NGUYỄN THỊ THU HIẾU xác ĐỊNH hàm LƯỢNG ACRYLAMID TRONG một số sản PHẨM có NGUỒN gốc TINH bột BẰNG sắc ký LỎNG KHỐI PHỔ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - oOo - NGUYỄN THỊ THU HIẾU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACRYLAMID TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TINH BỘT BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HIẾU MSV: 1401215 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACRYLAMID TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TINH BỘT BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị HàBình ThS Nguyễn Thị Thùy Linh Nơi thực hiện: Viên Kiểm nghiệm ATVSTP QG Bộ mơn Hóa phân tí ch – Độc chất HÀ NỘI - 2019 Lời cảm ơn Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy côgiáo TS Trần Cao Sơn, ThS Nguyễn Thị Hà Bình vàThS Nguyễn Thị Thùy Linh tận tâm hướng dẫn, động viên giúp đỡ em quátrì nh học tập, nghiên cứu khoa học hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, anh chị Khoa Độc học vàdị nguyên thuộc Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia hết lòng quan tâm, giúp đỡ vàtạo điều kiện tốt quátrình em làm việc Viện Em xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cô giáo Trường Đại học Dược HàNội đặc biệt làcác thầy côgiáo môn Hóa phân tích Độc chất dành hết tâm huyết, truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người bạn, người anh, chị, em bên quan tâm, giúp đỡ, động viên, giúp em vượt qua khó khăn, động lực để em học tập, rèn luyện vàhồn thành khóa luận cách tốt Em xin chân thành cảm ơn! HàNội, ngày 11 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hiếu MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan acrylamid 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5 1.2 Giới thiệu chung acrylamid Độ ổn định Phản ứng tạo thành acrylamid Độc tính acrylamid Các quy định mức tiêu thụ acrylamid Tổng quan phương pháp xác định acrylamid 1.2.1 Phương pháp chiết- làm 1.2.1.1 Phương pháp chiết 1.2.1.2 Phương pháp làm 1.2.2 Phương pháp phân tích acrylamid 1.3 Tổng quan sắc kýlỏng khối phổ LC-MS/MS 11 1.3.1 1.3.2 Nguyên lýhoạt động thiết bị sắc kýlỏng khối phổ 11 Cấu tạo thiết bị phân tích khối phổ ba tứ cực 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.2.1 2.2.2 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.3.1 2.3.2 2.4 Nguyên vật liệu 14 Thiết bị 15 Khảo sát điều kiện phân tích xác định acrylamid 16 Thẩm định phương pháp 16 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.4.5 Phương pháp lấy mẫu 16 Phương pháp xử lýmẫu sơ 17 Phương pháp phân tích LC-MS/MS 17 Phương pháp thẩm định 17 Phương pháp xử lýkết 20 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Khảo sát điều kiện tách LC-MS/MS 21 3.1.1 3.1.2 3.2 Khảo sát điều kiện khối phổ 21 Khảo sát điều kiện sắc kýlỏng 24 Khảo sát điều kiện xử lýmẫu 27 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 32 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.4 Khảo sát việc dùng dung dịch carrez 28 Khảo sát loại cột SPE 28 Khảo sát thể tí ch rửa giải SPE 29 Đánh giá ảnh hưởng 30 Độ phùhợp hệ thống 32 Độ đặc hiệu 32 Giới hạn phát (LOD) vàgiới hạn định lượng (LOQ) 34 Khoảng làm việc đường chuẩn 35 Độ lặp lại độ 36 Ứng dụng phương xác định acrylamid số mẫu thực địa bàn HàNội 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Giải nghĩa Từ viết tắt ACN AOAC Acetonitril Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội cộng đồng phân tích chí nh thức) CE Collision energy (Năng lượng va chạm) CZE Capillary zone electrophoresis (Điện di mao quản vùng) ESI Electrospray ionization (Ion hóa phun điện tử) GC-MS/MS GC-ECD HPLC-DAD Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc kýkhí khối phổ hai lần) Gas chromatography with Electron Capture Detector (Sắc ký với detector cộng kết điện tử) High-performance liquid chromatography with a diode-array detector (Sắc kýlỏng hiệu cao với detector mảng diod) IP Identification point (Điểm nhận dạng) IS Internal standard (chất chuẩn nội) LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ hai lần) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantification (Giới hạn định lượng) DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Độ tan acrylamid số dung môi 2 Bảng 1.2 Nguy acrylamid thông qua số thực phẩm Bảng 1.3 Một số phương pháp xác định acrylamid Bảng 3.1 Mảnh mẹ, mảnh acrylamid vàd3-acrylamid 21 Bảng 3.2 Các thông số tối ưu MS để phân tích acrylamid 23 Bảng 3.3 Khảo sát cột sắc ký 24 Bảng 3.4 Chương trình gradient phân tích acrylamid 26 Bảng 3.5 Kết thẩm định tính tương thích hệ thống 32 Bảng 3.6 Tỷ lệ ion acrylamid 33 10 Bảng 3.7 Kết thẩm định khoảng tuyến tí nh 35 11 Bảng 3.8 Độ lặp lại độ thu hồi acrylamid nồng độ 37 12 Bảng 3.9 Hàm lượng acrylamid số mẫu bim bim khoai tây vàkhoai tây chiên 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo acrylamid Hình 1.2 Cơ chế đề xuất theo phản ứng Maillard, hì nh thành acrylamid từ asparagin đường khử Trang Hình 1.3 Mơhì nh hệ thống HPLC-MS/MS 11 Hình 1.4 Bộ phận phân tích khối ba tứ cực 12 Hình 3.1 Phổ khối MS acrylamid sau bắn pháion 22 Hình 3.2 Sắc ký đồ thu khảo sát cột Symmetry® C18, Atlantilis HILIC, IntertsilTM HILIC vàCosmosil HILIC Hình 3.3 Sắc ký đồ thu sử dụng cột Cosmosil HILIC chương trình gradient chọn nồng độ 100 ng/mL 25 27 Hình 3.4 Kết khảo sát thể tí ch carrez 28 Hình 3.5 Kết khảo sát hiệu suất cột C18 vàHLB 29 10 11 12 Hình 3.6 Tí n hiệu acrylamid khơng rửa giải và3 lần rửa liên tiếp Hình 3.7 Quy trình xử lýmẫu tối ưu Hình 3.8 Sắc ký acrylamid mẫu trắng, mẫu chuẩn dung môi 100ng/mL vàmẫu trắng thêm chuẩn 100 ng/mL dịch đo 30 31 33 13 Hình 3.9 Sắc ký đồ acrylamid LOD 34 14 Hình 3.10 Sắc ký đồ acrylamid LOQ 35 15 Hình 3.11 Khoảng làm việc acrylamid 36 16 Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu M1 vàM7 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, xu hướng tiêu thụ loại thức ăn nhanh khoai tây chiên, bánh mì, mì ăn liền…ngày trở nên phổ biến Theo tiềm ẩn mối nguy an tồn thực phẩm, có mặt chất độc sinh trì nh chế biến Gần đây, nhàkhoa học có cảnh báo xuất chất có khả gây ung thư acrylamid (theo Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế IARC) [15] Acrylamid hì nh thành trì nh chế biến thực phẩm cóchứa acid amin asparagin vànhóm cacbonyl điều kiện nhiệt độ cao chiên rán [24] Tháng năm 2002, Cơ quan Quản lýthực phẩm Thuỵ Điển với nhóm nghiên cứu trường Đại học Stockholm lần tìm diện acrylamid số thực phẩm có nguồn gốc tinh bột chế biến nhiệt độ cao Nghiên cứu độc tí nh gây ung thư acrylamid Ngoài ra, acrylamid xếp vào nhóm chất có khả gây độc tí nh thần kinh, độc tính sinh sản, độc tính gen vàảnh hưởng đến khả sinh sản (hiệu ứng gây hại nhiễm sắc thể) động vật gặm nhấm [21] Những nghiên cứu độc tính acrylamid người hạn chế Tuy vậy, việc phân loại acrylamid chất cónguy gây ung thư người thu hút quan tâm nhà nghiên cứu phát định lượng acrylamid Từ đó, giới, nhiều nghiên cứu định lượng acrylamid thực phẩm tiến hành Tuy nhiên, Việt Nam chưa có phương pháp thức để xác định acrylamid thực phẩm Điều đặt yêu cầu cấp thiết phải có phương pháp phân tích đáng tin cậy có độ nhạy thích hợp để kiếm soát lượng acrylamid mẫu thực phẩm Xuất phát từ yêu cầu thực tế vànhận thấy nghiên cứu giới, acrylamid xuất chủ yếu sản phẩm cónguồn gốc tinh bột chế biến qua qtrình chiên rán, vìthế chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Xác định hàm lượng acrylamid số sản phẩm có nguồn gốc tinh bột sắc ký lỏng khối phổ” với mục tiêu sau: - Xây dựng vàthẩm định phương pháp xác định acrylamid bim bim khoai tây vàkhoai tây chiên LC-MS/MS - Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng acrylamid số sản phẩm bim bim khoai tây vàkhoai tây chiên thị trường Với kết thẩm định, cho thấy phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu cóthể ứng dụng phân tí ch acrylamid số mẫu bim bim vàkhoai tây chiên 3.4 Ứng dụng phương xác định acrylamid số mẫu thực địa bàn HàNội Trên cở xây dựng phương pháp, tiến hành xác định hàm lượng acrylamid số mẫu bim bim khoai tây vàkhoai tây chiên địa bàn HàNội, kết thu sau: Bảng 3.9 Hàm lượng acrylamid số mẫu bim bim khoai tây khoai tây chiên Loại mẫu Tên Hàm lượng Lượng bim bim Trọng mẫu (µg/g) khoai tây chiên tương ứng lượng với 20 µg acrylamid (g) gói (g) M1 0,861 23,2 30 M2 1,389 14,4 30 M3 1,074 18,6 30 M4 0,741 30,0 30 M5 Không phát _ 30 M6 0,621 32,2 _ Khoai tây M7 Không phát _ _ chiên M8 Không phát _ _ M9 0,325 61,5 _ Bim bim khoai tây Do điều kiện thực nghiệm hạn chế, chưa thể tiến hành với lượng mẫu lớn Tuy vậy, qua phân tích số mẫu thực ta thấy rằng: - Đa số mẫu bim bim khoai tây đem xác có chứa acrylamid với hàm lượng từ 0,741 – 1,389 µg/g - Các mẫu khoai tây chiên phát có acrylamid, nhiên có hàm lượng thấp so với loại bim bim khoai tây vàcó mẫu khoai tây chiên khơng phát cóacrylamid 38 Khuyến cáo: Đối với phụ nữ có thai: theo FDA/WHO, mức tiêu thụ tối đa 20 µg acrylamid/ngày Nếu tiêu thụ khoảng 14,4 – 61,5 g bim bim khoai tây khoai tây chiên cóthể gây ảnh hưởng đến sức khỏe mẹ vàthai nhi Đối với đối tượng khác (trẻ em, thiếu niên…): Lượng acrylamid phơi nhiễm hàng ngày thấp nhiều so với mức khuyến cáo tổ chức FDA/WHO tiêu thụ thời gian dài cóthể cóảnh hưởng đến thần kinh ngoại biên Dưới sắc ký đồ số mẫu thực: Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu M1 vàM7 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đề tài thu kết quả: Xây dựng vàthẩm định phương pháp xác định acrylamid mẫu bim bim khoai tây vàkhoai tây chiên LC-MS/MS - Xây dựng phương pháp - Về xử lý mẫu: cân khoảng 1g mẫu vào ống ly tâm 50 mL, loại chất béo mL n-hexan, chiết với 15 mL nước, làm cột HLB với dung môi rửa giải nước Dịch thu qua cột HLB đem phân tích LC-MS/MS - Về điều kiện LC-MS/MS  Sắc lý lỏng hiệu cao sử dụng cột Cosmosil HILIC, chế độ gradient với hệ dung môi gồm A: dung dịch amoniacetat 10 mM vàB: ACN  Phân tích MS/MS sử dụng nguồn ESI (+) - Thẩm định phương pháp - Độ phùhợp hệ thống đạt yêu cầu - Độ đặc hiệu đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn EC 657/2002 - Giới hạn phát là0,045 µg/g, giới hạn định lượng là0,15 µg/g - Khoảng nồng độ tuyến tính cóhệ số tương quan R > 0,995 - Độ lặp lại độ thu hồi đáp ứng yêu cầu AOAC Đã ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng số mẫu bim bim khoai tây khoai tây chiên thu mua địa bàn HàNội - Với mẫu bim bim khoai tây: 4/5 mẫu phát có chứa acrylamid với hàm lượng từ trung bình đến cao - Với mẫu khoai tây chiên: có 2/4 mẫu phát có chứa acrylamid với hàm lượng thấp so với mẫu bim bim khoai tây Kiến nghị Mở rộng phạm vi nghiên cứu, đánh giá hàm lượng acrylamid mẫu thực phẩm khác thịt, cà phê,… 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích Hóa học vi sinh vật, NXB Khoa học vàkỹ thuật, HàNội Trần Tử An (2012), Hóa phân tí ch tập 2, NXB Y học HàNội, HàNội Tiếng Anh Becalski A., Lau B.P.-Y (2005), "Determination of acrylamide in various food matrices", Chemistry and Safety of Acrylamide in Food, Springer, pp.271-284 Bermudo E., Núñez O (2006), "Analysis of acrylamide in food products by inline preconcentration capillary zone electrophoresis", Journal of Chromatography A, 1129(1), pp.129-134 Commission E (2002), "Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results", Off J Eur Comm, 221, pp.8-36 De Paola E.L., Montevecchi G (2017), "Determination of acrylamide in dried fruits and edible seeds using QuEChERS extraction and LC separation with MS detection", Food chemistry, 217, pp.191-195 Eerola S., Hollebekkers K (2007), "Acrylamide levels in Finnish foodstuffs analysed with liquid chromatography tandem mass spectrometry", Molecular nutrition & food research, 51(2), pp.239-247 Elbashir A.A., Omar M.M.A (2014), "Acrylamide analysis in food by liquid chromatographic and gas chromatographic methods", Critical reviews in analytical chemistry, 44(2), pp.107-141 Fennell T.R.,Friedman M.A (2005), "Comparison of acrylamide metabolism in humans and rodents", Chemistry and Safety of Acrylamide in food, Springer, pp.109-116 10 Fernandes J.O.,Soares C (2007), "Application of matrix solid-phase dispersion in the determination of acrylamide Chromatography A, 1175(1), pp.1-6 in potato chips", Journal of 11 Food F.W.C.o.H.I.o.A.i., Programme W.H.O.F.S (2002), Health Implications of Acrylamide in Food: Report of a Joint FAO/WHO Consultation, WHO Headquarters, Geneva, Switzerland, 25-27 June 2002, World Health Organization 12 Friedman M.A., Dulak L.H., Stedham M.A (1995), "A lifetime oncogenicity study in rats with acrylamide", Fundamental and Applied Toxicology, 27(1), pp.95-105 13 Gökmen V., Şenyuva H.Z (2005), "Determination of acrylamide in potato chips and crisps by high-performance liquid chromatography", Journal of Chromatography A, 1088(1-2), pp.193-199 14 Govaert Y., Arisseto A (2006), "Optimisation of a liquid chromatography– tandem mass spectrometric method for the determination of acrylamide in foods", Analytica chimica acta, 556(2), pp.275-280 15 Hilbig A., Freidank N (2004), "Estimation of the dietary intake of acrylamide by German infants, children and adolescents as calculated from dietary records and available data on acrylamide levels in food groups", International journal of hygiene and environmental health, 207(5), pp.463-471 16 Hoenicke K., Gatermann R (2004), "Analysis of acrylamide in different foodstuffs using liquid chromatography–tandem mass spectrometry and gas chromatography–tandem mass spectrometry", Analytica Chimica Acta, 520(12), pp.207-215 17 Johnson K.A., Gorzinski S.J (1986), "Chronic toxicity and oncogenicity study on acrylamide incorporated in the drinking water of Fischer 344 rats", Toxicology and applied pharmacology, 85(2), pp.154-168 18 Krishnakumar T.,Visvanathan R (2014), "Acrylamide in food products: A review", Journal of Food Processing & Technology, 5(7), pp.1 19 Lee M.-R., Chang L.-Y., Dou J (2007), "Determination of acrylamide in food by solid-phase microextraction coupled to gas chromatography–positive chemical ionization tandem mass spectrometry", Analytica chimica acta, 582(1), pp.19-23 20 Lineback D.R., Coughlin J.R., Stadler R.H (2012), "Acrylamide in foods: a review of the science and future considerations", Annual review of food science and technology, 3, pp.15-35 21 LoPachin R.M (2005), "Acrylamide neurotoxicity: neurological, morhological and molecular endpoints in animal models", Chemistry and safety of acrylamide in food, Springer, pp.21-37 22 Mastovska K.,Lehotay S.J (2006), "Rapid sample preparation method for LC− MS/MS or GC− MS analysis of acrylamide in various food matrices", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(19), pp.7001-7008 23 Mojska H., Gielecińska I., Stoś K (2012), "Determination of acrylamide level in commercial baby foods and an assessment of infant dietary exposure", Food and Chemical Toxicology, 50(8), pp.2722-2728 24 Mottram D.S., Wedzicha B.L., Dodson A.T (2002), "Food chemistry: acrylamide is formed in the Maillard reaction", Nature, 419(6906), pp.448 25 Park J., Kamendulis L.M (2002), "Acrylamide-induced cellular transformation", Toxicological Sciences, 65(2), pp.177-183 26 Roach J.A., Andrzejewski D (2003), "Rugged LC-MS/MS survey analysis for acrylamide in foods", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(26), pp.7547-7554 27 Rosén J.,Hellenäs K.-E (2002), "Analysis of acrylamide in cooked foods by liquid chromatography tandem mass spectrometry", Analyst, 127(7), pp.880882 28 Rosén J., Nyman A., Hellenäs K.-E (2007), "Retention studies of acrylamide for the design of a robust liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for food analysis", Journal of Chromatography A, 1172(1), pp.19-24 29 Stadler R.H (2005), "Acrylamide formation in different foods and potential strategies for reduction", Chemistry and safety of acrylamide in food, Springer, pp.157-169 30 Wilson K., Rimm E (2006), "Dietary acrylamide and cancer risk in humans: a review", Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 1(1), pp.19-27 31 Zhang Y., Dong Y (2006), "Rapid determination of acrylamide contaminant in conventional fried foods by gas chromatography with electron capture detector", Journal of Chromatography A, 1116(1-2), pp.209-216 PHỤ LỤC Khảo sát loại cột SPE Khảo sát thể tích Carrez Thẩm định độ ổn định hệ thống Sắc ký đồ thẩm định khoảng làm việc đường chuẩn Sắc ký đồ khảo sát nồng độ thêm chuẩn khác - Sắc ký đồ độ lặp lại nồng độ thêm chuẩn 0,45 µg/g - Sắc ký đồ độ lặp lại nồng độ thêm chuẩn 3,00 µg/g - Sắc ký đồ độ lặp lại nồng độ thêm chuẩn 3,00 µg/g Sắc ký đồ số mẫu thực ... NỘI NGUYỄN THỊ THU HIẾU MSV: 1401215 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACRYLAMID TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TINH BỘT BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị. .. k? ?lỏng khối phổ Sắc ký lỏng khối phổ l? ?một kỹ thu? ??t phân tích dựa kết hợp khả tách chất hệ thống HPLC khả phân tích khối detector khối phổ Một sắc k? ?lỏng khối phổ gồm: sắc k? ?lỏng (LC) v? ?khối phổ. .. giới, acrylamid xuất chủ yếu sản phẩm c? ?nguồn gốc tinh bột chế biến qua qtrình chiên rán, vìthế chúng tơi tiến hành thực đề tài: ? ?Xác định hàm lượng acrylamid số sản phẩm có nguồn gốc tinh bột sắc