PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC SAPOGENIN VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SAPONIN TRONG LÁ CHÂN CHIM LEO (Schefflera elliptica (Bl.) Harms)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH **************** PHAN THỊ QUỐC KHÁNH PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC SAPOGENIN VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SAPONIN TRONG LÁ CHÂN CHIM LEO (Schefflera elliptica (Bl.) Harms) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 02/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH **************** PHAN THỊ QUỐC KHÁNH PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC SAPOGENIN VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SAPONIN TRONG LÁ CHÂN CHIM LEO (Schefflera elliptica (Bl.) Harms) Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hướng dẫn Khoa học: PGS.TS TRẦN CÔNG LUẬN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 02/2012 PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC SAPOGENIN VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SAPONIN TRONG LÁ CHÂN CHIM LEO (Schefflera elliptica (Bl.) Harms) PHAN THỊ QUỐC KHÁNH Hội đồng chấm luận văn Chủ tịch: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Thư ký: TS TRẦN THỊ LỆ MINH Phản biện 1: TS BÙI MINH TRÍ Phản biện 2: TS VƯƠNG ĐÌNH TUẤN Ủy viên: PGS.TS TRẦN CÔNG LUẬN ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tơi tên Phan Thị Quốc Khánh sinh ngày 01 tháng 09 năm 1983 huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh Con Ơng Phan Văn Liệt Bà Đào Thị Bé Tốt nghiệp Tú tài Trường Trung học phổ thơng Bình Khánh, thành phố Hồ Chí Minh, năm 2001 Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ Sinh học, hệ quy Đại học Nơng Lâm, thành phố Hồ Chí Minh, năm 2006 Từ năm 2007 đến theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học Đại học Nơng Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: Chồng Đỗ Duy Tuấn, kết hôn năm 2009; Đỗ Phan Diệu Khánh, sinh năm 2010 Địa liên lạc: 664 Bình Trường, Bình Khánh, Cần Giờ, TP.HCM Điện thoại: 0932.190.019 Email: khanhquc@gmail.com ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Ký tên Phan Thị Quốc Khánh iii LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến: Quý Thầy Cô trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM tận tâm hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập PGS.TS Trần Công Luận tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành luận văn Các q Thầy Cơ, anh chị, em phòng Hoá - chế phẩm Trung tâm Sâm Dược liệu Tp.HCM giúp đỡ tạo điều kiện cho trình thực luận văn Quý nhà trường, Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Phòng Sau đại học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa học Gia đình bạn bè động viên, chia sẻ góp ý cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu iv TĨM TẮT Đề tài “Phân lập, xác định cấu trúc sapogenin xác định hàm lượng saponin Chân chim leo (Schefflera elliptica (Bl.) Harms” tiến hành Trung tâm Sâm Dược liệu Tp.HCM, thời gian từ tháng 08/2009 đến tháng 04/2011 Mục tiêu đề tài phân lập xác định cấu trúc hợp chất sapogenin thành phần hợp chất saponin Chân chim leo; xây dựng quy trình định lượng saponin phương pháp đo quang dựa đường chuẩn acid oleanolic, sapogenin chủ yếu thành phần saponin Chân chim leo Qua xác định thời điểm thu hái nguyên liệu Chân chim leo có hàm lượng saponin tốt thành phố Hồ Chí Minh Các kỹ thuật sử dụng đề tài bao gồm: Chiết rắn-lỏng, lỏng-lỏng, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ tử ngoại khả kiến Kết thực đề tài chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc sapogenin acid oleanolic acid betulinic thủy phân từ hợp chất saponin toàn phần Chân chim leo Acid oleanolic sapogenin chủ yếu thành phần saponin Chân chim leo Acid betulinic sapogenin thứ yếu thành phần saponin Chân chim leo, phân lập từ Chân Chim leo lần đầu tiên, đánh giá hợp chất có tiềm phòng điều trị bệnh ung thư Đề tài xây dựng quy trình định lượng saponin phương pháp đo quang dựa đường chuẩn acid oleanolic, qua theo dõi biến động q trình tích lũy hợp chất saponin Chân chim leo, xác định thành phố Hồ Chí Minh thời điểm thu hái Chân chim leo có hàm lượng saponin cao vào tháng đầu năm từ tháng đến tháng v SUMMARY The thesis “Isolation, identification the structure of sapogenins and quantification of saponin in Schefflera elliptica (Bl.) Harms leaves” was conducted and experimented at the Research Center of Ginseng and Medicinal Materials in Ho Chi Minh from August, 2009 to April, 2011 by means of solid-liquid extraction, liquid-liquid extraction, column chromatography, preparative thin-layer chromatography, NMR spectroscopy and UV-Vis spectroscopy techniques The purpose of the project is to isolate, to identificate, at least, two sapogenins in the hydrolyzed saponin of S elliptica leaves and to construct a quantitative determination based on the calibration curve of oleanolic acid, the main sapogenin of saponin composition of S elliptica leaves Therefore, it can indicate the time for harvesting S elliptica leaves with its best content of saponin in Ho Chi Minh City The results showed that extractions, isolations identificated structures of the two sapogenins being oleanolic acid and betulinic acid which were hydrolyzed from the total saponin in S elliptica leaves Oleanolic acid is the main sapogenin in the composition of saponin of S elliptica leaves Betulinic acid is the secondary sapogenin in the composition of saponin of Schefflera elliptica leaves, but it is the first time isolated from S elliptica leaves, and is also known as a compound being able to potentially prevent and treat cancer Finally, the quantitative process of saponin component was built by the colorimetry method based on the calibration curve of oleanolic acid thereby monitoring the variation during the process of accumulating the saponin compound in S elliptica leaves from January 2010 to December 2010 It indicates that in Ho Chi Minh City, the time for harvesting S elliptica leaves with its highest content of saponin is from January until April vi MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Trang Chuẩn Y i Lý lịch cá nhân ii Lời cam đoan iii Lời cảm ơn iv Tóm tắt v Summary vi Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt xi Danh sách hình xiii Danh sách bảng xiv MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu .3 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan Chân chim leo (Schefflera elliptica (Bl.) Harms) 2.1.1 Họ Nhân sâm (Araliaceae) 2.1.2 Chi Schefflera 2.1.3 Loài Chân chim leo 11 vii 2.1.3.1 Phân loại .11 2.1.3.2 Đặc điểm sinh học 11 2.1.3.3 Điều kiện sinh trưởng phân bố 11 2.1.3.4 Công dụng 12 2.2 Đại cương saponin 12 2.2.1 Đặc điểm tính chất saponin 12 2.2.2 Hoạt tính saponin 15 2.3 Phương pháp cô lập hợp chất hữu 15 2.3.1 Sắc ký hấp phụ 16 2.3.1.1 Sắc ký cột .16 2.3.1.2 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) 16 2.3.2 Sắc ký phân bố 17 2.4 Phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc hợp chất hữu .18 2.5 Phương pháp phổ UV-Vis dùng phân tích định lượng 19 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 3.1.1 Thời gian 20 3.1.2 Địa điểm 20 3.2 Vật liệu thiết bị 21 3.2.1 Mẫu thí nghiệm .21 3.2.2 Hóa chất 21 3.2.3 Dụng cụ thiết bị 21 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu .22 3.3.1 Chiết xuất saponin từ Chân chim leo 22 viii 21 Macias F.A., Simonet A.M., Esteban M.D., 1994 Potential allelopathic lupane triterpenes from bioactive fractions of Melilotus messanensis Phytochemistry 36 (6): 1369 - 1379 22 Madea C., Ohtani K., Kasai R., Yamashaki K., Duc N.M., Nham N.T., Cu N.K.Q., 1994 Oleanane and ursane glycosides from Schefflera octaphylla Phytochemistry 37 (4): 1131 - 1137 23 Matsunaga H., Katano M., Yamamoto H., Mori M, Takata K., 1989 Studies on the panaxatriol of Panax ginseng C.A Meyer Isolation, determination and antitumor activity Chem Pharm Bull 37: 1279 - 1281 24 Namba T., Yoshizaki M., Tomimori T., Kobashi K., Mitsui K., Hase J., 1974 Fundamental studies on the evaluation of the crude drugs III, Chemical and biochemical evaluation of ginseng and related crude drugs Yakugaku Zasshi 92 (2): 252 - 259 25 Pancharoen O., Tuntiwachwuttikul P., Walter C., Taylor K., Picker K., 1994 Triterpenoid glycosides from Schefflera leucantha Phytochemistry 35 (4): 978 -992 26 Prakash C.V.S., Schilling J.K., Johnson R.K., Kingston D.G., 2003 New cytotoxic lupane triterpenoids from the twigs of Coussarea paniculata J Nat Pro 66: 419 27 Srivastava S K and Jain D C., 1989 Triterpenoid saponins from plants of Araliaceae Phytochemistry, 28 (2): 644 - 647 28 Sung T.V., Lavaud C., Porzel A., Steglich W., Adam G., 1992 Triterpenoids and their glycosides from the bark of Schefflera octophylla Phytochemistry 31 (1): 227 - 231 29 Sung T.V., Steglich W., Adam G., 1991 Triterpene glycosides from Schefflera octophylla Phytochemistry 30 (7): 2349 - 2356 63 30 Thurnher D., Turhani D., Pelzmann M., Wannamacher B., Knerer B., Formanek M., Wacheck V., Selzer E., 2003 Betulinic acid A ner cytotoxci compound against malignant head and neck cancer cell lines Head Neck 25: 32 - 40 31 Tommasi N.D., Autore G., Bellino A., Pinto A., Pizza C., Sorrentino R., Venturella P., 2000 Antiproliferative Triterpene Saponins from Trevesia palmata J Nat Prod 63 (3): 308 - 314 32 Yamashita K., Lu H., Lu J., Chen G., Yokoyama T., Sagara Y., Manabe M., Kodama H., 2002 Effect of three triterpenoids, lupeol, betulin, and betulinic acid on the stimulus - induced superoxide generation and tyrosyl phosphorylation of proteins in human neutrophils.Clin Chim Acta 325: 91 33 Yu S., Cai Y.M., Yiao L., Yang L., Sheng C.M., 2008 Facile synthesis of oleanolic acid monoglycosides and diglycosides Molecules 13: 1472 - 1486 34 Zuco V., Supino R., Righetti S., Cleris L., Marchesi E., Gambacorti P.C., Formelli F., 2002 Selective cytotoxic of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells Cancer Lett 175: 17 - 25 64 PHỤ LỤC Phổ IR SG1 (Đo khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Tp.HCM) 65 PHỤ LỤC Phổ 13C-NMR SG1 (Đo Viện Hóa học – Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia Hà Nội) 66 PHỤ LỤC Phổ 1H-NMR SG2 (Đo Khoa hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên) 67 PHỤ LỤC Phổ 13C-NMR SG2 (Đo Khoa hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên) 68 PHỤ LỤC Phổ DEPT SG2 (Đo Khoa hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên) 69 PHỤ LỤC Phổ HMBC SG2 (Đo Khoa hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên) 70 PH Ụ L ỤC Phổ HSQC SG2 (Đo Khoa hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên) 71 PHỤ LỤC Hàm lượng AO (%) mẫu nguyên liệu Chân chim leo từ tháng 1/2010 đến tháng 12/2010 Nguyên liệu (g) OD (Độ ẩm %) Tháng (10,17%) Tháng (9,61%) Tháng (8,66%) Tháng (8,82%) Tháng (9,63%) Tháng (8,31%) Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng AO AO (mg/ml) AO (g) AO (%) trung bình (%) 1,0009 0,605 0,070 0,059 6,59 1,0025 0,607 0,070 0,060 6,61 1,0005 0,602 0,069 0,059 6,55 1,0015 0,617 0,072 0,061 6,72 1,0001 0,614 0,071 0,060 6,68 1,0010 0,617 0,071 0,061 6,72 1,0018 0,609 0,070 0,060 6,53 1,0010 0,608 0,070 0,060 6,53 1,0022 0,609 0,070 0,060 6,52 1,0011 0,579 0,069 0,058 6,38 1,0020 0,592 0,067 0,058 6,30 1,0025 0,596 0,068 0,058 6,36 1,0015 0,420 0,041 0,035 3,84 1,0018 0,426 0,042 0,036 3,93 1,0010 0,423 0,041 0,035 3,89 1,0060 0,612 0,071 0,035 3,90 1,0040 0,567 0,064 0,032 3,48 1,0053 0,581 0,066 0,033 3,58 72 6,58 6,70 6,52 6,35 3,89 3,65 Tháng (8,43%) Tháng (8,15%) 1,0026 0,509 0,055 0,027 2,98 1,0055 0,552 0,062 0,031 3,45 1,0015 0,507 0,055 0,027 2,98 1,0020 0,463 0,048 0,024 2,59 1,0062 0,482 0,051 0,025 2,74 1,0008 0,413 0,040 0,020 2,16 1,0025 0,305 0,023 0,012 1,25 1,0019 0,301 0,022 0,011 1,22 1,0040 0,328 0,027 0,013 1,44 1,0014 0,308 0,023 0,012 1,27 1,0043 0,306 0,023 0,012 1,25 1,0004 0,315 0,025 0,012 1,32 1,0007 0,180 0,009 0,005 0,49 3,10 2,49 Tháng (8,20%) Tháng 10 (7,58%) Tháng 11 1,28 0,67 (9,65%) Tháng 12 1,30 1,0001 0,183 0,016 0,008 0,89 1,0003 0,183 0,011 0,006 0,62 1,0005 0,180 0,003 0,002 0,20 0,21 (10,73%) 0,9999 0,183 0,004 0,002 0,22 1,0008 0,183 0,004 0,002 0,22 73 PHỤ LỤC Bảng thống kê kết so sánh hàm lượng (%) AO mẫu Chân chim leo khảo sát từ tháng 01/2010 đến tháng 12/2010 phần mềm Statgraphics One-Way Analysis of Variance Data: KHANH.kq Level codes: KHANH.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 200.68787 11 18.244352 796.214 0000 Within groups 54993 24 022914 Total (corrected) 201.23780 35 missing value(s) have been excluded 09/14/11 Page 10:51:56 74 PM Table of means for KHANH.kq by KHANH.nt Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean T1 6.5833333 0176383 0873954 6.4557583 6.7109083 T2 6.7066667 0133333 0873954 6.5790917 6.8342417 T3 6.5266667 0033333 0873954 6.3990917 6.6542417 T4 6.3466667 0240370 0873954 6.2190917 6.4742417 T5 3.8866667 0260342 0873954 3.7590917 4.0142417 T6 3.6533333 1266667 0873954 3.5257583 3.7809083 T7 3.1366667 1566667 0873954 3.0090917 3.2642417 T8 2.4966667 1738134 0873954 2.3690917 2.6242417 T9 1.3033333 0688799 0873954 1.1757583 1.4309083 T10 1.2800000 0208167 0873954 1.1524250 1.4075750 T11 6666667 1178040 0873954 5390917 7942417 T12 2133333 0066667 0873954 0857583 3409083 Total 36 3.5666667 0252289 0252289 3.5298389 3.6034944 75 Multiple range analysis for KHANH.kq by KHANH.nt Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups T12 2133333 X T11 6666667 X T10 1.2800000 X T9 1.3033333 X T8 2.4966667 X T7 3.1366667 X T6 3.6533333 X T5 3.8866667 X T4 6.3466667 X T3 6.5266667 XX T1 6.5833333 XX T2 6.7066667 X contrast difference limits T1 - T2 -0.12333 0.25515 T1 - T3 0.05667 0.25515 T1 - T4 0.23667 0.25515 T1 - T5 2.69667 0.25515 * T1 - T6 2.93000 0.25515 * T1 - T7 3.44667 0.25515 * T1 - T8 4.08667 0.25515 * T1 - T9 5.28000 0.25515 * T1 - T10 5.30333 0.25515 * T1 - T11 5.91667 0.25515 * T1 - T12 6.37000 0.25515 * T2 - T3 0.18000 0.25515 T2 - T4 0.36000 0.25515 * T2 - T5 2.82000 0.25515 * T2 - T6 3.05333 0.25515 * T2 - T7 3.57000 0.25515 * T2 - T8 4.21000 0.25515 * T2 - T9 5.40333 0.25515 * T2 - T10 5.42667 0.25515 * T2 - T11 6.04000 0.25515 * T2 - T12 6.49333 0.25515 * T3 - T4 0.18000 0.25515 T3 - T5 2.64000 0.25515 * T3 - T6 2.87333 0.25515 * T3 - T7 3.39000 0.25515 * T3 - T8 4.03000 0.25515 * T3 - T9 5.22333 0.25515 * T3 - T10 5.24667 0.25515 * T3 - T11 5.86000 0.25515 * T3 - T12 6.31333 0.25515 * T4 - T5 2.46000 0.25515 * T4 - T6 2.69333 0.25515 * T4 - T7 3.21000 0.25515 * T4 - T8 3.85000 0.25515 * T4 - T9 5.04333 0.25515 * T4 - T10 5.06667 0.25515 * 76 T4 T4 T5 T5 T5 T5 T5 T5 T5 T6 T6 T6 T6 T6 T6 T7 T7 T7 T7 T7 T8 T8 T8 T8 T9 T9 T9 T10 T10 T11 - T11 T12 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T8 T9 T10 T11 T12 T9 T10 T11 T12 T10 T11 T12 T11 T12 T12 5.68000 6.13333 0.23333 0.75000 1.39000 2.58333 2.60667 3.22000 3.67333 0.51667 1.15667 2.35000 2.37333 2.98667 3.44000 0.64000 1.83333 1.85667 2.47000 2.92333 1.19333 1.21667 1.83000 2.28333 0.02333 0.63667 1.09000 0.61333 1.06667 0.45333 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 0.25515 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * - * denotes a statistically significant difference 77 ... CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Phan Thị Quốc Khánh sinh ngày 01 tháng 09 năm 1983 huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh Con Ơng Phan Văn Liệt Bà Đào Thị Bé Tốt nghiệp Tú tài Trường... Đỗ Duy Tuấn, kết hôn năm 2009; Đỗ Phan Diệu Khánh, sinh năm 2010 Địa liên lạc: 664 Bình Trường, Bình Khánh, Cần Giờ, TP.HCM Điện thoại: 0932.190.019 Email: khanhquc@gmail.com ii LỜI CAM ĐOAN... 3.1.2 Địa điểm 20 3.2 Vật liệu thi t bị 21 3.2.1 Mẫu thí nghiệm .21 3.2.2 Hóa chất 21 3.2.3 Dụng cụ thi t bị 21 3.3 Nội dung phương pháp