoraflavanone G dƣợc liệu 54 CHƢƠNG KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 58 5.1 Kết luận 58 5.2 Đề nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 ii Khóa luận tốt nghiệp DSĐH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Từ nguyên 13 13 C-NMR H-NMR ngh a tiếng Việt C - Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân C13 H - Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân proton BĐM Bình định mức Bình định mức DCM Dichloromathane Diclorometan DĐHK Dƣợc điển Hồng Kông Dƣợc điển Hồng Kông DMSO Dimethyl sulfoxide Dimetyl sulfoxid DSC Differential scanning calorimetry Phân tích nhiệt quét vi sai EC50 Half maximal effective concentration Nồng độ có hoạt tính tối đa 50% đối tƣợng thử nghiệm EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat HPLC High performance chromatography HSV Herpes simplex virus Virus herpes đơn dạng IC50 Half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối đa 50% đối tƣợng thử nghiệm IR Infrared Spectroscopy Phƣơng pháp phổ hồng ngoại MeOH Methanol Methanol MS Mass spectrum Khối phổ n-Bu n-Butanol n-Butanol NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân PA Pure analyses Tinh khiết phân tích PDA Photodiod Array Dãy diod quang PE Petrolium Ether Ete dẩu hỏa RP-18 Reverse phase - 18 Pha tỉnh đảo cho sắc ký RSV Respiratory Syncytial Virus Virus hợp bào hô hấp SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng liquid Sắc ký lỏng hiệu cao iii Khóa luận tốt nghiệp DSĐH DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số cấu trúc flavonoid đáng ý Sophora flavescens .4 Bảng 2.2 Cấu trúc số isoflavon bật có tác dụng sinh học Sophora flavescens Bảng 2.3 Một số cơng trình nghiên cứu phân lập flavonoid từ rễ khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait 10 Bảng 4.4 Khối lƣợng cắn thu đƣợc với dung môi chiết khác 21 Bảng 4.5 Các phân đoạn sắc ký cột từ cao ethanol toàn phần 22 Bảng 4.6 Các phân đoạn sắc ký cột từ cao phân đoạn IV 24 Bảng 4.7 Chƣơng trình pha động sắc ký phân đoạn C 25 Bảng 4.8 Các thơng số thăm dò điều kiện sắc ký HPLC điều chế phân đoạn C .26 Bảng 4.9 Chƣơng trình pha động định tính SF1 30 Bảng 4.10 Bảng so sánh số khối lý thuyết số khối chất SF1 32 Bảng 4.11 Bảng so sánh phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6, ppm 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6, ppm) SF1 isoxanthohumol .34 Bảng 4.12 Chƣơng trình pha động định tính SF2 36 Bảng 4.13 Bảng so sánh số khối lý thuyết số khối chất SF2 .38 Bảng 4.14 Bảng so sánh phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6, ppm 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6, ppm) SF2 với phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6, ppm 1H-NMR (300MHz, DMSO-d6, ppm) sophoraflavanone G [29].40 Bảng 4.15 Chƣơng trình pha động định lƣợng SF1 41 Bảng 4.16 Các thông số sắc ký tƣơng ứng với đỉnh SF1 sau sáu lần tiêm liên tiếp (n=6) 42 Bảng 4.17 Chuẩn bị mẫu cho khảo sát khoảng tuyến tính .44 Bảng 4.18 Kết tuyến tính diện tích đỉnh theo nồng độ mẫu thử 44 Bảng 4.19 Chuẩn bị mẫu cho thẩm định độ lặp lại 45 Bảng 4.20 Kết thẩm định độ lặp lại quy trình xác định hàm lƣợng isoxanthohumol 45 Bảng 4.21 Chuẩn bị mẫu cho thẩm định độ tái lập 46 iv Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Bảng 4.22 Kết thẩm định độ tái lập quy trình xác định hàm lƣợng isoxanthohumol 46 Bảng 4.23 Kết độ xác trung gian ngày hệ thống HPLC khác 47 Bảng 4.24 Kết hàm lƣợng isoxanthohumol phân lập 47 Bảng 4.25 Các thông số sắc ký tƣơng ứng với đỉnh SF2 sau sáu lần tiêm liên tiếp (n=6) 48 Bảng 4.26 Chuẩn bị mẫu cho khảo sát khoảng tuyến tính .50 Bảng 4.27 Kết tuyến tính diện tích đỉnh theo nồng độ mẫu thử sophoraflavanone G 50 Bảng 4.28 Chuẩn bị mẫu cho thẩm định độ lặp lại 51 Bảng 4.29 Kết thẩm định độ lặp lại quy trình xác định hàm lƣợng sophoraflavanone G 51 Bảng 4.30 Chuẩn bị mẫu cho thẩm định độ tái lập 52 Bảng 4.31 Kết thẩm định độ tái lập quy trình xác định hàm lƣợng isoxanthohumol 52 Bảng 4.32 Kết độ xác trung gian ngày hệ thống HPLC khác 53 Bảng 4.33 Kết hàm lƣợng sophoraflavanone G phân lập 53 Bảng 4.34 Chƣơng trình pha động 54 Bảng 4.35 Các thông số sắc ký tƣơng ứng với đỉnh isoxanthohumol sau sáu lần tiêm liên tiếp (n=6) 55 Bảng 4.36 Các thông số sắc ký tƣơng ứng với đỉnh sophoraflavanone G sau sáu lần tiêm liên tiếp (n=6) 55 Bảng 4.37 Kết thí nghiệm định lƣợng sơ isoxanthohumol (SF1) sophoraflavanone G (SF2) dƣợc liệu .56 v Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PL.42 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PHỤ LỤC 15 Số liệu thô độ lặp lại thẩm định quy trình xác định hàm lƣợng SF1 PHỤ LỤC 16 Số liệu thơ độ xác trung gian thẩm định quy trình xác định hàm lƣợng SF1 PL.43 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH PHỤ LỤC 17 Phụ lục Sắc ký đồ số liệu thơ tính tƣơng thích hệ thống thẩm định quy trình xác định hàm lƣợng SF2 PL.44 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PL.45 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PL.46 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH PHỤ LỤC 18 Phụ lục Sắc ký đồ số liệu thơ tính tuyến tính thẩm định quy trình xác định hàm lƣợng SF2 PL.47 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PL.48 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PHỤ LỤC 19 Số liệu thơ độ lặp lại thẩm định quy trình xác định hàm lƣợng SF2 PHỤ LỤC 20 Số liệu thơ độ xác trung gian thẩm định quy trình xác định hàm lƣợng SF2 PL.49 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH PHỤ LỤC 21 Phụ lục Sắc ký đồ số liệu thơ tính tƣơng thích hệ thống hỗn hợp chuẩn isoxanthohumol sophoraflavanone G PL.50 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PL.51 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PL.52 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH PHỤ LỤC 22 Phụ lục Sắc ký đồ số liệu thơ kết thí nghiệm định lƣợng sơ isoxanthohumol sophoraflavanone G dƣợc liệu PL.53 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PL.54 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PL.55 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Phụ lục PL.56 ... tầm quan trọng nhóm hợp chất flavonoid với vấn đề đánh giá tồn diện dƣợc liệu khổ sâm bắc, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài Nghiên cứu phân lập flavonoid từ khổ sâm bắc (Sophora flavescens Ait.)”... quát phân lập flavonoid từ rễ khổ sâm bắc .15 Hình 2.1 Cây khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait Hình 2.2 Nhóm isoprenyl lavandulyl flavonoid Hình 2.3 Cấu trúc số pterocarpan từ rễ khổ sâm. .. 2017-2018 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT FLAVONOID TỪ KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.) NGUYỄN HỮU MINH QUÂN Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS Trần Anh Vũ DS Phan Nguyễn Trƣờng Thắng Đặt vấn đề Khổ sâm bắc