XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG FRUCTOSE, GLUCOSE, SACCHAROSE TRONG THỰC PHẨM BẰNG High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG FRUCTOSE, GLUCOSE, SACCHAROSE TRONG THỰC PHẨM BẰNG High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM THOA Niên khóa: 2008 - 2012 Tháng năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG FRUCTOSE, GLUCOSE, SACCHAROSE TRONG THỰC PHẨM BẰNG High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector Hướng dẫn khoa học viên thực ThS PHÙNG VÕ CẨM HỒNG ThS NGUYỄN VĂN SANG NGUYỄN THỊ KIM THOA Tháng năm 2012 Sinh LỜI CÁM ƠN Xin chân thành cám ơn: Ban giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập trường Toàn thể quý Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Sinh học nhiệt tình truyền đạt kiến thức cho tơi suốt trình học ThS Phùng Võ Cẩm Hồng, ThS Nguyễn Văn Sang ThS Ngô Quốc Việt tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài hồn thành khóa luận tốt nghiệp Các anh chị Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng tận tình hướng dẫn tơi thời gian phân tích mẫu phương pháp HPLC – RI Tồn thể lớp DH08SH hỗ trợ, giúp đỡ động viên tơi suốt năm học Con thành kính ghi ơn ba mẹ người thân gia đình ln chỗ dựa vững chắc, động viên, khuyến khích tạo điều kiện để học tập tốt Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Sinh viên thực Nguyễn Thị Kim Thoa TÓM TẮT Trong thể người, đường đóng vai trị quan trọng Tuy nhiên, việc sử dụng đường không hợp lý nguyên nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm tiểu đường 2, tim mạch, béo phì Do đó, việc phân tích đường thực phẩm trở nên cấp thiết cho người sử dụng Phương pháp phân tích đường sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò số khúc xạ (High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector - HPLC – RI) (Waters) với cột LiChrospher® NH2 (Merck), chiết đường nước nóng xử lý mẫu theo quy trình AOAC Official Method 980.13 thực để góp phần xác định hàm lượng ba loại đường fructose, glucose, saccharose mẫu thực phẩm Kết khảo sát cho thấy hàm lượng tổng ba loại đường fructose, glucose, saccharose mẫu thử 8,1 g/100 mL (mẫu nước giải khát), 17,9 g/100 g (mẫu bánh quy) Giới hạn phát giới hạn định lượng loại đường phương pháp mẫu bánh mẫu nước giải khát tương đối thấp Đối với mẫu nước giải khát, giới hạn phát trung bình 0,09 g/100 mL mẫu bánh 0,47 g/100 g, hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu bánh mẫu nước giải khát cao, trung bình từ 103% đến 105% (mẫu nước giải khát), từ 90% đến 99% (mẫu bánh quy) Kết định lượng ba loại đường fructose, glucose, saccharose mẫu thực tế cho thấy hàm lượng đường mẫu bánh từ 4,07 g/100 g đến 16,44 g/100 g, mẫu nước giải khát từ 7,68 g/100 mL đến 18,37 g/100 mL Như vậy, phương pháp HPLC – RI dùng để phân tích định lượng đường có mẫu bánh, mẫu nước giải khát số mẫu thực phẩm khác SUMMARY Thesis title "Determination of fructose, glucose, saccharose content in food by High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector method" In body’s human, sugar plays a very important role However, many research results have shown that using too much sugar can be the cause of dangeruos diseases such as cadiopathy, obeseness, diabetes Therefore, the analysis of sugar in food has become imperative for consumers The analysis of sugar used the High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector - HPLC - RI ) (Waters) system with its LiChrospher® NH2 (Merck), extracted sugar by hot water at 70oC in 30 minutes, applied according to the AOAC Official Method 980.13 procedure The content of fructose, glucose, and saccharose on beverage and biscuit samples are 8.1 g/100 mL, 17.9 g/100 g, respectively The recovery of the method is high They are average in range 103% to 105% for beverage sample, and from 90% to 99% for biscuit sample Detection limit and limit quantitation of the method is relatively low Detection limit was 0.09 g/100 mL for beverage sample, and 0.47 g/100 g for biscuit sample Quantitation results of fructose, glucose, saccharose on food sample were from 4.07 g/100 g to 16.44 g/100g for cake sample, from 7.68 g/100 mL to 18.37 g/100 mL for beverage sample Therefore, the HPLC - RI can be used for analysis of sugar content in cake, and beverage sample as well as other food samples Key word: Sugar, HPLC – RI, AOAC 980.13 MỤC LỤC Trang LỜI CÁM ƠN TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH viiii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan loại đường đường sử dụng thực phẩm 2.1.1 Đường glucose sử dụng thực phẩm 2.1.2 Đường fructose sử dụng thực phẩm 2.1.3 Đường saccharose sử dụng thực phẩm 2.2 Tác động đường (fructose, glucose, saccharose) lên thể 2.3 Phương pháp HPLC – RI 10 2.3.1 Khái quát phương pháp HPLC 10 2.3.2 Cấu tạo phận HPLC 11 2.4 Các phương pháp xác định hàm lượng đường 12 2.4.1 Phương pháp hóa học 12 2.4.2 Phương pháp vật lý 13 2.4.3 Phương pháp enzyme 13 2.4.4 Phương pháp sắc ký 14 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.2 Vật liệu nghiên cứu 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Phương pháp phân tích đường 20 3.3.2 Khảo sát hiệu suất thu hồi quy trình phân tích 23 3.3.3 Xác định giới hạn phát (LOD) đường phương pháp 24 3.3.4 Khảo sát số mẫu thật 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Dựng đường chuẩn loại đường để phân tích mẫu NGK mẫu bánh 26 4.2 Xác định hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu NGK bánh 27 4.3 Khảo sát giới hạn phát phương pháp HPLC – RI 29 4.4 Kết khảo sát số mẫu thật 31 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN: Acetonnitrile AOAC: Association of Official Analytical Chemists FDA: Food and Drug Administration HDL: High density lipoprotein HFCS: High Fructose Corn Syrup HPAEC: High Performance Anion Exchange Chromatography HPLC: High Performance Liquid Chromatography HPTLC: High Performance Thin – Layer Chromatography ISO: International Standard Organization IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry LOD: Limit of Detection LOQ: Limit of Quatitation NGK: Nước giải khát RI: Refrative Index Detector S/N: Signal to noise (ratio) SK – QP: Sắc ký – Quang phổ TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam UV – vis: Ultra Violet – vissible VLDL: Very low density lipoprotein DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các dạng tồn D – glucose Bảng 2.2 Bảng tóm tắt ưu nhược điểm phương pháp phân tích đường 16 Bảng 4.1 Đường chuẩn loại đường để phân tích mẫu nước giải khát 26 Bảng 4.2 Đường chuẩn loại đường để phân tích mẫu bánh 26 Bảng 4.3 Hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu nước giải khát 28 Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi độ tái lặp quy trình phân tích mẫu bánh 28 Bảng 4.5 Khảo sát LOD, LOQ phương pháp mẫu nước giải khát 29 Bảng 4.6 Khảo sát LOD, LOQ phương pháp mẫu bánh 30 Bảng 4.7 Kết khảo sát hàm lượng đường số mẫu thực phẩm 31 DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Mơ hình phân tử D – Glucose Hình 2.2 Các dạng tồn D - Glucose dung dịch Hình 2.3 Mơ hình phân tử D – Fructose Hình 2.4 Các dạng tồn D - Fructose dung dịch Hình 2.5 Sự chuyển hóa fructose môi trường kiềm Hình 2.6 Mơ hình phân tử Saccharrose Hình 2.7 Công thức cấu tạo Saccharose Hình 2.8 Phản ứng thủy phân Saccharose Hình 2.9 Sơ đồ hệ thống HPLC 11 Hình 3.1 Mẫu thực phẩm để phân tích 18 Hình 3.2 Hệ thống HPLC - RI phòng Sắc ký - Quang phổ 19 Hình 3.3 Sơ đồ tóm tắt bước thực nghiệm 20 Hình 3.4 Một số giai đoạn xử lý mẫu bánh 21 Hình 4.1 Đồ thị đường chuẩn loại đường để phân tích mẫu nước giải khát 27 Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn loại đường để phân tích mẫu bánh 27 Phụ lục Sắc ký đồ đường chuẩn loại đường (fructose, glucose, saccharose) để phân tích mẫu bánh nồng độ 200 mg/L Phụ lục Xác định hàm lượng đường có mẫu bánh phân tích Bảng Xác định hàm lượng đường có mẫu bánh phân tích m Vđm (g) (mL) 5,127 100 5,075 LLL Diện tích F Fru Glu Sac 50 74554 497220 100 50 70474 508369 5,1558 100 50 72573 505157 5,127 100 50 74554 497220 5,075 100 50 70474 508369 5,1558 100 50 72573 505157 5,121 100 50 71211 502413 Hàm lượng Co(mg/L) Hàm lượng C (g/100 g) Sac tổng Fru Glu Sac Fru 30 153 0,0 2,9 14,9 17,8 28 156 0,0 2,8 15,4 18,1 29 155 0,0 2,8 15,1 17,8 30 153 0,0 2,9 14,9 17,8 28 156 0,0 2,8 15,4 18,1 29 155 0,0 2,8 15,1 17,8 28 154 0,0 2,8 15,1 17,8 0,0 2,8 15,1 17,9 Trung bình Glu Hàm lượng (g/100 g) LLL: Lần lặp lại; m: Khối lượng mẫu bánh; Vđm: Thể tích định mức mẫu; F: Hệ số pha loãng mẫu; Co: Hàm lượng đường suy từ đường chuẩn; C: Hàm lượng đường có 100 mL mẫu phân tích; Fru: Đường fructose; Glu: Đường glucose; Sac: Đường saccharose Sắc ký đồ xác định hàm lượng đường (fructose, glucose, saccharose) có mẫu bánh phân tích Phụ lục Xác định hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu bánh Bảng Hàm lượng chuẩn loại đường thêm vào mẫu bánh phân tích LLL Hàm lượng chuẩn loại đường thêm vào mẫu bánh (g) Mẫu + 0,4 (g) Thí nghiệm L1 Thí nghiệm L2 Thí nghiệm L3 Fru Glu Sac Fru Glu Sac Fru Glu Sac 0,4186 0,3805 0,4076 0,4186 0,4117 0,4266 0,3992 0,4117 0,4338 0,4006 0,4422 0,4338 Thí nghiệm L1 Fru Glu Sac 0,3805 0,4076 0,4266 0,3992 0,4006 0,4422 Mẫu + 0,6 (g) Thí nghiệm L2 Fru Glu Sac LLL 0,5932 0,6418 0,6419 0,5932 0,5903 0,6554 0,6333 0,5903 0,6070 0,6071 0,6398 0,6070 Thí nghiệm L1 Fru Glu Sac 0,6418 0,6419 0,6554 0,6333 0,6071 0,6398 Mẫu + 0,8 (g) Thí nghiệm L2 Fru Glu Sac 0,4730 0,4110 0,4200 0,4190 0,4240 0,3800 0,4738 0,4190 0,4023 Thí nghiệm L3 Fru Glu Sac 0,6530 0,6230 0,6600 0,7460 0,6240 0,6040 0,9536 0,6376 0,6922 Thí nghiệm L3 Fru Glu Sac LLL 0,8028 0,8082 0,8006 0,8028 0,8082 0,8006 0,8040 0,8020 0,8303 0,8503 0,7703 0,8055 0,8503 0,7703 0,8055 0,8410 0,8000 0,8530 0,8083 0,8053 0,7947 0,8083 0,8053 0,7947 0,8880 0,8760 0,7547 LLL: Lần lặp lại;; Fru: Đường fructose; Glu: Đường glucose; Sac: Đường saccharose Bảng Độ lặp lại tái lặp lại quy trình mẫu bánh Độ lặp lại lần Mẫu + 0,4 (g) Mẫu + 0,6 (g) Mẫu + 0,8 (g) Mẫu + 0,4 (g) Mẫu + 0,6 (g) Mẫu + 0,8 (g) Trung bình loại đường Độ lặp lại tái lặp lại (%) Thí nghiệm L1 Thí nghiệm L2 Thí nghiệm L3 Fru 0,97 1,59 1,66 Glu 1,71 1,28 1,84 Sac Fru Glu Sac Fru Glu Sac 2,33 0,82 0,98 1,59 1,40 0,90 0,64 1,11 1,73 2,36 2,70 1,80 0,60 1,84 1,73 0,75 1,95 3,02 1,95 1,70 2,13 Trung bình thí nghiệm lặp lại Frutose Glucose Saccharose 1,06 1,20 1,52 1,71 1,42 1,88 1,45 1,84 2,29 1,41 1,49 1,90 L1: Lần 1; L2: Lần 2: L3: Lần 3; Fru: Đường fructose; Glu: Đường glucose; Sac: Đường saccharose Bảng Hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu bánh LLL TB LLL TB LLL TB Hiệu suất thu hồi đường mẫu bánh (%) Mẫu + 0,4 (g) Thí nghiệm L1 Thí nghiệm L2 Thí nghiệm L3 Fru Glu Sac Fru Glu Sac Fru Glu Sac 91,32 88,70 94,13 87,83 89,9 94,23 93,19 90,34 96,59 91,10 91,73 94,54 88,59 90,56 96,74 89,87 86,79 97,52 89,70 90,77 98,17 87,15 90,26 94,02 91,31 89,17 97,35 90,71 90,40 95,61 87,86 90,24 95,00 91,46 88,77 97,15 Mẫu + 0,6 (g) Thí nghiệm L1 Thí nghiệm L2 Thí nghiệm L3 Fru Glu Sac Fru Glu Sac Fru Glu Sac 92,68 90,27 102,12 89,49 89,57 97,70 87,21 90,07 109,34 89,79 92,55 102,83 91,29 89,66 93,16 89,89 91,52 110,07 91,51 91,87 100,61 88,20 87,56 97,61 88,29 89,31 107,88 91,33 91,56 101,85 89,66 88,93 96,16 88,46 90,30 109,10 Mẫu + 0,8 (g) Thí nghiệm L1 Thí nghiệm L2 Thí nghiệm L3 Fru Glu Sac Fru Glu Sac Fru Glu Sac 93,11 90,61 97,78 90,8 89,83 94,25 87,06 89,50 101,99 93,29 87,33 100,86 89,46 89,39 95,46 90,55 92,00 102,89 90,55 89,14 100,7 89,96 88,76 99,80 88,01 90,47 101,04 92,32 89,03 99,78 90,07 89,33 96,50 88,54 90,66 101,97 Fructose Mẫu + 0,4 (g) Mẫu + 0,6 (g) Mẫu + 0,8 (g) TB loại đường Trung bình thí nghiệm Glucose Saccharose 90,01 89,80 95,92 89,82 90,26 102,37 90,31 89,67 99,42 90,04 89,91 99,24 LLL: Lần lặp lại; TB: Trung bình; L1: Lần 1; L2: Lần 2; L3: Lần 3; Fru: Đường fructose; Glu: Đường glucose; Sac: Đường saccharose Sắc ký đồ xác định hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu bánh (thêm 0,4 g chuẩn loại đường) Sắc ký đồ xác định hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu bánh (thêm 0,6 g chuẩn loại đường) Sắc ký đồ xác định hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu bánh (thêm 0,8 g chuẩn loại đường) Phụ lục Khảo sát giới hạn phát (LOD) phương pháp,trên mẫu bánh nồng độ 10 mg/L Bảng 10 Khảo sát LOD, LOQ phương pháp mẫu bánh Chiều cao Cthêm Độ nhiễu (mg/L) Fru Glu Sac 969 1018 990 183 50 10 939 900 1048 186 50 10 1032 943 890 151 50 10 955 890 981 162 50 10 942 935 874 143 50 10 972 890 916 108 50 10 949 995 940 101 50 10 LOD (g/100 mL) LOQ (g/100 mL) Fru Sac Fru Glu Sac Fru Glu Sac 5,30 5,41 0,57 0,54 0,55 1,89 1,80 1,85 5,05 5,63 0,59 0,62 0,53 1,98 2,07 1,77 6,83 5,89 0,44 0,48 0,51 1,46 1,60 1,70 5,90 6,06 0,51 0,55 0,50 1,70 1,82 1,65 6,59 6,11 0,46 0,46 0,49 1,52 1,53 1,64 9,00 8,48 0,33 0,36 0,35 1,11 1,21 1,18 9,40 9,31 0,32 0,30 0,32 1,06 1,02 1,07 Trung bình lần lặp lại S/N LOD (g/100 mL) LOQ (g/100 mL) 6,87 6,68 6,70 0,46 0,47 0,47 1,53 1,58 1,55 LLL: Lần lặp lại; m: Khối lượng mẫu; Vđm: Thể tích định mức mẫu; Cthêm: Nồng độ chuẩn đường thêm vào mẫu; F: Hệ số pha loãng mẫu; S/N: Tỷ lệ nhiễu nền; LOD: Giới hạn phát phương pháp; LOQ: Giới hạn định lượng phương pháp LLL m (g) 5 5 5 S/N Glu 5,56 4,84 6,25 5,49 6,54 8,24 9,85 Vđm (mL) 100 100 100 100 100 100 100 F Sắc ký đồ khảo sát giới hạn phát (LOD) phương pháp,trên mẫu bánh nồng độ 10 mg/L Phụ lục 10 Sắc ký đồ số mẫu bánh mẫu NGK thực tế Sắc ký đồ phân tích mẫu bánh thực tế Sắc ký đồ phân tích mẫu NGK thực tế (pha động 75 ACN : 25 H2O) ... LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG FRUCTOSE, GLUCOSE, SACCHAROSE TRONG THỰC PHẨM BẰNG High Performance Liquid Chromatography – Refractive Index Detector Hướng dẫn khoa học viên thực ThS PHÙNG... tài ? ?Xác định hàm lượng đường fructose, glucose, saccharose thực phẩm phương pháp HPLC – RI” thực 1.2 Yêu cầu đề tài Để tiến hành phân tích, định lượng đường mẫu thực phẩm nghiên cứu đạt kết xác. .. HPLC – RI áp dụng để phân tích định lượng đường số mẫu thực tế Kết khảo sát hàm lượng đường số mẫu thực phẩm thể bảng 4.7 Bảng 4.7 Kết khảo sát hàm lượng đường số mẫu thực phẩm Mẫu Hàm lượng đường