XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG STEVIOSIDE TRONG CỎ NGỌT (Stevia Rebaudiana) VÀ THỬ NGHIỆM BỔ SUNG CỎ NGỌT VÀO TRÀ BẠC HÀ

Thứ nhất, xác định hàm lượng Diterpen glycoside ở lá, thân, ngọn trong bốn lần thu hoạch đầu tiên; Thứ hai, xây dựng quy trình chiết xuất để thu nhận hỗn hợp chứa chất ngọt Stevioside; T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG STEVIOSIDE TRONG CỎ NGỌT

(Stevia Rebaudiana) VÀ THỬ NGHIỆM BỔ SUNG

CỎ NGỌT VÀO TRÀ BẠC HÀ

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ THANH TÂM Niên khóa : 2009 – 2013

Tháng 6/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG STEVIOSIDE TRONG CỎ NGỌT

(Stevia Rebaudiana) VÀ THỬ NGHIỆM BỔ SUNG

CỎ NGỌT VÀO TRÀ BẠC HÀ

ThS PHÙNG VÕ CẨM HỒNG

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt đề tài này, tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm

bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý thầy cô đã tận tâm hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường

TS Trần Thị lệ Minh và ThS Phùng Võ Cẩm Hồng là người luôn theo sát và chỉ dạy cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Công ty Cổ phần Dược Phẩm 3/2 đã cung cấp Stevia GSG 95

Cô Tô Thị Nhã Trầm cùng các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học đã hướng dẫn tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Chị Ngọc, anh Triết, anh Kiên, anh Sinh trong phòng sắc ký Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm

Tập thể lớp DH09SH đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Đặc biệt, tôi muốn gửi lời cám ơn tới ba mẹ - người đã nuôi dạy, giúp đỡ, động viên, chia sẻ những khó khăn trong những năm tháng tôi học tập tại trường

Tháng 06 năm 2013

Nguyễn Thị Thanh Tâm

TÓM TẮT

Bệnh tiểu đường là một căn bệnh nguy hiểm và có tính toàn cầu do thói quen

sử dụng đường của con người trong bữa ăn hằng ngày Việc sử dụng đường trong khẩu phần ăn là truyền thống văn hóa của các quốc gia, nó gắn liền với nhu cầu của từng người, từng hộ gia đình Đứng trước những lo lắng về tác dụng ngược của đường thì việc tìm ra một loại chất ngọt có thể thay thế đường là những hướng suy nghĩ mới của các nhà nghiên cứu Năm 1888, nhà thực vật học người Paraguay là Moises Santiago Bertoni đã phát hiện, phân loại một loại cỏ chứa chất có vị ngọt gấp 300 lần đường mía Cỏ ngọt chứa chất ngọt Stevioside không bị lên men trong dạ dày, không bị phân hủy và đặc biệt không sinh năng lượng, vô hại với cơ thể nên có thể dùng trong chế độ

ăn kiêng Đề tài được thực hiện nhằm mục đích tìm hiểu và sử dụng hiệu quả các bộ phận của cây cỏ ngọt

Đề tài được thực hiện với ba thí nghiệm Thứ nhất, xác định hàm lượng Diterpen glycoside ở lá, thân, ngọn trong bốn lần thu hoạch đầu tiên; Thứ hai, xây dựng quy trình chiết xuất để thu nhận hỗn hợp chứa chất ngọt Stevioside; Thứ ba, thử nghiệm bổ sung sản phẩm cỏ ngọt vào trà bạc hà

Kết quả cho thấy sau khi đo OD thì nồng độ Diterpen glycoside trong thân là cao nhất ở tất cả các lần cắt, hàm lượng đường trong lần cắt đầu thì thấp hơn các lần cắt sau (lần 1 là 0,394 mg/ml; lần 2 là 0,796 mg/ml; lần 3 là 0,722 mg/ml; lần 4 là 0,771mg/ml) Hỗn hợp chứa Stevioside sau chiết xuất có màu vàng cam chiếm 3,374%

so với khối lượng mẫu ban đầu Trà bạc hà bổ sung cỏ ngọt sau khi đánh giá cho điểm chất lượng đạt 17,5 điểm tương đương với loại khá

SUMMARY

The thesis: “Extract of Stevioside compounds in stevia (Stevia Rebaudiana)

and additional testing stevia onpeppermint tea" is done at the Institute of Biotechnology and Environment, Nong Lam University, Ho Chi Minh City Diabetes

is a serious disease worldwide caused by people’s habits of using sugar in our daily meals Using sugar in food is traditional culture of many countries, it pertains to the needs of each person, each household Faced with concerns about adverse effects of sugar, scientists tried to find possible alternative sweet substances In 1888, a Paraguayan botanist, Moises Santiago Bertoni, discovered a grass has 300 times the sweetness of cane sugar Stevia contains sweetener Stevioside not fermented in the stomach, can not be destroyed and not particularly produce energy, harmless to the body, can be used in the diet Study was done for the purpose of understanding and effective use of parts of Stevia

Study was conducted with three experiments First, determining Diterpen glycoside content in leaves, stems and tops four times in the first harvest; Second, building extraction process to obtain a mixture containing sweetener Stevioside; Third, testing adding the sweetener of Stevia into the mint tea

The results of the OD measurement showed that concentration of glycoside Diterpen was the highest in all cuts, sugar content in the first cut is lower than the cuts followed (the first time one was 0.394 mg / ml, the second times was 0.796 mg / ml, the third time was 0.722 mg / ml, the forth time was 0.771 mg / ml) Mixtures contain Stevioside after extract had orange color made 3.374% compared to the initial sample volume Mint tea adding sweetener of this grass after evaluation achieves score of quality 17.5 points - equivalent to fair degree

Keywords: stevioside, diterpen glycoside, mint tea, stevia

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cây cỏ ngọt 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố của cây cỏ ngọt 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây cỏ ngọt 3

2.1.3 Ý nghĩa kinh tế của cây cỏ ngọt 4

2.1.4 Giá trị dược học của cây cỏ ngọt 4

2.1.5 Thành phần và các chất trong cỏ ngọt 5

2.1.6 Độc tính trong lá cỏ ngọt 7

2.1.7 Những nghiên cứu trong nước và thế giới về cây cỏ ngọt 8

2.1.7.1 Nghiên cứu trong nước 8

2.1.7.2 Nghiên cứu trên thế giới 8

2.2 Tổng quan về cây bạc hà 9

2.2.1 Nguồn gốcvà phân bố cây bạc hà 9

2.2.2 Ý nghĩa kinh tế cây bạc hà 9

2.2.3 Tác dụng dược lý của cây bạc hà 10

2.3 Phương pháp chưng cất tinh dầu bằng nước 10

2.4 Tổng quan về trà 11

2.4.1 Giá trị của trà 11

2.4.2 Một số sản phẩm trà cỏ ngọt 12

2.4.3 Trà bạc hà cỏ ngọt 12

2.5 Than hoạt tính và Celite 13

2.5.1 Than hoạt tính 13

2.5.2 Celite 13

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa điểm 14

3.2 Vật liêu nghiên cứu 14

3.2.1 Đối tương nghiên cứu 14

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 14

3.2.3 Hóa chất 14

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14

3.3.1 So sánh hàm lượng Diterpen glycoside của lá, thân, ngọn ở các lần cắt 14

3.3.1.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn đối với chất chuẩn Stevia GSG 95 14

3.3.1.2 So sánh hàm lượng Diterpen glycoside của lá, thân, ngọn ở các lần cắt 15

3.3.2 Xây dựng quy trình chiết xuất hợp chất chứa Stevioside 15

3.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đun đến sự hòa tan Stevioside 15

3.3.2.2 Khảo sát khả năng hấp thu của than hoạt tính trong dịch chiết thô 16

3.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của Celite đến dịch chiết thô 16

3.2.2.4 Quy trình chiết xuất hợp chất chứa Stevioside 16

3.3.3 Thử nghiệm bổ sung sản phẩm cỏ ngọt vào trà bạc hà 18

3.3.3.1.Kiểm tra nguyên liệu ban đầu 18

3.3.3.2 Thử nghiệm bổ sung sản phẩm cỏ ngọt vào trà bạc hà 18

3.3.3.3 Đánh giá cảm quan trà bạc hà 19

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 So sánh hàm lượng Diterpen glycoside trong lá, thân, ngọn ở các lần cắt 21

4.1.1 Phương trình đường chuẩn của chất chuẩn Stevia GSG 95 21

4.1.2 Hàm lượng Diterpen glycoside trong lá, thân, ngọn qua từng lần cắt 22

4.1.3 Hàm lượng Diterpen glycoside trong bốn lần cắt 25

4.2 Xây dựng quy trình chiết xuất hợp chất chứa Stevioside 26

4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian đun đến sự hòa tan Stevioside 26

4.2.2 Khả năng hấp thu của than hoạt tính trong dịch chiết thô 27

4.2.3 Ảnh hưởng của Celite trong dịch chiết thô 29

4.2.4 Kết quả chiết xuất hợp chất chứa Stevioside 30

4.3 Thử nghiệm bổ sung cỏ ngọt vào trà bạc hà 33

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang

Bảng 3.1 Thí nghiệm bổ sung sản phẩm cỏ ngọt vào trà bạc hà 18

Bảng 3.2 Hệ số trọng lượng của trà 19

Bảng 3.3 Mức chất lượng đánh giá trà 19

Bảng 4.1 Nồng độ Diterpen glycoside trong lá, thân, ngọn của lần cắt 1 23

Bảng 4.2 Nồng độ Diterpen glycoside trong lá, thân, ngọn của lần cắt 2 23

Bảng 4.3 Nồng độ Diterpen glycoside trong lá, thân, ngọn của lần cắt 3 24

Bảng 4.4 Nồng độ Diterpen glycoside trong lá, thân, ngọn của lần cắt 4 24

Bảng 4.5 Sự khác biệt hàm lượng Diterpen glycoside trong bốn lần cắt 25

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của thời gian đun đến sự hòa tan Stevioside 27

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến dịch chiết thô 28

Bảng 4.8 Ảnh hưởng Celite đến dịch chiết thô 30

Bảng 4.9 Kết quả chiết xuất lá, thân, ngọn lần cắt 1 32

Bảng 4.10 Kết quả chiết xuất lá, thân, ngọn lần cắt 2 32

Bảng 4.11 Kết quả chiết xuất lá, thân, ngọn lần cắt 3 32

Bảng 4.12 Kết quả chiết xuất lá, thân, ngọn lần cắt 4 32

Bảng 4.13 Thử nghiệm bổ sung cỏ ngọt vào trà bạc hà 33

Bảng 4.14 Kết quả đánh giá cảm quan trà 34

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình Trang

Hình 2.1 Công thức hóa học của Stevioside 5

Hình 2.2 Công thức hóa học của Steviolbioside 6

Hình 2.3 Công thức hóa học của Rebaudioside – A 6

Hình 3.1 Quy trình chiết xuất hợp chất chứa Stevioside 17

Hình 4.1 Phương trình đường chuẩn của chất chuẩn Stevioside 21

Hình 4.2 Các bộ phận của cỏ ngọt 22

Hình 4.3 Sự khác biệt về màu sắc ở các thời gian đun khác nhau 26

Hình 4.4 Sự khác biệt về màu sắc giữa các khối lượng than khác nhau 28

Hình 4.5 Màu sắc dung dịch thô sau khi bổ sung khối lượng Celite khác nhau 29

Hình 4.6 Dung dịch thôkhi đun với nước cất 31

Hình 4.7 Dung dịch sau chiết xuất 31

Hình 4.8 Hợp chất chứa Stevioside sau chiết xuất 31

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Một báo cáo công bố tại Hội nghị của Liên Đoàn Tiểu Đường Quốc Tế được

tổ chức tại Paris, chi phí chăm sóc người bệnh tiểu đường trong độ tuổi 20 - 79 trên toàn thế giới hàng năm hiện nay khoảng 150 tỷ USD Ước tính đến năm 2025 gánh nặng về bệnh tiểu đường cho toàn thế giới sẽ ở mức gần 400 tỷ USD Theo tài liệu chi tiết được Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO) công bố ngày 30/10/2003, đến năm 2030 số bệnh nhân tiểu đường trên thế giới sẽ khoảng 300 triệu tức khoảng 4% dân số thế giới Còn tại Việt Nam, hiện có hơn 3 triệu người đang mang trong mình căn bệnh đái tháo đường và hàng triệu người có thể trở thành nạn nhân tiếp theo của căn bệnh này Nguy hiểm nhất là hơn 65% trong số người bệnh nói trên không biết mình đang mắc bệnh

Như vậy, bệnh tiểu đường là một căn bệnh nguy hiểm và có tính toàn cầu do thói quen sử dụng đường của con người trong bữa ăn hằng ngày Hiện nay, ngoài thị trường có rất nhiều loại đường và các sản phẩm từ đường như: đường mía (phổ biến nhất hiện nay và chứa nhiều năng lượng), đường hóa học (có vị ngọt rất cao, có thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người sử dụng), đường trái cây (chiết xuất từ trong các loại trái cây), các sản phẩm sữa, bánh, kẹo Có thể nói, việc sử dụng đường trong khẩu phần ăn là truyền thống văn hóa của các quốc gia, nó gắn liền với nhu cầu của từng người, từng hộ gia đình Đứng trước những lo lắng về tác dụng ngược của đường thì việc tìm ra một loại chất ngọt có thể thay thế đường là những hướng suy nghĩ mới của các nhà nghiên cứu Năm 1888, nhà thực vật học người Paraguay là Moises Santiago Bertoni đã phát hiện, phân loại một loại cỏ chứa chất có vị ngọt gấp 300 lần

đường mía và ông chính thức đặt tên cho loại cỏ này là Stevia Rebaudiana Bertoni

Loại cỏ này ở Việt Nam thường được gọi là cỏ ngọt (hay cỏ mật, cúc ngọt) Cỏ ngọt chứa chất ngọt Stevioside không bị lên men trong dạ dày, không bị phân hủy và đặc biệt không sinh năng lượng, vô hại với cơ thể nên có thể dùng trong chế độ ăn kiêng (Trần Đình Long, 1996)

Do vậy, việc thực hiện đề tài: “Xác định hàm lượng Stevioside trong cây cỏ

ngọt (Stevia Rebaudiana) và thử nghiệm bổ sung cỏ ngọt vào trà bạc hà” sẽ biết được

hàm lượng Stevioside có trong cỏ ngọt và nghiên cứu sản phẩm từ cỏ ngọt có giá trị đối với người sử dụng

1.2 Yêu cầu của đề tài

- Nghiên cứu bộ phận chứa nồng độ Diterpen glycoside trong cây cỏ ngọt trong các bộ phận của cây qua các lần cắt

- Tạo hỗn hợp chứa Stevioside từ cây cỏ ngọt

- Tạo sản phẩm trà bạc hà cỏ ngọt

1.3 Nội dung thực hiện

- Xác định hàm lượng Diterpen glycoside của lá, thân, ngọn trong bốn lần cắt

- Xây dựng quy trình chiết xuất hỗn hợp chứa Stevioside:

+ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hòa tan Stevioside

+ Khảo sát khả năng hấp thụ của than hoạt tính đến dịch chiết thô

+ Khảo sát ảnh hưởng của Celite đến dịch chiết thô

- Thử nghiệm bổ sung sản phẩm từ cỏ ngọt vào trà bạc hà

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây cỏ ngọt

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố của cây cỏ ngọt

Cỏ ngọt (Stevia Rebaudiana) thuộc họ Cúc Asteraceae, còn được gọi là cỏ

đường, cỏ mật, có nguồn gốc ở Nam Mỹ Đây là loài cỏ có nhiều lợi ích, có thể đưa vào sản xuất để chuyển đổi cơ cấu cây trồng Cỏ ngọt được trồng và sử dụng hầu hết các châu lục, đặc biệt ở các nước Nhật Bản, Inđônêxia, Braxin, Paraguay, Mỹ, Thái Lan Ngày nay cỏ ngọt được trồng khá phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc, Inđônêxia và một số nước khác Cỏ ngọt bắt đầu được sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản Hàng năm ở Nhật Bản sử dụng từ 45 - 50 tấn Stevioside (tương đương 450 -

500 tấn lá khô) Ở Hàn Quốc dùng 6 - 8 tấn Stevioside/tháng (tương đương 60 - 80 tấn

là cỏ ngọt khô) Sản phẩm đường cỏ ngọt ngày càng có uy tín trên thị trường thế giới đặc biệt là Nhật Bản và các nước Đông Nam Á Cỏ ngọt được đưa vào Việt Nam từ tháng 8 năm 1988 và hiện nay được trồng phổ biến ở một số tỉnh: Hà Giang, Hòa Bình, Hưng Yên, Lâm Đồng (Trần Đình Long, 1996)

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây cỏ ngọt

Hệ rễ: Là cây có hệ rễ khoẻ, ít phân nhánh, có thể mọc sâu tới 20 – 30 cm tuỳ thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất Hệ rễ phát triển tốt trong điều kiện đất tơi xốp đủ ẩm

Thân cành: Cỏ ngọt có dạng thân bụi, chiều cao 50 – 60 cm, thâm canh tốt có thể đạt 80 – 120 cm, phân cành cấp I nhiều Cành cấp I thường xuất hiện từ các đốt lá cách mặt đất 10 cm, sau đốn cành có thể xuất hiện ở các đốt trên thân

Lá: Mọc đối từng cặp hình thập tự, mép lá có từ 12 - 16 răng cưa, lá hình trứng ngược, lá trưởng thành có thể dài tới 5 – 8 cm, rộng 1,5 – 2 cm, có ba gân song song

và các gân phụ phân nhánh

Hoa quả: Hoa phức, giao phấn, khả năng tự thụ phấn thấp Quả mầu nâu thẫm, năm cạnh khi chín dài 2 - 2,5 mm, hạt có hai vỏ hạt, có phôi nhưng nội nhũ trần do vậy

tỷ lệ nảy mầm thấp và hạt dễ mất sức nảy mầm khi bảo quản

Cỏ ngọt sau khi thu hái phải được sấy khô (hàm lượng nước dưới 10%) được bảo quản trong túi ni lông, tránh hút ẩm để đảm bảo chất lượng cỏ ngọt Đặc biệt trong

quá trình phơi sấy, bảo quản không để bị ướt vì thành phần ngọt sẽ bị tan chảy ra ngoài ảnh hưởng đến giá trị cỏ ngọt (Võ Thị Thu Trang, 2008)

2.1.3 Ý nghĩa kinh tế của cây cỏ ngọt

Theo GS Trần Đình Long – Chủ tịch Hiệp hội giống cây trồng Việt Nam, cho biết: "Cây cỏ ngọt Việt Nam và chế phẩm của nó sẽ có cơ hội xuất đi nhiều nước trên thế giới nếu chúng ta sản xuất được" Cỏ ngọt không chỉ làm thực phẩm chức năng, mà còn làm mỹ phẩm, phân bón phun trên lá và phân sạch hữu cơ cho những sản phẩm chất lượng cao Một số công ty của Peru, Canada, Hàn Quốc sẵn sàng thu mua; riêng Hàn Quốc thu mua cả thân, lá cây cỏ ngọt làm phân bón hữu cơ để làm sản phẩm nông nghiệp sạch

Đường từ cỏ ngọt hiện có giá là 1,5 triệu đồng/kg, đường mía có giá khoảng 20.000 đồng/kg Song với độ ngọt gấp khoảng 300 lần đường mía, thì chi phí sản xuất khi sử dụng đường cỏ ngọt sẽ giúp tiết kiệm hơn nhiều lần Hiện Việt Nam cũng có một số công ty như: Công ty Cổ phần Thương mại Toàn cầu Stevia, Công ty Cổ phần Phát triển Stevia Ventures, Công ty Cổ phần Đầu tư phát triển Stevia Á châu đang tham gia nhưng mới dừng ở mức độ tư vấn, là đầu mối cung cấp thông tin về dây chuyền, đầu ra (tức là đảm bảo bao nhiêu tấn lá khô có thể xuất khẩu được chứ chưa phải tổ chức sản xuất hay tiêu thụ trên quy mô lớn) Việt Nam đã xuất cỏ ngọt qua đường tiểu ngạch sang các nước như Trung Quốc, Nga, Hàn Quốc Các công ty kí hợp đồng mua với số lượng nhất định (10.000 - 15.000 tấn) nhưng chưa có ngành hàng xuất khẩu ổn định Do ta chưa có vùng chuyên canh nên không thống kê được số lượng đã xuất khẩu (Trần Đình Long, 2012)

Tuy nhiên, hiện nay một số tỉnh nước ta đang trồng cỏ ngọt cho thấy giá trị kinh tế khi trồng cỏ ngọt cao gấp 3 - 4 lần khi trồng lúa Như vậy, nếu chúng ta mở rộng diện tích trồng chuyên canh thì đời sống người dân được sẽ được cải thiện Để đạt được điều đó, chúng ta cần tiếp tục nghiên cứu, thiết kế dây chuyền sản xuất phù hợp thì việc phát triển và ổn định nguồn cỏ ngọt mới có thể thực hiện được

2.1.4 Giá trị dược học của cây cỏ ngọt

Cỏ ngọt có tác dụng hạ đường huyết trên bệnh nhân đái tháo đường và tác dụng giãn mạch toàn thân nên tốt với người cao huyết áp Khi nghiên cứu trên chuột, Stevioside có tác dụng hạ huyết áp, tăng bài niệu và thải trừ Natrium Nghiên cứu của Planas (1968), chuột cống trắng cái và đực uống nước có 5% cao cỏ ngọt có tác dụng

ngừa thai Không những vậy, cao cỏ ngọt có tác dụng kháng khuẩn đối với

Pseudmonas aeruginosa và Proteus vulgarus nên được dùng làm chất tạo ngọt thay

thế đường (Dương Thanh Liêm, 2010)

Từ 30 năm nay, các nhà khoa học Phù Tang đã nghiên cứu các hoạt chất của Stevia, nhưng cũng không thấy có báo cáo nào nói lên tính độc hại của loại thảo mộc này Ngoài ra, thí nghiệm thực hiện tại đại học Maringa, Brazil cho biết chiết dịch lá Stevia có khuynh hướng giúp đem glucose vào trong tế bào, nhờ vậy, lượng đường trong máu giảm đi phần nào

Ngày 17/12/2008, FDA đã chấp thuận cho phép các chất trích từ cây Stevia được bán ra thị trường (http://www.minhha.vn)

2.1.5 Thành phần các chất trong cây cỏ ngọt

Resenack (1908) và Dieterich (1909) đã chiết suất được Glucoside từ lá cỏ ngọt Nhưng mãi đến năm 1931 Bridel và Lavieille mới xác định được Glucoside đó chính là Stevioside, chất ngọt cơ bản tạo lên độ ngọt ở loại cây này Chất Stevioside sau khi thuỷ phân sẽ cho 3 phân tử Steviol và Isosteviol Chất Steviol ngọt hơn đường Saccaroza 300 lần Thông qua phương pháp ion hoá khi chúng trao đổi ion, H.B Wood đã nghiên cứu tìm ra công thức hoá học của các Glucoside nói trên Bằng phương pháp sắc ký bản mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng cao áp , người ta đã thấy được

11 chất có hàm lượng và độ ngọt khác nhau, nhưng tạo nên độ ngọt là các chất cơ bản sau: Stevioside (có trong cây khoảng 7%), Rebaudioside A (có trong cây khoảng 2%), Rebaudioside B, Steviolbioside, Rebaudioside C, Rebaudioside D

Hình 2.1 Công thức hóa học của Stevioside

Stevioside có công thức là C38H60O18 có độ ngọt gấp 300 lần so với đường saccarose, ít năng lượng, ngon, không lên men, không bị phân huỷ, bởi vậy rất có triển vọng dùng để thay đường trong chế độ ăn kiêng Stevioside là một tinh thể hình kim,

có độ quay 1980

(a)25 39,30, Điểm chảy 202 – 2040

, 1g tan trong 800 ml nước Chứa trong cây với tỷ lệ 6 – 8 %

Steviolbioside là một chất ngọt chiếm trọng lượng rất nhỏ trong cây

Rebaudioside – A có công thức là C44H70O23.3H2O, là chất kết tinh không màu Trong công thức khai triển có R1 = 1 glucose, R2 = 3 glucose Chất này rất ngọt,

có điểm nóng chảy 242 - 2440

, có trong cây 1,4 – 2%

Hình 2.2 Công thức hóa học của Steviolbioside

Hình 2.3 Công thức hóa học của Rebaudioside – A

(Nguồn: Võ Thị Thừa, 2010)

Rebaudioside – B là chất kết tinh không màu, ngọt có công thức

C38H60O18.2H2O Công thức khai triển gồm R1 = H, R2 = 3 glucose, điểm nóng chảy

193 – 1950, có trong cây từ 0,03 – 0,07%

Rebaudioside – C (dulcozit-B): Có công thức: C44H70O23.3H2O công thức khai triển gồm R1 = 1 glucose, R2 = 2 glucose và rhomnose, điểm nóng chảy 235 - 2380C Rebaudioside –D: Có trong cây khoảng 0,03% Công thức khai triển gồm R1 =

H, R2 = H, điểm nóng chảy 283 - 2860C (Trần Đình Long, 1996)

Ngoài các chất chủ yếu nêu trên, trong cỏ ngọt còn một số chất khác đã và đang được nghiên cứu

2.1.6 Độc tính trong lá cỏ ngọt

Thèm ngọt là một nhu cầu thiết yếu của con người nhưng nếu ăn ngọt quá nhiều và quá thường xuyên thì cũng sẽ không tốt cho sức khỏe

Theo sách “An toàn cây thuốc” của Hiệp hội dược thảo Hoa Kỳ, cây Cỏ ngọt

(Stevia rebaudiana) được sắp vào nhóm I, có nghĩa là an toàn nếu dùng một cách đúng

đắn Stevioside không gây độc tính cấp tính ở Chuột, Thỏ, Chuột lang và các loài chim thí nghiệm Hóa chất trong cỏ ngọt được bài tiết không bị thay đổi cấu trúc, nên không gây đột biến, không có nguy cơ gây ung thư và không ảnh hưởng lên thai nhi Trong một nghiên cứu ở Chuột đồng với liều cao 2,5 g Stevioside/kg Chuột mỗi ngày không thấy phản ứng phụ hay độc tính và không tác dụng lên hệ sinh sản Stevioside không thấy gây đột biến ở chuột thí nghiệm Cho Chuột đồng dùng Stevioside trong 6 tháng

và Chuột nhắt dùng trong 2 năm không thấy ngộ độc hoặc sinh ung thư nào Liều dùng

để tạo vị ngọt cho người dùng rất thấp: 1 - 10 viên Stevioside (tương đương 60 - 600

mg Stevioside hay 1,5 - 15 g lá cỏ ngọt khô) nhưng đủ cho độ ngọt của 18 - 180 g đường mía mà chỉ cung cấp 2,4 Calori, coi như năng lượng không đáng kể và không độc hại nào cả (www.khoahocphothong.com.vn)

Thí nghiệm trên chuột Swiss tiến hành ở Khoa Sinh, Trường Đại học Quốc gia

Hà Nội cho thấy: dịch chiết cỏ ngọt không gây độc cho chuột ở cả hai thế hệ (bố mẹ và con lai), không gây hại cho phôi, không làm biến đổi cấu trúc hiển vi, không biến loạn

số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể; không gây tổn thương và hoại tử các cơ quan như gan, thận, lách, ruột Ngoài ra, dịch chiết cây cỏ ngọt giúp cơ thể chuột tăng số lượng

tế bào sinh kháng thể, tăng ngày sống trung bình của chuột bị nhiễm phóng xạ

Theo khảo sát trên bệnh nhân cao huyết áp của Viện Dinh dưỡng Quốc gia, đối với bệnh nhân cao huyết áp, trà cỏ ngọt đều có tác dụng lợi tiểu, người bệnh thấy

dễ chịu, ít đau đầu, huyết áp tương đối ổn định Một thí nghiệm khác trên giống chuột Swiss của Viện Dinh dưỡng Quốc gia ngày 5/11/1992 cho thấy không có độc chất trong lá cỏ ngọt (Trần Đình Long, 1996)

2.1.7 Những nghiên cứu trong nước và thế giới về cây cỏ ngọt

2.1.7.1 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, từ những thập niên 90 đã có những nghiên cứu về cây cỏ ngọt Trong kết quả nghiên cứu của giống cây trồng Việt Nga từ 1988 – 1996 với sự tham gia của 14 mẫu đầu dòng cho thấy sự sai khác rất lớn về khả năng sinh trưởng và năng suất Trong cùng một giống thu hoạch ở các thời vụ khác nhau hoặc trồng ở các khu vực khác nhau sẽ cho hàm lượng Stevioside khác nhau Năm 1995, giống cỏ ngọt St –

88 được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống quốc gia (Trần Đình Long, 1996)

Nghiên cứu về khả năng nhân giống cây cỏ ngọt cho thấy hạt cỏ ngọt có khả năng nảy mầm tốt nếu để giống ở vùng cao, lạnh: Đà Lạt, Đắc Lắc (25 – 30%), Hà Nội (1 – 5%) Đối với việc nhân giống cỏ ngọt bằng phương pháp vô tính cho thấy: Trong môi trường MS thạch lỏng, cây con sinh trưởng nhanh, tỷ lệ sống cao, tạo được nhiều chồi, nhiều rễ (Nguyễn Thị Hằng, Mai Thị Phương Anh, cs, 1992) Năm 2011,Công ty

CP Stevia Ventures đã phối hợp với Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc

Hà Nội, bộ môn công nghệ sinh học do Thạc sỹ Lê Thục Anh làm Trưởng bộ môn, cùng nghiên cứu và xây dựng quy trình sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy

mô tế bào

Với tác dụng của cỏ ngọt thì việc tìm hiểu và xây dựng các quy trình chiết xuất được thực hiện ở khá nhiều các viện nghiên cứu, trường đại học nhưng chỉ mới dừng lại ở mức độ nghiên cứu Bên cạnh đó, nhiều sản phẩm từ cỏ ngọt đã được bán ra thị trường

2.1.7.2 Nghiên cứu trên thế giới

Theo thống kê trên thế giới cho thấy có khoảng 300 sáng chế nghiên cứu về cây cỏ ngọt và về chất tạo ngọt trong cây này Ovidio Rebaudi (1900) đã thành công trong việc cô lập hai loại hợp chất từ cỏ ngọt: chất có vị ngọt và chất có vị đắng (hậu vị) Tiếp đó, Reseback (1908) và Dieterich (1909) đã chiết xuất được glucoside từ lá

cỏ ngọt nhưng tới năm 1931 thì Bridel và Lavieille mới xác định và tinh chế được Stevioside Năm 1984, Alvarez và Couto đã tạo tinh thể Glycoside bằng phương pháp

cổ điển Đến năm 1999, Pasquel khảo sát phương pháp trích ly siêu tới hạn (SCFE) các hợp chất không chứa gốc đường trong lá cỏ ngọt (Võ Thị Thu Trang, 2008) Năm

2000 Nhật Bản đã trồng cỏ ngọt bằng phương pháp trồng trong nhà hay nuôi cấy mô làm biến đổi di truyền của cây này để cải biến độ ngọt Ngoài ra, cỏ ngọt còn được nghiên cứu để tạo hương cho thuốc lá, làm đồ uống cho người ăn kiêng, bệnh nhân tiểu đường

2.2 Tổng quan về cây bạc hà

2.2.1 Nguồn gốc và phân bố của cây bạc hà

Bạc hà – chi Metha L., họ Hoa môi (Lamiaceae) đã xuất hiện từ rất lâu đời

trên thế giới Nguồn gốc của cây bạc hà là một điều bí ẩn, lá khô từng được tìm thấy trong các tháp Ai Cập có từ khoảng 1000 năm trước công nguyên Người Hi Lạp và La

Mã đánh giá cao giá trị của cây nhưng nó chỉ phổ biến ở miền Tây châu Âu vào khoảng thế kỉ 18

Ở Việt Nam, bạc hà bản địa mọc hoang ở các tỉnh Sơn La, Lào Cai, Lai Châu, cây có thể cao đến 1,5 m Thân màu xanh, xanh lục hoặc tím Loại này đưa về đồng bằng trồng cho năng suất cây xanh cao nhưng hiệu suất tinh dầu và hàm lượng menthol trong tinh dầu thấp nên không có giá trị kinh tế Hiện nay, ở vùng Nghĩa Trai (Hưng Yên) có trồng một loại bạc hà hoa màu trắng hồng, mọc vòng quanh kẽ lá Thành phần menthol trong tinh dầu loài bạc hà này rất thấp (3,6 - 8,2%), trong khi tỉ lệ pulegon lại khá cao (33 - 56,5%) Loại này chủ yếu được dùng làm thuốc Ngoài ra, nước ta còn có một số chủng loại bạc hà di thực như: bạc hà 974, bạc hà 976, bạc hà Đài Loan, bạc hà Nhật

2.2.2 Ý nghĩa kinh tế của cây bạc hà

Hầu hết các nước trồng bạc hà chủ yếu là để lấy tinh dầu Trong tinh dầu, menthol chiếm trên 75%, bạc hà Á được coi là nguồn nguyên liệu thiên nhiên để chiết xuất menthol Menthol có tác dụng kháng khuẩn, chống co thắt, giảm đau, kích thích tiêu hóa, chữa hôi miệng Nhu cầu menthol trên thế giới vào khoảng 5.600 tấn/năm, trong đó 3.600 tấn là menthol lấy từ ngoài tự nhiên, còn lại là nguồn tổng hợp (http://www.duoclieu.org)

Như vậy, bạc hà là nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm (bánh kẹo, rượu, bia, nước giải khát), công nghiệp mỹ phẩm (tinh dầu, kem đánh răng, sữa rửa mặt, sản phẩm cạo râu) Trong y học, người ta còn sử dụng bạc hà làm nguyên liệu cho các vị thuốc Ngoài ra, bã bạc hà sau khi chiết xuất tinh dầu có thể được tận dụng ủ phân bón sinh học hoặc phối trộn làm thức ăn gia súc

Với giá trị kinh tế, ý nghĩa thực tiễn và nhu cầu sử dụng ngày càng tăng nên đã

có nhiều nghiên cứu thêm về vai trò, tác dụng cũng như việc chiết xuất các thành phần của bạc hà Đây chính là điều kiện để hình thành và phát triển các nền công nghiệp với quy mô lớn

2.2.3 Tác dụng dược lý của cây bạc hà

Tính vị, tác dụng: Bạc hà có vị cay, tính mát, thơm, có tác dụng hạ sốt, làm ra

mồ hôi, làm dịu họng, lợi tiêu hoá, tiêu sưng, chống ngứa Tinh dầu có tác dụng sát trùng, gây tê tại chỗ, có thể gây ức chế làm ngừng thở và tim ngừng đập hoàn toàn Nó kích thích sự tiết dịch tiêu hoá, đặc biệt là mật, chống sự co thắt của các cơ quan tiêu hoá và ngực Ngoài ra, bạc hà có thể hãm làm thuốc để kích thích tiêu hoá, chữa trướng bụng, đau bụng Nước xông bạc hà rất hiệu quả đối với cảm cúm, nhức đầu, sổ mũi, đau họng Tinh dầu bạc hà còn dùng làm thuốc sát trùng và xoa bóp nơi sưng đau Nước cất bạc hà sau khi gạn tinh dầu, đã bão hoà tinh dầu nên rất thơm dùng để pha thuốc súc miệng, làm thuốc đánh răng cho thơm và sát trùng răng miệng, họng (thuoctuthiennhien.wordpress.com)

2.3 Phương pháp chưng cất tinh dầu bằng nước

Tinh dầu là những hỗn hợp khác nhau của những chất bốc hơi có nguồn gốc thực vật (rất ít ở động vật), các chất này thường có mùi thơm và thành phần hóa học, cấu tạo, tính chất vật lý khác nhau, thường không tan hoặc tan rất ít trong nước Tinh dầu được chiết xuất từ những thành phần rất nhỏ của thực vật như lá, rễ, hoa, vỏ, quả, hạt Có rất nhiều phương pháp chưng cất tinh dầu, mỗi phương pháp khác nhau sẽ cho

ra số lượng tinh dầu khác nhau Phương pháp chưng cất bằng hơi nước là phương pháp được thực hiện trong đề tài Đây là phương pháp không thích hợp với những tinh dầu

dễ bị thủy giải

Phương pháp thực hiện: Cho nước phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảng không gian tương đối bên trên lớp nước để tránh khi nước sôi mạnh làm văng nguyên liệu qua hệ thống ống hoàn lưu Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi

lửa hoặc đun bằng hơi nước dẫn từ nồi hơi vào Trong trường hợp chất nạp quá mịn, lắng chặt xuống đáy nồi gây hiện tượng cháy khét nguyên liệu ở mặt tiếp xúc với đáy nồi, lúc đó, nồi phải trang bị những cánh khuấy trộn đều bên trong trong suốt thời gian chưng cất (Nguyễn Trung Tính, Nguyễn Phương Vỹ, 2008)

2.4 Tổng quan về trà

Trà không chỉ là một thức uống mang đậm bản sắc văn hóa mà có giá trị liệu pháp, giúp cho máu huyết lưu thông, lợi tiểu, có khả năng chống ung thư, tiêu độc, điều hòa huyết áp Trước đây trà chỉ phổ biến ở một số nước Châu Á như ở Ấn Độ, Srilanca, chỗ nào cũng trồng trà để cung cấp cho người bản địa và cả cho xuất khẩu Sau này được lan rộng ra các nước Trung Á như một số nước thuộc khối “Udơbêch” của các nước cộng hòa Liên Xô cũ, đặc biệt những nước này không trồng trà, nhưng ở nơi nào cũng uống trà Trên “con đường tơ lụa” trà dần dần có mặt ở các nước Châu Âu.Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại trà xuất phát từ các khu vực và các nguyên liệu khác nhau Người ta không bó hẹp phạm vi của trà là làm từ cây trà nữa nên có thể chia trà làm hai loại: trà từ cây trà (trà xanh, trà đen, trà Olong, bạch trà) và trà thảo dược (trà gừng, trà hoa cúc, trà chùm ngây, trà Atiso)

2.4.1 Giá trị của trà

Nước trà không những là một loại nước uống có giá trị và phổ biến mà theo sách thuốc xưa thì trà còn là một dược thảo giúp tăng cường sự tỉnh táo, giảm đau, đỡ mệt, phục hồi thị giác.Trên thế giới Trung Quốc là nước đầu tiên uống trà, trong thư tịch cổ của các triều đại Trung Quốc và các sách y học đều có ghi chép về phương pháp dùng trà chữa bệnh

Trong trà chứa các chất chống oxi hóa nên trà giúp làm chậm đi sự già cỗi của

tế bào Chất Gallotanin trong trà làm ngăn chặn sự thoái hóa của tế bào thần kinh và kích thích quá trình phục hồi của chúng Nhiều nghiên cứu cho thấy, trà có khả năng phòng chống ung thư, ngăn chặn sự tổn thương DNA Việc uống trà thường xuyên giúp giảm 50% nguy cơ ung thư dạ dày, 40% nguy cơ ung thư da và hạn chế sự loãng xương ở người già Các nhà khoa học cho biết, hoạt chất axit tanic trong trà còn có tác dụng đối với những người bị nhiễm độc kim loại nặng, kể cả thủy ngân Ngoài ra, trà còn có tác dụng làm se niêm mạc ruột, rất hiệu quả trong các trường hợp tiêu chảy cấp (www.ykhoa.net/yhoccotruyen)

Các loại trà được chế biến từ cây dược liệu hiện nay đang là xu hướng nghiên cứu, sản xuất, kinh doanh của các doanh nghiệp Mỗi loại cây dược liệu có công dụng

và giá trị khác nhau, thích hợp cho mọi người, mọi đối tượng Nhưng nhìn chung các loại thảo dược đều được sử dụng với các tác dụng như: thanh nhiệt giải độc, giải khát kháng khuẩn, có tác dụng hỗ trợ chống viêm, chống rối loạn tiêu hóa, điều trị khối u, cao huyết áp

2.4.3 Trà bạc hà cỏ ngọt

Bạc hà vị cay mát không độc, chữa cảm mạo phong nhiệt, có sốt, nhức đầu, ngạt mũi, không ra mồ hôi Có tác dụng kích thích tiêu hóa, chữa kém ăn, ăn uống khó tiêu Cỏ ngọt là loại cây toàn thân có vị ngọt với độ ngọt cao gấp hàng trăm lần đường mía Theo dược sĩ – lương y Bàng Cẩm, Hội Đông y quận Tân Phú cho biết: “ Cỏ ngọt được dùng chế biến trà dành cho người bị bệnh đái tháo đường, béo phì hoặc cao huyết

áp Trong công nghiệp thực phẩm, cỏ ngọt được dùng để pha chế làm tăng độ ngọt mà không làm tăng năng lượng của thực phẩm Loại cây này cũng được dùng trong chế biến sữa làm mượt tóc, kem làm mềm da” Như vậy, sự kết hợp giữa bạc hà và cỏ ngọt tạo nên một loại trà có vị cay the của bạc hà và vị ngọt của cỏ ngọt, phù hợp với mọi người, mọi lứa tuổi Trà bạc hà cỏ ngọt hi vọng sẽ mang tới một hương vị mới không những giúp con người có những phút giây tỉnh táo, thoải mái mà còn giúp phòng chống một số bệnh thường gặp: căng thẳng, mệt mỏi, cảm cúm, khó tiêu

2.5 Than hoạt tính và Celite

2.5.1 Than hoạt tính

Than hoạt tính là loại than được xử lý từ nhiều nguồn vật liệu như tro của vỏ lạc (đậu phộng), gáo dừa hoặc than đá Những nguyên liệu này được nung nóng từ từ trong môi trường chân không, sau đó được hoạt tính hóa bằng các khí có tính ô xi hóa

ở nhiệt độ cực cao Quá trình này tạo nên những lỗ nhỏ li ti có tác dụng hấp thụ và giữ các tạp chất, mùi, màu, cặn, hóa chất vô cơ và hữu cơ, vi khuẩn Ngoài ra, than hoạt tính là tác nhân hấp phụ nhờ vào diện tích bề mặt lớn, cấu trúc xốp vi mô và sự tương tác trên bề mặt lớn Những ứng dụng quan trọng của than hoạt tính có liên quan đến những ứng dụng khử màu, mùi và những tạp chất phi hữu cơ khác từ vòi nước, công nghiệp nước thải, thu hồi dung môi, lọc khí ở những nơi đông người như nhà hàng, công nghiệp chế biến thực phẩm, hóa chất để khử màu đường ăn, trong kiểm soát khí

bị ô nhiễm, làm chất lọc trong công nghiệp hoá chất, y dược, thực phẩm và những ứng dụng lọc khí

2.5.2 Celite

Celite là một dạng đặc biệt của khoáng diatomit Diatomit là đá trầm tích với thành phần chủ yếu là silic oxyt Nó còn có tên là Kizengua hay đất tảo silic Do có nhiều lỗ xốp và tính trơ nên diatomit được sử dụng trong kỹ thuật lọc, làm chất độn và chất hấp thụ Diatomit theo tiêu chuẩn thương mại chứa tới 85 - 94% silic oxyt Mỹ là nước sản xuất diatomit lớn nhất thế giới, chiếm 50% sản lượng toàn cầu Diatomit có nhiều ứng dụng, cụ thể như: dùng để lọc (trong sản xuất rượu, bia, nước ép trái cây, dầu ăn), làm chất độn (trong sản xuất sơn, gia công chất dẻo, sản xuất thuốc đánh răng, đúc răng giả), làm vật liệu mài bóng bạc, đánh bóng vỏ ôtô, làm chất hấp thụ mùi hôi, làm phụ gia trong sản xuất xi măng các chất bọc cách

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2012 đến tháng 06/2013 tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là lá, thân, ngọn của cây cỏ ngọt và lá cây bạc hà Mẫu

cỏ ngọt được lấy ở huyện Tân Uyên - Bình Dương, mẫu bạc hà được lấy từ Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Than hoạt tính (Trung Quốc), Celite (Ấn Độ)

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu cỏ ngọt sau khi thu hoạch được để khô tự nhiên trong phòng cho tới khi độ ẩm không đổi sau đó xay nhỏ

Đối với lá bạc hà, để khô tự nhiên, không xay, sử dụng làm trà ngay khi khô

3.3.1 Nội dung 1 So sánh hàm lượng Diterpen glycoside trong lá, thân, ngọn qua các lần cắt

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện và đo OD ở bước sóng 210 nm

3.3.1.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn đối với chất chuẩn Stevia GSG 95

Xây dựng phương trình đường chuẩn của chất chuẩn nhằm mục đích tìm ra được phương trình để tính nồng độ Diterpen glycoside trong các mẫu Chất chuẩn Stevia GSG 95 được đo OD ở các nồng độ khác nhau

Các bước tiến hành

- Cân 1 g đường chuẩn (± 0,005 g), hòa tan hoàn toàn 100 ml nước cất

- Pha chuẩn ở các nồng độ: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 (mg/ml)

- Tiến hành đo OD và xây dựng đường chuẩn

3.3.1.2 So sánh hàm lượng Diterpen glycoside trong lá, thân, ngọn qua các lần cắt

Dựa vào nồng độ Diterpen glycoside giữa các mẫu để xác định sự chênh lệch

về nồng độ Diterpen glycosyde của các bộ phận trong cùng một lần cắt và trong các lần cắt khác nhau

- Tiến hành pha loãng dung dịch 50 lần

- Lấy dung dịch sau khi pha loãng đi đo OD

Thí nghiệm được lặp lại như nhau qua các lần cắt và mỗi lần cắt lặp lại ba lần

3.3.2 Nội dung 2 Xây dựng quy trình chiết xuất hợp chất chứa Stevioside

Mục đích của việc xây dựng quy trình chiết xuất hợp chất chứa Stevioside là tìm hiểu các yếu tố thời gian, hàm lượng than hoạt tính, hàm lượng Celite và sự ảnh hưởng của các yếu tố đó tới mẫu Do vậy, đề tài sẽ lựa chọn được các tỷ lệ phù hợp nhất để xây dựng quy trình tối ưu hơn

3.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng củathời gian đến khả năng hòa tan Stevioside

Quy trình thực hiện

- Chuẩn bị 7 ống nghiệm

- Cân 1 g lá khô bổ sung 40 ml nước cất vào các ống nghiệm, đun ở 105oC trong các khoảng thời gian: 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ

- Lọc dung dịch thu được, định mức trong bình định mức 100 ml

- Pha loãng dung dịch 50 lần

- Tiến hành đo OD, so sánh kết quả

3.3.2.2 Khảo sát khả năng hấp thụ của than hoạt tính trong dịch chiết thô

- Lọc dung dịch thu được, định mức trong bình định mức 100 ml

- Cho than hoạt tính vào các ống nghiệm với các khối lượng: 0 g; 0,2 g; 0,4 g; 0,6 g; 0,8 g; 1 g khuấy trong 30 phút

- Lọc bỏ bã than ra khỏi dung dịch bằng giấy lọc hoặc ly tâm

- Pha loãng dung dịch 50 lần

- Tiến hành đo OD, so sánh kết quả

3.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của Celite đến dịch chiết thô

Quy trình thực hiện

- Chuẩn bị 6 ống nghiệm

- Cân 1 g lá khô đun trong 40 ml nước cất trong thời gian lựa chọn ở thí nghiệm 3.3.2.1 đối với mỗi ống nghiệm

- Lọc dung dịch thu được, định mức trong bình định mức 100 ml

- Bổ sung khối lượng than hoạt tính lựa chọn từ thí nghiệm 3.3.2.2

- Lọc dung dịch, bổ sung hàm lượng Celite với các khối lượng: 0 g; 0,2 g; 0,4 g; 0,6 g; 0,8 g; 1 g khuấy trong 30 phút

- Lọc bã Celite bằng giấy lọc hoặc ly tâm

- Pha loãng dung dịch 50 lần

- Tiến hành đo OD, so sánh kết quả

3.3.2.4 Quy trình chiết xuất hỗn hợp chứa Stevioside

Sau khi thực hiện thí nghiệm trong các mục 3.3.2.1; 3.3.2.2; 3.3.2.3, ta tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất

Quy trình thực hiện

- Cân 5 g lá cỏ ngọt đun với 200 ml nước cất trong a giờ

- Dung dịch thu được bổ sung b g than hoạt tính lắc trong 20 phút, sau đó li tâm ở

4000 vòng/phút trong 10 phút để thu nhận bã than Lúc này bã than đã hấp thụ Stevioside và một số chất khác

- Tách đường ra khỏi bã than bằng cách hòa bã than vào trong 50 ml cồn 80o trong 10 phút, lặp lại 3 lần

- Dung dịch thu được sẽ được bổ sung c g Celite, lắc trong 20 phút Lọc bỏ bã Celite,

cô quay dung dịch thu được sau đó mang đi sấy khô

- Sau khi sấy thu được cao, cân khối lượng thu được và tính hiệu suất đạt được

Dung dịch sau giải hấp

Bã than

Mẫu

Than hoạt tính Dung dịch

Dung dịch

Đun,lọc

Bổ sung celite, lọc bỏ bã

Giải hấp bằng cồn 80o Dung dịch nước

Hợp chất Stevioside

Cô quay, sấy

Hình 3.1 Quy trình chiết xuất hợp chất Stevioside

3.3.3 Nội dung 3 Thử nghiệm bổ sung sản phẩm cỏ ngọt vào trà bạc hà

3.3.3.1 Kiểm tra nguyên liệu ban đầu

- Tính độ ẩm trong mẫu bạc hà và cỏ ngọt khô

Độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy: Cân a g nguyên liệu cho vào chén sứ sau đó cân khối lượng tổng hợp Sấy ở 105oC, cứ sau 3 giờ cân lại

1 lần, cân đến khối lượng không đổi rồi xác định độ ẩm theo công thức:

Độ ẩm mẫu (%) =

Trong đó: G: Khối lượng mẫu khô

a: Khối lượng mẫu khô sau sấy (105oC/3 giờ)

- Tính hàm lượng tinh dầu trong mẫu bạc hà: Cân khối lượng lá bạc hà ban đầu sau đó đem đi ly trích tinh dầu Sau khi ly trích, cân khối lượng tinh dầu và tính hàm lượng tinh dầu theo công thức:

% tinh dầu =

- Đo nồng độ đường trong cỏ ngọt: Nồng độ đường trong cỏ ngọt được kiểm tra bằng máy đo OD, nguyên liệu dịch chiết cỏ ngọt lấy trong lần cắt thứ 3

3.3.3.2 Thử nghiệm bổ sung sản phẩm cỏ ngọt vào trà bạc hà

Vì khảo sát sự ảnh hưởng của sản phẩm cỏ ngọt đến trà nên khối lượng bạc hà, lượng nước, thời gian giữ cố định Thí nghiệm được thiết lập như sau:

Bảng 3.1 Thí nghiệm bổ sung sản phẩm cỏ ngọt vào trà bạc hà

Thời gian (phút)

Khối lượng tinh dầu * 100%

Khối lượng mẫu

Độ ngọt được đánh giá theo độ tăng dần bởi các dấu +, lấy nghiệm thức 1 làm chỉ tiêu ban đầu và được đánh giá bởi dấu - Thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp cảm quan trên 30 người

Dựa trên kết quả thu được từ các nghiệm thức, ta lựa chọn một nghiệm thức phù hợp sau đó đánh giá cảm quan trà

3.3.3.3 Đánh giá cảm quan trà bạc hà

Sau khi lựa chọn loại trà phù hợp với sự yêu thích, đề tài tiếp tục thực hiện phương pháp cho điểm chất lượng sản phẩm TCVN 3215 - 79 để đánh giá tổng quan chất lượng của trà trên 30 người

PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN TRÀ BẠC HÀ

Di là điểm trung bình sau khi khảo sát cho chỉ tiêu i

Ki là điểm số cho chỉ tiêu trong bảng 3.2