Xác định hàm lượng một số whey protein trong thực phẩm bổ sung bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Là một sản phẩm phụ chiếm lượng lớn trong quá trình sản xuất phô mai 9 lít whey được sản xuất từ 10 lít sữa trong quá trình làm phô mai [27], whey được coi là nguồn cung cấp protein dồi

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà

2 Ths Nguyễn Thị Hồng Ngọc

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

2 Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà và ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc – những người thầy đã trực tiếp hướng

dẫn và chỉ bảo tận tình cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị tại Khoa Nghiên cứu Thực phẩm- Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, các thầy cô giáo tại Bộ môn Hóa Phân tích- Độc chất… trong quá trình em thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo tại Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

đã giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến:

Bộ môn Hóa phân tích- Độc chất

Khoa Nghiên cứu Thực phẩm- Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ Sinh Thực phẩm Quốc gia

Đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này

Và cuối cùng em xin bày tỏ lòng yêu thương, biết ơn tới gia đình và bạn bè những người đã luôn động viên, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Sinh viên

Vũ Thị Thanh An

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về Whey protein 3

1.1.1 Giới thiệu về Whey protein 3

1.1.2 Tổng quan về α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin 7

1.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin 9

1.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC 13

1.2.1 Khái niệm 13

1.2.2 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 14

1.2.3 Sắc ký trên gel 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 15

2.2.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 16

2.2.3 Thẩm định phương pháp 18

2.2.4 Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng α-LA và β-LG trong mẫu thực 18

2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 18

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 18

2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Phương pháp chuẩn bị dung dịch chuẩn 19

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu dự kiến 19

2.4.3 Phương pháp phân tích bằng sắc ký dự kiến 20

2.4.4 Phương pháp thẩm định 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 23

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 23

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn pha động 25

3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 27

3.1.4 Khảo sát và xây dựng quy trình xử lý mẫu 28

3.1.5 Thẩm định phương pháp 32

3.2 Phân tích mẫu thực tế 38

3.3 Bàn luận 38

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Kiến nghị 40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

Commodities

Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức

ELISA Enzyme-Linked Immune-Sorbent

Assay

Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

SEC Size Exclusion Chromatography Sắc ký loại cỡ

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng các acid amin trong whey protein 4

Bảng 1.2 Tóm tắt các hoạt tính sinh học thường gặp của whey protein 6

Bảng 1.3 Một số phương pháp xác định α-LA và β-LG trong sữa và các sản phẩm sữa 9

Bảng 1.4 Một số phương pháp phân tích α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin sử dụng thiết bị HPLC 11

Bảng 3.1 Khảo sát thành phần pha động 25

Bảng 3.2 Khảo sát và lựa chọn tốc độ dòng 26

Bảng 3.3 Khảo sát dung môi chiết 30

Bảng 3.4 Đường chuẩn α- Lactalbumin 34

Bảng 3.5 Đường chuẩn β- Lactoglobulin 34

Bảng 3.6 Kết quả độ chụm trên 3 nền mẫu 36

Bảng 3.7 Kết quả độ chụm trung gian trên 3 nền mẫu 36

Bảng 3.8 Kết quả phân tích độ đúng 37

Bảng 3.9 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 38

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Sự khác biệt về thành phần α- LA và β-LG trong các 3 loại sữa 3

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của α- Lactalbumin 7

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của β- Lactoglobulin 8

Hình 1.4 Mô hình mô phỏng pha tĩnh cột SEC và chất phân tích bị lưu giữ 14

Hình 3.1 Lựa chọn pha tĩnh 24

Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động 26

Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát pha động 27

Hình 3.4 Khảo sát quy trình chiết α-LA và β-LG 28

Hình 3.5 Biểu đồ đánh giá sự ảnh hưởng của pH đến α- LA và β- LG 28

Hình 3.6 Mẫu chiết tại các pH khác nhau 29

Hình 3.7 Hình ảnh cảm quan dịch chiết của 4 dung môi chiết mẫu 30

Hình 3.8 Khảo sát số lần chiết 31

Hình 3.9 Sự thay đổi của α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin theo nhiệt độ chiết 31

Hình 3.10 Quy trình chiết α-LA và β-LG từ mẫu 32

Hình 3.11 Sắc đồ và phổ của mẫu trắng, mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn mix, mẫu thực và mẫu thực thêm chuẩn của α-LA và β-LG trên nền sữa bột 33

Hình 3.12 Đường chuẩn α- Lactalbumin 34

Hình 3.13 Đường chuẩn β- Lactoglobulin 35

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chiếm gần 20% về khối lượng protein trong sữa, whey protein được biết đến như một nguồn dinh dưỡng dồi dào, bổ sung các acid amin thiết yếu cho cơ thể cùng các lợi ích sức khỏe khác như khả năng chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, hỗ trợ điều trị cho các bệnh nhân HIV, viêm gan B, bệnh tim mạch, loãng xương Nhờ các lợi ích với cơ thể, whey protein được bổ sung vào nhiều loại sản phẩm khác nhau, phù hợp với các nhóm người tiêu dùng khác nhau, từ trẻ sơ sinh đến những người có nhu cầu đặc biệt [10] Đó là các sản phẩm thực phẩm bổ sung, thức uống dinh dưỡng cho người vận động mạnh (vận động viên, người tập thể thao, thể hình…) và dùng cho một số tình trạng bệnh lý (kém hấp thụ và chuyển hóa protein) Thị trường thực phẩm bổ sung whey protein toàn cầu dự kiến sẽ tăng trưởng với tốc độ nhanh do tính chất chức năng đa dạng và ứng dụng rộng lớn của nó Hiện nay trên thế giới, nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất whey protein là các loại sữa bò, sữa dê và sữa cừu Tuy nhiên tỷ lệ các thành phần của whey protein trong các loại sữa lại là khác nhau [24], đặc biệt khác với sữa mẹ vì trong sữa mẹ lại không có thành phần β- Lactoglobulin [21] (loại protein chiếm tỷ lệ lớn nhất trong whey protein) có thể gây

dị ứng ở trẻ sơ sinh Ngoài β- Lactoglobulin, các thành phần sinh học của whey bao gồm Lactalbumin, lactoferrin, glycomacropeptide, và immunoglobulin Trong các thành phần trên, α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin, vừa là 2 protein chiếm tỷ lệ lớn nhất vừa có những hoạt tính sinh học quan trọng, thường hay được tách riêng và bổ sung ghi trên nhãn của nhiều sản phẩm

α-Đang có đà phát triển mạnh với vô số các loại sản phẩm đang được lưu hành kèm theo

sự khác biệt về thành phần trong các nguồn nguyên liệu, thị trường thực phẩm bổ sung whey protein cần được kiểm soát chặt chẽ hơn để đảm bảo quyền lợi của người tiêu dùng Theo FDA, đây cũng là một trong những loại mặt hàng thực phẩm bổ sung được tập trung kiểm soát tại Hoa Kỳ Tuy nhiên, tính đến thời điểm hiện tại trên thế giới chỉ có duy nhất Trung Quốc là đã có công bố tiêu chuẩn chất lượng của whey protein [44] Xét riêng trên phạm vi Việt Nam thì chưa có nghiên cứu nào xác định đồng thời α- Lactalbumin

và β- Lactoglobulin trong các thực phẩm bổ sung có chứa whey protein

2 Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin trong một số thực phẩm bổ sung trên thị trường

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Whey protein

1.1.1 Giới thiệu về Whey protein

Whey protein là một trong hai loại protein quan trọng được tìm thấy trong sữa, thu được khi loại bỏ casein bằng cách acid hóa hoặc xử lý với chymosin [36] Là một sản phẩm phụ chiếm lượng lớn trong quá trình sản xuất phô mai (9 lít whey được sản xuất từ 10 lít sữa trong quá trình làm phô mai) [27], whey được coi là nguồn cung cấp protein dồi dào được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm bổ sung

Sự khác biệt về tính chất hóa lý của casein và whey protein tạo nên sự khác biệt về công dụng của chúng khi sử dụng Whey protein được tiêu hóa nhanh chóng trong khi casein được tiêu hóa chậm hơn Việc phân biệt casein và whey protein dựa trên sự đóng góp của chúng để tổng hợp protein và ảnh hưởng của chúng đến nồng độ acid amin huyết tương [42] Ở người, lượng whey dung nạp 0,45 (g/kg) thể trọng dẫn đến sự gia tăng nhanh chóng, nhưng ngắn và tạm thời của các acid amin huyết tương đạt cực đại sau 40 phút đến 2 giờ sau khi uống và trở về giá trị cơ bản sau 3 đến 4 giờ Ngược lại, casein chuyển hóa chậm, dẫn đến nồng độ acid amin huyết tương tăng chậm hơn và thấp hơn, nhưng duy trì một nồng

độ kéo dài ít nhất 7 giờ sau khi tiêu thụ [26]

Hình 1.1 Sự khác biệt về thành phần α- LA và β-LG trong các 3 loại sữa

Để sản xuất ra whey protein, nguyên liệu đầu vào chính là các loại sữa Tuy nhiên, một nghiên cứu tiến hành dựa trên 120 mẫu sữa tươi thu hoạch từ 3 loài động vật: bò, cừu

và dê đã cho thấy sự khác nhau về hàm lượng α- LA và β-LG giữa 3 loài kể trên (Hình ảnh 1.1) [24] Chính vì thế, tùy thuộc vào loại sữa đầu vào mà lượng whey protein thu được cũng như các thành phần có trong bột whey protein cuối cùng sẽ có sự thay đổi

Sữa bò

Sữa dê

Sữa cừu

sự kết hợp của nhiều chuỗi peptid được tổ chức với nhau bởi các liên kết cộng hóa trị Dù

ở bậc cấu trúc nào whey protein cũng có thể bị biến tính bởi các tác nhân như nhiệt độ, pH hay lực chia cắt Khi biến tính, các hoạt tính sinh học của whey protein sẽ vì đó mà bị mất

đi [8]

Bảng 1.1 Hàm lượng các acid amin trong whey protein

Amino acid Hàm lượng

Về mặt thành phần, whey protein là một hỗn hợp các phân tử protein hình cầu như: β-

LG (chiếm ~50% w/w), α- LA (chiếm ~20% w/w), immunoglobulin (IgG, chiếm ~10% w/w), albumin huyết thanh (BSA, chiếm ~6% w/w) và một số các protein khác như: lactoferrin, proteose peptone 3, osteopontin, glycomacropeptid, lactoperoxidase, lysozyme,

…[28] Xét chi cụ thể về tỷ lệ các acid amin trong whey protein ta có thể tìm thấy lượng lớn các acid amin thiết yếu như leucin, glutamic, lysin, … Hàm lượng cụ thể của các aicd amin trong whey protein được thể hiện trong Bảng 1.1 [29]

5

Tác dụng- ứng dụng:

Khi xem xét whey protein dưới góc nhìn như 1 loại thực phẩm, các lĩnh vực được ứng dụng chủ yếu của whey protein là trong sản xuất bánh kẹo, đố uồng, thực phẩm chứa hàm lượng protein cao dành cho các đối tượng đặc biệt… Ngoài vai trò là một thành phần thức

ăn, whey protein còn có nhiều tính năng sinh lý có ý nghĩa quan trọng đối với việc điều trị một số các bệnh [9] Xét tổng thể (khi chưa tiến hành thủy phân tạo các peptid có hoạt tính sinh học), 2 tác dụng lớn nhất của whey protein là có khả năng phòng ngừa ung thư và bổ sung glutathione

Đầu tiên, đối với khả năng phòng ngữa ung thư, có rất nhiều các nghiên cứu chỉ ra tác dụng phòng ngữa ung thư vú, ung thư dạ dày hay ung thư do nhiễm hóa chất đã được thực hiện Điển hình, khi tiến hành nghiên khả năng ức chế tế bào ung thư trên chuột (ung thư biểu mô đại tràng do 1,2-dimethylhydrazine) của whey protein và casein bằng cách cho

ăn với chế độ ăn 20g whey protein hoặc casein /100g trọng lượng cơ thể và theo dõi trong

4 tuần Kết quả là diện tích khối u ở những con chuột được nuôi bằng whey protein nhỏ hơn đáng kể so với nhóm casein; vào cuối thí nghiệm, tất cả các động vật liên tục cho ăn chế độ

ăn whey protein được tìm thấy còn sống, trong khi 33% những động vật ăn chế độ casein

đã chết [33]

Thứ hai, đối với khả năng bổ sung glutathione, trong thử nghiệm lâm sàng mù đôi tiến hành trên 30 bệnh nhân (25 nam, 5 nữ, tuổi trung bình 42) bị nhiễm HIV (đối tượng có triệu chứng là sự thụt giảm nồng độ glutathione trong máu) được chọn ngẫu nhiên vào nhóm có chế độ ăn bổ sung hàng ngày 45 g whey protein trong hai tuần Kết quả, tiền trị liệu, nồng

độ glutathione huyết tương thấp hơn bình thường; sau hai tuần bổ sung bằng whey protein, nồng độ glutathione trong huyết tương đã tăng trong nhóm có sử dụng whey protein [30]

Ngoài ra, khi tiến hành nghiên cứu sâu hơn vào từng thành phần của whey protein, người ta nhận thấy tiềm năng có tác dụng sinh lý của chúng là rất lớn Từ thành phần có hàm lượng nhỏ như lactoferrin cũng có khả năng kích thích miễn dịch, tăng cường đáp ứng kháng thể- kháng nguyên, … hay 2 protein chính là α- LA và β- LG đều có hoạt tính opioid,

ức chế enzymm ACE… Cụ thể một số hoạt tính sinh học khác của whey protein được thể hiện ở bảng 1.2 [34]

6

Bảng 1.2 Tóm tắt các hoạt tính sinh học thường gặp của whey protein

Hoạt tính sinh học Chức năng

cholesterol máu

Chuyển đổi Angiotensin I thành Angiotensin II gây co mạch, kiểm soát huyết áp cao bằng cách co giãn các mạch máu, giảm HDL cholesterol, ức chế sự hấp thụ cholesterol, giảm cholesterol toàn phần Chống ung thư Bảo vệ cơ thể, chống lại khối u đại tràng và vú, chống lại sự oxy hóa

gây chết tế bào, hạn chế sự phân chia tế bào trong đường ruột, điều trị để hạn chế sự phát triển của khối u

Hệ thống miễn

dịch

Tăng cường đáp ứng miễn dịch, thúc đẩy các quá trình chống viêm, kích hoạt các tế bào thực bào (tế bào mast, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân), tăng cường khả năng miễn dịch của tế bào

Phát triển mô, cơ Giảm thoái hóa ở gan, hạn chế mất cơ trong quá trình lão hóa,

kích thích tiết insulin, giảm dị hóa ở bệnh nhân chấn thương Kháng khuẩn Kháng khuẩn với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,

Salmonella sp, Escheria choli 0157: H7, chống vi khuẩn gram dương Kháng vi-rút Kháng virus, chống virus herpes, virus parainfluenza bò, virus viêm

gan C

Đặc tính lý hóa

- Độ hòa tan: Các đặc tính liên quan đến độ hòa tan của whey protein bao gồm tương tác nhiệt động giữa protein và dung môi, các điều kiện môi trường của pH, ion và tương tác với các thành phần khác [38] Whey protein có độ hòa tan tốt trong khoảng pH rộng (từ pH 2-9) [32] Tuy nhiên, chúng hòa tan nhiều hơn trong điều kiện pH acid mạnh hoặc kiềm mạnh do lực đẩy của các phân tử khi mang điện tích chung vượt quá dẫn đến độ hòa tan Ngoài ra, độ hòa tan protein giảm khi tiến đến gần điểm đẳng điện pKi~4,5 dù ở mức nhiệt

độ nào (do có cấu tạo bao gồm nhiều thành phần protein khác nhau nên pKi của whey protein không phải pKi của β-LG hay α-LA) [13]

Xem xét khả năng hòa tan của bột whey protein, ta thấy dung môi thường là nước Khả năng hydrat hóa của whey protein ~ 0,45 – 0,52 (g nước/g protein) [19] Các đặc tính

độ nhớt, tạo bọt, nhũ hóa và tạo gel đều bị ảnh hưởng bởi độ hòa tan protein [14]

7

- Độ nhớt: Vì whey protein chủ yếu là α-LA và β-LG, là các protein hình cầu, bột whey protein có khả năng hòa tan lớn trong điều kiện tự nhiên Độ nhớt của dung dịch whey protein phụ thuộc nồng độ protein và sự biến tính protein trong bột protein whey Ví dụ, sự gia tăng nồng độ whey protein làm cho các tương tác giữa các phân tử điều này dẫn đến tăng độ nhớt [8]

1.1.2 Tổng quan về α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin

α- Lactalbumin

- Đặc điểm: α-LA là một loại protein liên kết cation nhỏ, có tính acid, chiếm khoảng

20% - 25% về khối lượng trong whey protein; α-LA có khối lượng phân tử 14200 Da, bao

gồm 123 acid amin tạo thành cấu trúc hình cầu nhỏ gọn được ổn định bởi bốn liên kết disulfide (Cys6, Cys120, Cys61, Cys77, Cy73, Cys91, và Cys28, Cys11) Có hai biến thể

A và B do sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài nhưng cả 2 biến thể đều chứa 4 liên kết disulfide và không có nhóm thiol tự do Trong thành phần cấu tạo, α-LA có liên kết mạnh với một Ca2+, α-LA có pKi = 4-5 và bị phân hủy tại 60℃ [12]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của α- Lactalbumin

- Hoạt tính sinh học- chức năng: α- LA là 1 loại lactose synthase; enzym xúc tác phản ứng tạo lactose, phản ứng diễn ra trong lòng Golgi và cần các ion Mn2+: UDP-gal + glucose

→ lactose + UDP Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng α- LA có nhiều hoạt tính sinh học điển hình như giảm căng thẳng, kháng khuẩn,hoạt tính opioid, chống tăng huyết áp, chống loét

và điều hòa miễn dịch [31] Đặc biệt, α- LA làm giảm nguy cơ mắc một số bệnh ung thư vì

nó hạn chế sự phân chia tế bào, gây ra sự chết rụng tế bào ung thư thông qua apoptosis_ chu trình tự chết của tế bào [5] α- LA rất giàu acid amin thiết yếu, đóng vai trò quan trọng trong

8

việc cung cấp các loại acid amin cho cơ thể nhất là đối với các đối tượng đặc biệt như trẻ sơ sinh hay người già

Beta-Lactoglobulin

- Đặc điểm: β- LG là protein chính trong whey, chiếm 60-65% khối lượng whey β-

LG là dải trình tự gồm 162 acid amin xếp theo cấu trúc bậc 3 protein, trong đó có 2 cầu disulfide và 1 nhóm -SH tự do Acid amin chủ yếu của β- LG là Leucine (13,5 %) β- LG

có khối lượng phân tử khoảng 18400Da, gồm 2 loại là β- LG A (pKi =5,1) và β- LG B (pKi=5,2) Trong khoảng pH 3,5 – 7,5, β- LG tồn tại dưới dạng dimer (β- LG A và B), ngoài khoảng pH này β- LG có thể tồn tại dưới dạng monomeric, tetrameric, octameric β- LG bị phân hủy bởi nhiệt ở nhiệt độ 60℃ [20]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của β- Lactoglobulin

- Hoạt tính sinh học- chức năng: β- LG không có mặt trong thành phần sữa mẹ nên có vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ miễn dịch thụ động cho trẻ sơ sinh và điều hòa chuyển hóa phospho ở tuyến vú đồng thời cũng được xem như một trong những dị tố có thể gây dị ứng ở trẻ [21] Hàm lượng acid amin của protein này khá quan trọng, vì bên cạnh việc thúc đẩy tăng trưởng cơ bắp, nó là một nguồn giàu cysteine thiết yếu, rất quan trọng

để tổng hợp glutathione [40] Cụ thể, protein này liên kết với các acid béo tự do khi chúng được giải phóng bởi các lipase pregastric, để tạo điều kiện cho việc tiêu hóa chất béo trong sữa [25] Do các lợi ích đem lại, β- LG hiện đang được quan tâm trong ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm sữa

9

1.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin

Hiện tại trên thế giới đã có một số nghiên cứu và các phương pháp tiêu chuẩn xác định hàm lượng α- LA và β- LG trong thực phẩm bổ sung như trong Bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số phương pháp xác định α-LA và β-LG trong sữa và các sản phẩm sữa

Ưu – nhược điểm

Định lượng protein thông

qua hàm lượng Nitơ tổng

Chi phí đắt, khả năng nhiễm chéo lớn

và không có khả năng định lượng đồng thời, phương pháp này chưa được áp dụng nhiều tại Việt Nam

[43]

10

sử dụng

detector

khối phổ

nối detector khối phổ

Chương trình rửa giải

gradien với pha động gồm

acid trifluoroacetic acid

(TFA) 0,1% trong nước

(kênh A) và TFA 0,1% trong

giảm thời gian phân tích và giảm giới hạn phát hiện

hòa tan trong nhiều sản

phẩm whey thương mại và

trong phòng thí nghiệm

Độ chụm tốt với độ lệch chuẩn tương đối trong và giữa các ngày ≤ 5% với tất

cả các protein ngoại trừ immunoglobulin G và albumin (RSD đạt 7 – 10%) Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện trên nền mẫu whey protein cô đặc và whey protein phân lập lần lượt là 0,3% và 1,0% cho tất cả các protein, trừ IgG có LOD và LOQ lần lượt là 0,6% và 2,0%

[18]

Phương pháp điện di mao quản và phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector khối phổ có độ nhạy và độ chọn lọc cao, tuy nhiên yêu cầu quá trình xử lý mẫu phức tạp, trang thiết bị đắt tiền Trong khi đó, phương pháp HPLC là phương pháp ổn định, hiệu quả, sử dụng hóa chất và thiết bị thông thường, dễ triển khai, phù hợp với điều kiện của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam Tính đến thời điểm hiện tại, đã có rất nhiều các phương pháp phân tích đồng thời α- LA và β- LG theo hướng sử dụng thiết bị HPLC với các loại cột khác nhau như trong Bảng 1.4

11

Bảng 1.4 Một số phương pháp phân tích α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin

sử dụng thiết bị HPLC

Phương pháp phân tích Kết quả đạt được

- Kết quả cho thấy độ thu hồi của α-LA và β-LG

là 86,12% -104,38%, cột C18 có khả năng chịu acid và

ổn định hơn, tăng độ phân giải giữa các peak so với cột

C4

- Phương pháp này có thể tách hai protein rõ ràng, điều kiện tiến hành đơn giản, nhưng mới chỉ áp dụng trong nền mẫu sữa bò tươi

bò nguyên liệu trong khi phương pháp HPLC chỉ có thể được sử dụng để định lượng β-LG A và β-LG B do sự đồng rửa giải của lactoferrin với α-LA Độ thu hồi của

cả hai phương pháp đạt khoảng 90,7% đến 116,8%

[39]

- Hàm lượng α- LA và β- LG trung bình tương ứng khoảng 15-21% và 48-73%, kết quả này tương đồng với nhiều báo cáo trước đây về hàm lượng α- LA và β- LG có trong các mẫu whey protein

Tác giả Carina Pinho cùng các cộng sự vào năm 2012 đã tiến hành nghiên cứu so sánh 2 phương pháp là sắc ký lỏng hiệu năng cao với cột sắc ký loại cỡ (SEC) và sắc ký pha đảo (RP) để theo dõi quá trình xử lý nhiệt của các mẫu sữa bò và sữa lừa Với cách tiếp cận thứ nhất sử dụng cột sắc ký loại cỡ, cột SEC được sử dụng là cột Gilson chromatograph (Gilson Medical Electronics, France); pha động bao gồm: NaCl 0,075M; KH2PO4 0,025M được điều chỉnh về pH 7,0 bằng KOH 1M; tốc độ dòng 0,5mL/ph; bước sóng phát hiện 280nm Với cách tiếp cận thứ 2 là sử dụng RP-HPLC, cột RP được sử dụng là cột polystyrene-divinylbenzene Chrompack P 300 RP column (Sao Paulo, Brazil) (8 μm, 300

Å, 150×4·6 I.D); pha động gồm 2 kênh A: 0,1% acid trifluoroacetic trong nước và kênh B:

0,1% acid trifluoroacetic trong acetonitril; gradien: 0–5 ph: 33–35% B, 5–9 ph: 35–37% B,

9–18ph: 37–39% B, 18–33ph: 39% B, 33–45ph: 39–55% B, 45–50ph: 55– 33% B, 50–55ph: 33% B; kết hợp cùng detector PDA (JMBS Developments, Le Fontanil, France) bước sóng phát hiện là 214nm Cả 2 cách tiếp cận đều được thẩm định dựa trên các tiêu chí như

độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chụm, độ đúng và LOD và có các kết quả tương đương giữa 2 cách tiếp cận trong việc định lượng đồng thời α- LA; β- LG, lysozyme và casein trong các mẫu sữa bò và sữa lừa [15]

Theo TCVN 9660:2013 (ISO 13875:2005) về Sữa dạng lỏng - Xác định hàm lượng β-LG tan trong acid, mẫu sữa lỏng (sữa tươi, thanh trùng và sữa đặc) được chỉnh pH đến mức dưới 4,6 để kết tủa casein Dịch chiết mẫu còn lại sẽ được pha loãng thích hợp và phân tích trên hệ thống HPLC Phương pháp này có ưu điểm là dễ thực hiện, có thể áp dụng được tại nhiều phòng thí nghiệm, nhưng mới chỉ áp dụng cho nền sữa lỏng, chưa có thử nghiệm với các nền sữa bột và một số sản phẩm sữa khác như phomat Mặt khác, phương

LA và β-LG: kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản, dễ làm; tuy nhiên sau khi đã tiến hành khảo sát

và lựa chọn được điều kiện phân tích tối ưu, khả năng tách α-LA và β-LG vẫn còn bị hạn chế Đầu tiên là do ảnh hưởng lớn từ nền mẫu Thứ hai là có thể do sự thay đổi dạng tồn tại monome, dime của β-LG và sự biến tính α-LA (khả năng liên kết với ion Ca2+ của α-LA) dưới ảnh hưởng của pH khi thay đổi gradien Cuối cùng là do giới hạn định lượng cao nên khó xác định với các mẫu có hàm lượng nhỏ (α-LA: 0,21g/100g, β-LG: 0,95g/100g) Về cột SEC, một loại cột với nguyên lý tách hoàn toàn khác so với cột C18, phạm vi ứng dụng phân tích của cột SEC thường là các đường, polyme, lipid, polypeptid, protein Hiện nay, cột SEC nói riêng sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử) nói chung đang được áp dụng chính trong việc phân tích các phân tử phức tạp, chất hóa sinh hay các chất cao phân tử Từ các tài liệu tham khảo cùng thực tế nghiên cứu, để hoàn thiện hơn phương pháp xác định đồng thời α-LA và β-LG trong các thực phẩm bổ sung, nhóm nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật HPLC với cột SEC kết hợp detector PDA để xác định các whey protein trong đề tài này

1.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC

1.2.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng là một phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hoá của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [2], [3]

Dựa vào bản chất quá trình sắc ký người ta chia thành:

- Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC)

- Sắc ký hấp phụ, có 2 loại: Pha thuận, pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC)

- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC)

- Sắc ký trên gel (GP-HPLC và FG-HPLC)

14

1.2.2 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký

Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký là thời gian lưu, hệ số phân bố, hệ số chọn

lọc, số đĩa lý thuyết, chiều cao đĩa lỹ thuyết… và độ phân giải RS dùng để đánh giá khả

năng tách của một chất trong một hệ

1.2.3 Sắc ký trên gel

Sắc ký trên gel (sắc ký loại cỡ) - Size Exclusion Chromatography là một loại sắc ký

lỏng có nguyên tắc dựa dựa trên cơ sở là khối lượng hoặc kích thước phân tử (một đặc tính

vật lý của chất phân tích) thay vì các lực tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh như hấp

phụ, phân bố hay trao đổi ion Pha tĩnh trong cột thường tạo thành các hố hình nón có kích

thước phù hợp để “bẫy” các chất phân tích do đó chất phân tích có kích thước càng nhỏ sẽ

bị lưu giữ càng lâu, chất phân tích có kích thước lớn sẽ ra sớm hơn (Hình 1.4)

Pha tĩnh của cột SEC thường là các loại polyme (dextran, polyacrylamide…),

polysaccharide (agar, agarose…) Ngoài ra, từ năm 1970 hạt silica đã trở thành pha tĩnh phổ

biến nhờ độ bền cơ học vượt trội, tính chất không trương nở và tính trơ trong một phạm vi

điều kiện khá rộng

Hình 1.4 Mô hình mô phỏng pha tĩnh cột SEC và chất phân tích bị lưu giữ

Phân loại: dựa vào pha động ta có 2 loại sắc ký rây phân tử là Gel Filtration

Chromatography (GFC) với pha động là nước và Gel Permeation Chromatograpny (GPC)

với pha động là các dung môi hữu cơ

Phạm vi ứng dụng: một trong những lĩnh vực phương pháp sắc ký rây phân tử được

ứng dụng nhiều nhất là phân tích protein nhất là trong các nghiên cứu theo dõi sự biến đổi

cấu trúc, theo dõi hàm lượng protein, xác định cấu trúc bậc 4 của protein[37]

15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hai protein chiếm phần lớn trong whey protein gồm α-LA và β-LG

Đối tượng mẫu được lựa chọn để xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là sữa, sản phẩm có nguồn gốc từ sữa và thực phẩm bổ sung chứa whey protein

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát điều kiện tách sắc ký gồm:

LG (401,4ppm) được tiêm vào hệ thống với các pha động khác nhau:

16

- Khảo sát tốc độ rửa giải: Khảo sát tốc độ rửa giải được tiến hành trên mẫu chuẩn gồm α- LA (384,2ppm) và β- LG (401,4ppm) được tiêm vào hệ thống với tốc độ dòng thay đổi tại 2 mức là 0,5mL/ph và 1,0mL/ph

2.2.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

Do đối tượng nghiên cứu của đề tài là nền mẫu sữa và các thực phẩm bổ sung có nguồn gốc từ sữa, thực phẩm bổ sung chứa whey là nền mẫu phức tạp, α-LA và β-LG có mặt trong nền sữa với lượng nhỏ trong khi mẫu chứa lượng lớn casein cũng như một số protein khác, nên quy trình xử lý mẫu cần làm sạch casein cũng như loại bỏ một số protein đồng rửa giải trong quá trình sắc ký

Trên cơ sở quy trình xử lý mẫu dự kiến, một số khảo sát đã được thực hiện nhằm tối ưu quá trình phân tích, tăng hiệu quả chiết α-LA và β-LG và loại bỏ casein từ nền mẫu:

- Đánh giá ảnh hưởng pH đến α- LA và β- LG

- Khảo sát và lựa chọn khoảng pH chiết mẫu

- Khảo sát lựa chọn dung môi chiết

- Khảo sát và lựa chọn số lần chiết mẫu

- Khảo sát và lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu

Đánh giá ảnh hưởng pH đến α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin

Để đánh giá ảnh hưởng pH đến α- LA và β- LG, các dung dịch chuẩn mix α- LA 384,2ppm và β- LG 401,4ppm ở các pH khác nhau từ 3,0- 7,0 Tại mỗi điểm pH, 3 dung dịch chuẩn được chuẩn bị và tiêm vào hệ thống phân tích Kết quả tính dựa trên sự thay đổi diện tích trung bình của 2 chất chuẩn α- LA và β- LG

Khảo sát và lựa chọn khoảng pH chiết mẫu

Để khảo sát và lựa chọn khoảng pH chiết mẫu, các mẫu sữa bột được cân chính xác khoảng 1-2g vào ống ly tâm 50ml, hòa tan bằng khoảng 10ml nước cất 2 lần Trước khi tiến hành chiết như trong quy trình dự kiến, mẫu được điều chỉnh về pH từ 3,0 -7,0 bằng dung dịch HCl 0,01M và máy đo pH Dịch chiết sau khi định mức được đem đi phân tích kết quả hàm lượng trung bình của α- LA và β- LG tại mỗi điểm pH từ đó đưa ra nhận xét

17

Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết mẫu

Để khảo sát và lựa chọn dung môi chiết mẫu, 4 dung môi chiết mẫu được chọn và tiến hành như quy trình dự kiến Dịch chiết sau khi định mức được lọc vào ống nghiệm thủy tinh so sánh cảm quan và phân tích kết quả hàm lượng trung bình của α- LA và β- LG tại mỗi điểm pH từ đó đưa ra nhận xét

Khảo sát và lựa chọn số lần chiết mẫu

Để khảo sát và lựa chọn số lần chiết mẫu, cân chính xác 1-2 g mẫu bột whey vào ống

ly tâm 50ml Và tiến hành như sau:

- Lần 1: Sử dụng 30-35mL dung môi lắc đều bằng tay và lắc xoáy trong 1 phút; Ly

tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút; Thu dịch ly tâm vào bình định mức 50mL, vừa đủ bằng nước cất sau đó phân tích hàm lượng α- LA và β- LG

- Lần 2: Cắn sau chiết lần 1 được bổ dung khoảng 15-20mL dung môi lắc đều bằng

tay và lắc xoáy trong 1 phút; Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút; Thu dịch ly tâm vào bình định mức 25mL, vừa đủ bằng nước cất sau đó phân tích hàm lượng α- LA và β- LG

- Lần 3: Cắn sau chiết lần 2 được bổ dung khoảng 15-20mL dung môi lắc đều bằng

tay và lắc xoáy trong 1 phút; Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút; Thu dịch ly tâm vào bình định mức 25mL, vừa đủ bằng nước cất sau đó phân tích hàm lượng α- LA và β- LG

- Lần 4: Cắn sau chiết lần 3 được bổ dung khoảng 10-15mL dung môi lắc đều bằng

tay và lắc xoáy trong 1 phút; Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút; Thu dịch ly tâm vào bình định mức 20mL, vừa đủ bằng nước cất sau đó phân tích hàm lượng α- LA và β- LG

- Lần 5: Cắn sau chiết lần 4 được bổ dung khoảng 10-15mL dung môi lắc đều bằng

tay và lắc xoáy trong 1 phút; Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút; Thu dịch ly tâm vào bình định mức 20mL, vừa đủ bằng nước cất sau đó phân tích hàm lượng α- LA và β- LG Dựa trên sự thay đổi hàm lượng α- LA và β- LG qua các lần chiết đưa ra nhận xét

Khảo sát và lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu

Để khảo sát và lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu, cân chính xác 1-2g mẫu bột whey và tiến hành theo quy trình dự kiến nhưng trước khi ly tâm, ống ly tâm được ngâm trong bể điều nhiệt ở các nhiệt độ 40℃ và 60℃ trong 15ph Dịch chiết sau khi định mức sẽ phân tích hàm lượng trung bình của α- LA và β- LG tại mỗi nhiệt độ, dựa trên sự thay đổi hàm lượng hai chất từ đó đưa ra nhận xét

18

2.2.3 Thẩm định phương pháp

Đánh giá các thông số cơ bản của phương pháp gồm có:

- Độ đặc hiệu

- Khoảng tuyến tính, khoảng xác định

- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

- Độ chụm: độ chụm và độ chụm trung gian

- Độ đúng

2.2.4 Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng α-LA và β-LG trong mẫu thực

- Mẫu sữa, thực phẩm có nguồn gốc từ sữa, thực phẩm bổ sung được lấy ngẫu nhiên

tại một số cửa hàng trên địa bàn Hà Nội

- Mẫu được lấy ngẫu nhiên, chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản ở điều kiện yêu

cầu của nhà sản xuất đến khi phân tích

2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng là các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm:

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Alliance- Waters e2695 gồm bơm cao

áp, bộ điều nhiệt cột, bộ tiêm mẫu tự động kết nối với detector 2998 PDA - Waters

- Cột Xbridge BEH 200Å SEC (3.5µ*7.8*300mm) tiền cột (7.8*50mm) tương ứng

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,0001 g) XS105, Metter Toledo

- Máy đo pH, Metler Toledo

- Máy lắc vortex, IKA

- Máy rung siêu âm S100H, Elma

- Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich

- Micropipet điều chỉnh được thể tích 10-100 µL, 100-1000 µL và 500-5000 µL

- Ống ly tâm teflon loại 15 mL và 50 mL, có nắp kín

- Bình định mức các loại, chính xác cấp A

- Lọ đựng mẫu 1,8 mL có nắp dùng tiêm mẫu cho HPLC

- Các dụng cụ và thiết bị phụ trợ khác trong phòng thí nghiệm

19

2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn

Các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích, bao gồm:

- Chuẩn α- LA from bovine milk Type III (độ tinh khiết 87%) và β-LG from bovine

milk (độ tinh khiết 100%) của hãng Sigma Aldrich ( phụ lục 10)

- Acetonitrile dùng cho HPLC, Merck

- Acid trifluoroacetic (TFA), acid clorohydric 37% (HCl), natri acetate, acid acetic

đặc băng, kali dihydrophosphate, acid Formic (Merck)

- Nước cất hai lần

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn LA gốc: cân chính xác một lượng khoảng 0.4g chất chuẩn

α-LA vào bình định mức 50mL, hòa tan hoàn toàn và thêm vừa đủ bẳng nước cất 2 lần

- Dung dịch chuẩn β- LG gốc: cân chính xác một lượng khoảng 0.4g chất chuẩn β-

LG vào bình định mức 50mL, hòa tan hoàn toàn và thêm vừa đủ bẳng nước cất 2 lần

- Chuẩn làm việc: các dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng phù hợp từ dung dịch chuẩn gốc bẳng cách dụng cụ chính xác (micropipet, bình định mức, pipet chính xác ) bằng nước cất 2 lần

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu dự kiến

Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Toàn bộ mẫu được trộn đều (đối với mẫu bột), lắc trộn đều (đối với

mẫu lỏng)

Xử lý mẫu: Mẫu được chiết với dung môi thích hợp để kết tủa protein và casein Dịch chiết

phân tích bằng sắc ký lỏng sử dụng detector DAD

Các bước xử lý mẫu:

- Bước 1: Cân một lượng mẫu phù hợp vào ống ly tâm 50 mL

- Bước 2: Thêm 20 mL dung môi chiết (được khảo sát để tối ưu), lắc đều bằng tay và

lắc xoáy trong 1 phút

- Bước 3: Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút

- Bước 4: Thu dịch ly tâm vào bình định mức 50mL

20

- Bước 5: Tiếp tục lặp lại bước 2,3 và 4 gộp toàn bộ dịch ly tâm vào bình định mức

50mL và tiến hành thêm vừa đủ bằng nước cất

- Bước 6: Lọc dịch vào ống ly tâm 15 mL

- Bước 7: Chuyển dịch lọc vào lọ đựng mẫu và phân tích trên HPLC

2.4.3 Phương pháp phân tích bằng sắc ký dự kiến

Trong nghiên cứu này, kỹ thuật HPLC được sử dụng để phân tích α-LA và β-LG với các điều kiện sau:

- Cột Xbridge BEH 200Å SEC (3.5µ*7.8*300mm) tiền cột (7.8*50mm) tương ứng

- Nhiệt độ buồng mẫu: 10 ± 2oC

- Mẫu trắng không có tín hiệu của chất phân tích

- Mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu và phổ của chất phân tích tại thời gian lưu tương

ứng với thời gian lưu và phổ trên mẫu chuẩn [4], [16], [17]

Khoảng tuyến tính, khoảng xác định

Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện phân tích các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu chất phân tích vào nồng độ Xác định sự phụ thuộc giữa diện tích peak thu được vào nồng độ cho đến khi không còn tuyến tính

Tiến hành xây dựng đường chuẩn bằng cách phân tích các dung dịch chuẩn có nồng

độ khác nhau và biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak theo nồng độ tương ứng Đường chuẩn được đánh giá theo hai tiêu chí:

- Hệ số tương quan tuyến tính: R2 ≥ 0,99

21

- Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn, ∆i ≤ 15% (∆i ≤ 20% tại LOQ)

Độ chệch được tính theo công thức sau:

Trong đó: Ci(tt) là nồng độ tính được theo đường chuẩn của điểm chuẩn thứ “i” (µg/mL)

Ci(lt) là nồng độ lý thuyết (dung dịch chuẩn) của điểm chuẩn thứ “i” (µg/mL) [4], [16], [17]

Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Trong đề tài này, giá trị LOD và LOQ được xác định bằng cách phân tích lặp lại 10 lần mẫu thực có hàm lượng thấp (khoảng 5 – 10 lần giá trị LOD ước lượng) trên nền mẫu sửa lỏng, sữa bột và thực phẩm bổ sung whey protein LOD và LOQ được tính toán dựa trên giá trị 𝑥̅ và độ lệch chuẩn SD theo công thức sau:

- Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn

vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

- Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử đã dùng

và làm lại thí nghiệm và tính lại R [4], [16], [17]

Độ chụm: Độ chụm và độ chụm trung gian

Để xác định độ chụm tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần trên cùng một mẫu thử trên nền mẫu sửa lỏng, sữa bột và thực phẩm bổ sung whey protein Độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo các công thức sau:

SD: Độ lệch chuẩn

n: Số lần thí nghiệm

xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

𝑥̅ : Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm

RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối

CV%: Hệ số biến thiên [4], [16], [17]

Độ đúng

Độ đúng của phương pháp được xác định bằng cách thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào mẫu thử, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu bốn lần bằng phương pháp khảo sát, độ đúng được tiến hành trên nền mẫu sữa lỏng, sữa bột và bột whey protein Hiệu suất thu hồi (R%) được tính toán theo công thức sau:

𝑅(%) = 𝐶𝑚+𝑐− 𝐶𝑚

𝐶𝑐 𝑥 100

Trong đó: R%: hiệu xuất thu hồi, %

Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) [4], [16], [17]

23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Lựa chọn pha tĩnh

Kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo sử dụng cột C18 rất phổ biến ở Việt Nam hiện nay Cột

C18 có khả năng ứng dụng rộng, phù hợp với các dung môi phân cực như methanol, acetonitril, nước Cột SEC là 1 hướng tiếp cận mới trong việc phân tích các đại phân tử như protein, tính tới thời điểm hiện tại cột SEC đã có mặt tại một số cơ quan kiểm nghiệm và

có khả năng ứng dụng cao trong tương lại

Qua tham khảo các tài liệu và theo điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, cột pha đảo Sunfire C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) (Waters, Mỹ) và cột Xbridge BEH 200Å SEC (3.5µ*7.8*300mm) được lựa chọn để làm tiền đề lựa chọn sắc ký (pha tĩnh) để tách các whey protein Các kết quả thu được như sau:

- Thời gian phân tích ngắn hơn

Kết hợp với hình ảnh sắc kỳ đồ (Hình 3.1): Cột Xbridge BEH 200Å SEC

(3.5µ*7.8*300mm) là loại cột chịu được khoảng pH rộng (từ 2 đến 8), phù hợp với việc nghiên cứu các chất bị ảnh hưởng nhiều bởi điều kiện pH như α- Lactalbumin và β-

Lactoglobulin trong whey protein

Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00

Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00

Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

25

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn pha động

Kết quả khảo sát và lựa chọn pha động được thể hiện ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2

Minutes

Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc α- Lactalbumin 7684ppm: cân chính xác 0,4416g chất chuẩn α- Lactalbumin 87% vào bình định mức 50ml, hòa tan và thêm vừa đủ bằng nước cất 2 lần

- Dung dịch chuẩn gốc β- Lactoglobulin 8028ppm: cân chính xác 0,4014g chất chuẩn β- Lactoglobulin 100% vào bình định mức 50ml, hòa tan và thêm vừa đủ bằng nước cất 2 lần

Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

Minutes

28

3.1.4 Khảo sát và xây dựng quy trình xử lý mẫu

Dựa trên mô hình các bước xử lý mẫu dự kiến ta có sơ đồ như Hình 3.4 để tiến hành khảo sát các điều kiện để chiết mẫu như sau:

Hình 3.4 Khảo sát quy trình chiết α-LA và β-LG

Đánh giá ảnh hưởng pH đến α- LA và β- LG trong dung dịch chuẩn

Kết quả sau khi phân tích α- LA và β- LG tại có pH khác nhau từ 3,0 đến 7,0 được thể hiện ở trong Phụ lục 1

Hình 3.5 Biểu đồ đánh giá sự ảnh hưởng của pH đến α- LA và β- LG

0 500000

Sự thay đổi của std ở các pH

+ 20 mL dung môi chiết

2 – 5 g/ống ly tâm

Lắc 1 phút; Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút Lắc xoáy 1 phút, để yên trong 15 phút

Thu dịch ly tâm vào bình định mức 50mL, lấy cắn tiếp tục

chiết lần 2

+ 20 mL dung môi chiết

Gộp dịch ly tâm vào bình định mức 50mL, thêm vừa đủ bằng

nước cất Lọc dịch, phân tích bằng HPLC

29

Nhận xét: trong khoảng pH từ 3,0- 7,0; 2 chất phân tích α- LA và β- LG không bị ảnh hưởng, phân hủy hay biến tính

Đánh giá ảnh hưởng pH của dịch chiết mẫu

Kết quả sau khi phân tích α- LA và β- LG tại có pH khác nhau từ 3,0 đến 7,0 trên mẫu thực được thể hiện ở Hình 3.6 và Phụ lục 2

Hình 3.6. Mẫu chiết tại các pH khác nhau

Nhận xét: Từ bảng thống kê diện tích peak của dịch chiết mẫu tại các pH khác nhau (phụ lục 2) và hình 3.6, khoảng pH từ 4,0- 5,0 có thể dùng để chiết α- LA và β- LG trên mẫu thực

Lựa chọn dung môi chiết

Do khoảng pH chiết α- LA và β- LG kéo dài từ 4,0 -5,0 nên có rất nhiều các dung dịch

có thể dùng chiết mẫu Sau khi tham khảo các tài liệu tham khảo, để đánh giá hiệu quả chiết

α-LA và β-LG cũng như khả năng kết tủa casein và làm sạch tạp chất khác, một số dung môi khác nhau đã được sử dụng để khảo sát, gồm:

- Dung dịch đệm acetat pH 4,6

- Dung dịch acid acetic 0,05M

- Dung dịch đệm phosphate pH 4,5

- Dung dịch nước acid chlorhydric 0,01M

Kết quả xác định hàm lượng α- LA và β- LG sau khi chiết bằng 4 dung dịch trên được thể hiện

ở Bảng 3.3 và Hình 3.7

0 1000000

30

Bảng 3.3 Khảo sát dung môi chiết

Dung môi m (g) V(ml) D* Diện tích

peak TB

C (ppm)

Hàm lượng %

(* Dilute: pha loãng)

Hình 3.7 Hình ảnh cảm quan dịch chiết của 4 dung môi chiết mẫu Nhận xét: Trong nghiên cứu này, 4 dung môi lựa chọn để khảo sát đều cho tín hiệu như nhau khi phân tích (Bảng 3.3), trong đó, dung dịch acid acetic cho dịch chiết sau khi lắc xoáy

và ly tâm trong nhất (Hình 3.7), do vậy dung dịch acid acetic 0,05M được lựa chọn để sử dụng Acid acetic là một acid yếu có pKa 4,75, có thể chiết α-LA và β-LG mà không cần điều chỉnh

pH Kết quả là các tạp chưa xác định bị kết tủa, trong khi đó α-LA và β-LG không bị kết tủa và

có thể phân tích trực tiếp bằng phần dịch trong

31

Khảo sát và lựa chọn số lần chiết

Bảng kết quả xác định α- LA và β- LG tiến hành trên 3 mẫu thực với các số lần chiết khác nhau được thể hiện ở phụ lục 3 và Hình 3.8

Hình 3.8 Khảo sát số lần chiết Nhận xét: Từ bảng kết quả trên, lần chiết số 4 và số 5 có hàm lượng chiết <0,05% trên tổng số 5 lần chiết Từ đó trong nghiên cứu này lựa chọn 3 lần chiết để tối ưu hóa quá trình chiết mẫu

Khảo sát và lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu

Do có bản chất là protein nên cả α- LA và β- LG đều có khả năng bị phá hủy cấu trúc bởi nhiệt, trong các tài liệu tham khảo, nhiệt độ làm biến tính α- LA và β- LG là 60℃ nên nghiên cứu nay tiến hành khảo sát nhiệt độ chiết tại 3 mốc: nhiệt độ phòng 30℃, gia nhiệt trên bình cách thủy ở 40℃ và 60℃ Kết quả xác định α- LA và β- LG thu được như Hình 3.9 và bảng số liệu trong Phụ lục 4

Hình 3.9 Sự thay đổi của α- Lactalbumin và β- Lactoglobulin theo nhiệt độ chiết

Khảo sát nhiệt độ chiết

+ 15 mL dd acid acetic 0,05M

2 – 5 g (ml)/ống ly tâm

Lắc 1 phút; Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút Lắc xoáy 1 phút, để yên trong 15 phút tại nhiệt độ phòng

Thu dịch ly tâm vào bình định mức 50mL, lấy cắn tiếp tục chiết 2 lần

+ 15 mL dd acid acetic 0,05M

Gộp dịch ly tâm vào bình định mức 50mL, thêm vừa đủ bằng nước cất

Lọc dịch, phân tích bằng HPLC