VŨ THỊ THANH AN xác ĐỊNH hàm LƯỢNG một số WHEY PROTEIN TRONG THỰC PHẨM bổ SUNG BẰNG sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ THANH AN XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ WHEY PROTEIN TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ THANH AN Mã sinh viên: 1401007 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ WHEY PROTEIN TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà Ths Nguyễn Thị Hồng Ngọc Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc – người thầy trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ nhiệt tình anh chị Khoa Nghiên cứu Thực phẩm- Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, thầy giáo Bộ mơn Hóa Phân tích- Độc chất… trình em thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất giúp đỡ, bảo em suốt trình học tập thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến: Bộ mơn Hóa phân tích- Độc chất Khoa Nghiên cứu Thực phẩm- Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ Sinh Thực phẩm Quốc gia Đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Và cuối em xin bày tỏ lòng yêu thương, biết ơn tới gia đình bạn bè người ln động viên, giúp đỡ em q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Vũ Thị Thanh An MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Whey protein 1.1.1 Giới thiệu Whey protein 1.1.2 Tổng quan α- Lactalbumin β- Lactoglobulin 1.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng α- Lactalbumin β- Lactoglobulin 1.2 Sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC 13 1.2.1 Khái niệm 13 1.2.2 Một số thông số trình sắc ký 14 1.2.3 Sắc ký gel 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 15 2.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 16 2.2.3 Thẩm định phương pháp 18 2.2.4 Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng α-LA β-LG mẫu thực 18 2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 18 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 18 2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phương pháp chuẩn bị dung dịch chuẩn 19 2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu dự kiến 19 2.4.3 Phương pháp phân tích sắc ký dự kiến 20 2.4.4 Phương pháp thẩm định 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 23 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 23 3.1.2 Khảo sát lựa chọn pha động 25 3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 27 3.1.4 Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu 28 3.1.5 Thẩm định phương pháp 32 3.2 Phân tích mẫu thực tế 38 3.3 Bàn luận 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1 Kết luận 40 4.2 Kiến nghị 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AF Formic acid Acid formic Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân Commodities tích thức CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản D Dilute Pha loãng Enzyme-Linked Immune-Sorbent Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch AOAC ELISA Assay HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography LOD Limit Of Detection Giới hạn phát LOQ Limit Of Quantification Giới hạn định lượng Mobile phase Pha động DAD Diod Array Detector Detector mảng diod SEC Size Exclusion Chromatography Sắc ký loại cỡ SP Station phase Pha tĩnh TF Total Flow Tốc độ dòng TFA Trifluoroacetic acid Acid trifluoroacetic α-LA α- Lactalbumin α- Lactalbumin β-LG β- Lactoglobulin β- Lactoglobulin MP DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng acid amin whey protein Bảng 1.2 Tóm tắt hoạt tính sinh học thường gặp whey protein Bảng 1.3 Một số phương pháp xác định α-LA β-LG sữa sản phẩm sữa Bảng 1.4 Một số phương pháp phân tích α- Lactalbumin β- Lactoglobulin sử dụng thiết bị HPLC 11 Bảng 3.1 Khảo sát thành phần pha động 25 Bảng 3.2 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng 26 Bảng 3.3 Khảo sát dung môi chiết 30 Bảng 3.4 Đường chuẩn α- Lactalbumin .34 Bảng 3.5 Đường chuẩn β- Lactoglobulin .34 Bảng 3.6 Kết độ chụm mẫu 36 Bảng 3.7 Kết độ chụm trung gian mẫu 36 Bảng 3.8 Kết phân tích độ 37 Bảng 3.9 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 38 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sự khác biệt thành phần α- LA β-LG loại sữa Hình 1.2 Cấu trúc hóa học α- Lactalbumin Hình 1.3 Cấu trúc hóa học β- Lactoglobulin Hình 1.4 Mơ hình mơ pha tĩnh cột SEC chất phân tích bị lưu giữ .14 Hình 3.1 Lựa chọn pha tĩnh 24 Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động .26 Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát pha động 27 Hình 3.4 Khảo sát quy trình chiết α-LA β-LG 28 Hình 3.5 Biểu đồ đánh giá ảnh hưởng pH đến α- LA β- LG .28 Hình 3.6 Mẫu chiết pH khác 29 Hình 3.7 Hình ảnh cảm quan dịch chiết dung môi chiết mẫu .30 Hình 3.8 Khảo sát số lần chiết 31 Hình 3.9 Sự thay đổi α- Lactalbumin β- Lactoglobulin theo nhiệt độ chiết .31 Hình 3.10 Quy trình chiết α-LA β-LG từ mẫu 32 Hình 3.11 Sắc đồ phổ mẫu trắng, mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn mix, mẫu thực mẫu thực thêm chuẩn α-LA β-LG sữa bột 33 Hình 3.12 Đường chuẩn α- Lactalbumin 34 Hình 3.13 Đường chuẩn β- Lactoglobulin 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Chiếm gần 20% khối lượng protein sữa, whey protein biết đến nguồn dinh dưỡng dồi dào, bổ sung acid amin thiết yếu cho thể lợi ích sức khỏe khác khả chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân HIV, viêm gan B, bệnh tim mạch, loãng xương Nhờ lợi ích với thể, whey protein bổ sung vào nhiều loại sản phẩm khác nhau, phù hợp với nhóm người tiêu dùng khác nhau, từ trẻ sơ sinh đến người có nhu cầu đặc biệt [10] Đó sản phẩm thực phẩm bổ sung, thức uống dinh dưỡng cho người vận động mạnh (vận động viên, người tập thể thao, thể hình…) dùng cho số tình trạng bệnh lý (kém hấp thụ chuyển hóa protein) Thị trường thực phẩm bổ sung whey protein toàn cầu dự kiến tăng trưởng với tốc độ nhanh tính chất chức đa dạng ứng dụng rộng lớn Hiện giới, nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất whey protein loại sữa bò, sữa dê sữa cừu Tuy nhiên tỷ lệ thành phần whey protein loại sữa lại khác [24], đặc biệt khác với sữa mẹ sữa mẹ lại khơng có thành phần β- Lactoglobulin [21] (loại protein chiếm tỷ lệ lớn whey protein) gây dị ứng trẻ sơ sinh Ngoài β- Lactoglobulin, thành phần sinh học whey bao gồm αLactalbumin, lactoferrin, glycomacropeptide, immunoglobulin Trong thành phần trên, α- Lactalbumin β- Lactoglobulin, vừa protein chiếm tỷ lệ lớn vừa có hoạt tính sinh học quan trọng, thường hay tách riêng bổ sung ghi nhãn nhiều sản phẩm Đang có đà phát triển mạnh với vơ số loại sản phẩm lưu hành kèm theo khác biệt thành phần nguồn nguyên liệu, thị trường thực phẩm bổ sung whey protein cần kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng Theo FDA, loại mặt hàng thực phẩm bổ sung tập trung kiểm sốt Hoa Kỳ Tuy nhiên, tính đến thời điểm giới có Trung Quốc có cơng bố tiêu chuẩn chất lượng whey protein [44] Xét riêng phạm vi Việt Nam chưa có nghiên cứu xác định đồng thời α- Lactalbumin β- Lactoglobulin thực phẩm bổ sung có chứa whey protein Do đề tài: “Xác định hàm lượng số whey protein thực phẩm bổ sung sắc ký lỏng hiệu cao” thực với mục đích sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời α-Lactalbumin βLactoglobulin thực phẩm bổ sung mẫu: sữa bột, sữa lỏng bột whey Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng α- Lactalbumin β- Lactoglobulin số thực phẩm bổ sung thị trường ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ THANH AN Mã sinh viên: 1401007 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ WHEY PROTEIN TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng... nghiên cứu xác định đồng thời α- Lactalbumin β- Lactoglobulin thực phẩm bổ sung có chứa whey protein Do đề tài: Xác định hàm lượng số whey protein thực phẩm bổ sung sắc ký lỏng hiệu cao thực với... “Thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số whey protein thực phẩm bổ sung bẳng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao tạp chí Viện Kiểm nghiệm An tồn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia), nhóm nghiên cứu rút số