Xác định hàm lượng một số acid sialic trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LCMSMS)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ ACID SIALIC TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ ACID SIALIC TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Phạm Thị Thanh Hà PGS TS Lê Thị Hồng Hảo HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phạm Thị Thanh Hà PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo tâm huyết tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt thời gian thực hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành tới PGS TS Nguyễn Thị Ánh Hường cho lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian tạo điều kiện tối đa giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Cao Công Khánh anh chị, bạn khoa Nghiên cứu thực phẩm khoa Chất lượng, phụ gia chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện nhiệt tình giúp đỡ thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học, mơn Hóa phân tích – trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô giảng dạy giúp đỡ tơi q trình học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè – người đồng hành thiếu học tập sống ln động viên khích lệ tơi ngày qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Hồng Ngọc MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan acid sialic 1.1.1 Nguồn gốc - Chức 1.1.2 Cấu trúc - phân loại 1.2 Tổng quan N-acetylneuraminic acid (NANA) N-glycolyl-D-neuraminic acid (NGNA) 1.2.1 Công thức cấu tạo 1.2.1.1 NANA 1.2.1.2 NGNA 1.2.2 Tính chất vật lý, hóa học 1.2.3 Tác dụng sinh học 1.3 Tổng quan phương pháp xác định NANA NGNA 10 1.4 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS) 14 1.4.1 Nguyên tắc chung 14 1.4.2 Sơ đồ cấu tạo 15 1.4.3 Detector khối phổ ba tứ cực (Triple Quadrupole Detector)21 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Phương tiện nghiên cứu 20 2.2.1 Chất chuẩn 20 2.2.2 Hóa chất, dung môi 20 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Quy trình xử lý mẫu dự kiến 21 2.3.2 Khảo sát điều kiện khối phổ 21 2.3.3 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 22 2.3.4 Thẩm định phương pháp 22 2.4 Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng acid sialic TPBVSK 24 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 25 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 26 3.1.1 Kết khảo sát điều kiện khối phổ 26 3.1.1.1 Khảo sát lựa chọn cột tách 26 3.1.1.2 Khảo sát lựa chọn chương trình LC-MS/MS 26 3.1.2 Kết khảo sát điều kiện xử lý mẫu 28 3.1.2.1 Quy trình xử lý mẫu đề xuất 28 3.1.2.2 Khảo sát lựa chọn nồng độ dung dịch acid formic 28 3.1.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 30 3.1.2.4 Khảo sát thời gian thủy phân 33 3.1.2.5 Quy trình xử lý mẫu sau khảo sát 35 3.2 Thẩm định phương pháp 35 3.2.1 Tính thích hợp hệ thống 35 3.2.2 Tính đặc hiệu, chọn lọc 36 3.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 38 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 41 3.2.5 Độ lặp lại 43 3.2.6 Độ thu hồi 44 3.3 Kết xác định hàm lượng NANA số mẫu TPBVSK 45 Chương BÀN LUẬN 48 4.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 48 4.2 Xây dựng phương pháp phân tích LC-MS/MS 49 4.3 Thẩm định phương pháp 49 4.4 Ứng dụng 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe NANA N-Acetyl-D-neuraminic acid NGNA N-glycolyl-D-neuraminic acid AOAC Association of Analytical Hiệp hội nhà hóa phân tích Ultraviolet visible Quang phổ hấp thụ tử ngoại - Communities UV-Vis khả kiến LC – MS/MS Liquid chromatography tandem- Sắc ký lỏng khối phổ hai lần mass spectrometry HPLC-FLD High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao - Chromatography - Fluorescence detector huỳnh quang detector TLC Thin layer Chromatography HPAEC-PAD High exchange performance Sắc ký mỏng anion Sắc ký trao đổi anion hiệu chromatography - cao - detector đo dòng Pulsed amperometric detection có sử dụng xung LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng KDN 2-keto-3-deoxynononic acid ESI Electrospray ionization MRM Multiple reaction monitoring DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Một số phương pháp xác định acid sialic 11 Bảng 2.1 Quy trình xử lý mẫu dự kiến 21 Bảng 2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 22 Bảng 3.1 Các mảnh ion mẹ ion NANA NGNA sau bắn phá 27 Bảng 3.2 Kết khảo sát nồng độ acid formic 29 Bảng 3.3 Kết khảo sát nhiệt độ thủy phân 31 Bảng 3.4 Kết khảo sát thời gian thủy phân 33 Bảng 3.5 Thời gian lưu Tín hiệu (Diện tích píc) NANA NGNA sau lần tiêm lặp 36 Bảng 3.6 Độ đặc hiệu, chọn lọc NANA 36 Bảng 3.7 Độ đặc hiệu, chọn lọc NGNA 37 Bảng 3.8 Khoảng tuyến tính NANA nồng độ thấp 38 Bảng 3.9 Khoảng tuyến tính NANA nồng độ cao 39 Bảng 3.10 Khoảng tuyến tính NGNA nồng độ thấp 40 Bảng 3.11 Khoảng tuyến tính NGNA nồng độ cao 40 Bảng 3.12 Kết LOD - LOQ NANA NGNA 41 Bảng 3.13 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp 43 Bảng 3.14: Kết độ thu hồi NANA 44 Bảng 3.15: Kết độ thu hồi NGNA 45 Bảng 3.16 Kết phân tích NANA NGNA số mẫu thực 46 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Khung chung Neuraminic acid Hình 1.2 Cấu trúc NANA, NGNA KDN Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo NANA Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo NGNA Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng – khối phổ 16 Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo detector khối phổ ba tứ cực 17 Hình 3.1 Sắc đồ chuẩn NANA NGNA sau tối ưu điều kiện khối phổ 27 Hình 3.2 Quy trình xử lý mẫu sơ 28 Hình 3.3 Kết khảo sát nồng độ acid với NANA TPBVSK dạng sữa bột, sữa lỏng nước yến 30 Hình 3.4 Kết khảo sát nồng độ acid với NGNA TPBVSK dạng sữa bột, sữa lỏng nước yến 30 Hình 3.5 Kết khảo sát nhiệt độ với NANA TPBVSK dạng sữa bột, sữa lỏng nước yến 32 Hình 3.6 Kết khảo sát nhiệt độ với NGNA TPBVSK dạng sữa bột, sữa lỏng nước yến 32 Hình 3.7 Kết khảo sát thời gian thủy phân với NANA TPBVSK dạng sữa bột, sữa lỏng nước yến 34 Hình 3.8 Kết khảo sát thời gian thủy phân với NGNA TPBVSK dạng sữa bột, sữa lỏng nước yến 34 Hình 3.9 Quy trình xử lý mẫu sau khảo sát 35 Hình 3.10 Sắc đồ chuẩn mẫu thực 37 Hình 3.11 Đường chuẩn NANA nồng độ cao nồng độ thấp 39 Hình 3.12 Đường chuẩn NGNA nồng độ cao nồng độ thấp 41 Hình 3.13 Sắc đồ NANA NGNA nồng độ LOQ 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên thực phẩm trình chế biến bổ sung thêm chất có tác dụng hỗ trợ Khái niệm TPBVSK người Nhật sử dụng năm 1980 để thực phẩm chế biến có chứa thành phần khơng có giá trị dinh dưỡng giúp nâng cao sức khoẻ cho người sử dụng Chính ưu điểm vậy, TPBVSK quảng cáo cách rầm rộ phương tiện thông tin đại chúng với công dụng hứa hẹn mạng lại cải thiện sức khỏe Tuy nhiên, quảng cáo, nhà sản xuất đưa công dụng, không đề cập đến chất lượng tương ứng sản phẩm TPBVSK sản xuất sử dụng rộng rãi thị trường, chủ yếu định hướng đến nhóm đối tượng chế độ dinh dưỡng đặc biệt với nhiều hoạt chất bổ sung để tăng cường tác dụng hỗ trợ Một nhóm chất bổ sung TPBVSK acid sialic Acid sialic nhóm khoảng 60 monosaccaride có khung acid neuraminic acid - đường acid có carbon Trong tự nhiên, nhóm thường tìm thấy nhiều động vật có xương sống, vài lồi khơng xương sống số loài vi sinh vật (bao gồm virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh), gần không phát giới thực vật sinh vật nhân sơ Acid sialic biết đến nhóm đường liên kết vị trí đầu cuối oligosaccharide bề mặt tế bào (gangliosides, glycolipid, glycoprotein) glycan liên hợp [29], [23], [6] Với chức gắn kết glycan, acid sialic từ lâu cơng nhận số vai trò quan trọng sinh học ngăn ngừa phân rã protein, trì nâng cao độ nhận biết, nhân lên, miễn dịch tế bào, đặc biệt tế bào thần kinh Vì lợi ích mang lại, acid sialic trở nên công nhận thành phần quan trọng số loại thực phẩm bảo vệ sức khỏe, chủ yếu tập trung vào đối tượng trẻ sơ sinh, thiếu niên độ tuổi phát triển người chế độ dinh dưỡng đặc biệt Các nhà khoa học phân chia Acid sialic thành nhóm 5-acetamido-2keto-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactonononic acid (N-acetylneuraminic acid, NANA) 2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galactonononic acid (2-keto-3-deoxynononic acid, KDN) Sự khác nhóm nhóm vị trí C-5 Gần acid sialic lại dẫn xuất acid sialic Nhóm NANA phân bố phổ biến KDN hầu hết loại tế bào động vật có xương sống Trong phân nhóm NANA, có acid sialic quan tâm nhiều NANA dẫn xuất hydroxyl NANA N-glycolyl-D-neuraminic acid (NGNA) Các nhà sản xuất quảng cáo ghi nhãn thức acid sialic sản phẩm họ Đồng thời nhà khoa học giới phát triển nhiều phương pháp khác để định danh định lượng acid sialic mẫu khác Các phương pháp sử dụng đa dạng đề cập đến như: UVVIS, HPLC-FLD, HPEAC-PAD, LC-MS/MS,… Tuy nhiên, giới Việt Nam chưa có phương pháp tiêu chuẩn để xác định hàm lượng acid sialic nói chung mẫu TPBVSK nói riêng Từ tiềm phát triển thị trường, lợi ích - nguy mà nhóm acid sialic mang đến, đồng thời góp phần kiểm sốt chất lượng sản phẩm có chứa acid sialic thị trường, nâng cao hiệu cho người sử dụng, đề tài: “Xác định hàm lượng số acid sialic thực phẩm bảo vệ sức khỏe kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)”, lựa chọn với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng N-Acetyl-D-neuraminic acid (NANA) N-glycolyl-D-neuraminic acid (NGNA) thực phẩm bảo vệ sức khỏe kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng NANA NGNA thực phẩm bảo vệ sức khỏe (sữa bột, sữa lỏng nước yến) thị trường ... Acid formic - Acetonitrile 2.2.3 Thi t bị, dụng cụ Thi t bị: 20 - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối detector khối phổ hai lần Acquity Xevo TQD - Waters - Các thi t bị phụ trợ phòng thử nghiệm... nhanh thi t bị LOD NANA HPAEC-PAD NGNA 3,0 [40] 1,8 µg/mL LC-MS/MS LC-MS/MS Sialic mẫu sau Phương pháp sử dụng để thủy phân xác định hàm lượng acid enzyme phân sialic tự tồn phần tích thi t bị... Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao - Chromatography - Fluorescence detector huỳnh quang detector TLC Thin layer Chromatography HPAEC-PAD High exchange performance Sắc ký mỏng anion Sắc ký trao đổi