Xác định hàm lượng một số whey protein trong thực phẩm bổ sung bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ THANH AN XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ WHEY PROTEIN TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ THANH AN Mã sinh viên: 1401007 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ WHEY PROTEIN TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà Ths Nguyễn Thị Hồng Ngọc Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc – người thầy trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ nhiệt tình anh chị Khoa Nghiên cứu Thực phẩm- Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, thầy giáo Bộ mơn Hóa Phân tích- Độc chất… trình em thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất giúp đỡ, bảo em suốt trình học tập thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến: Bộ mơn Hóa phân tích- Độc chất Khoa Nghiên cứu Thực phẩm- Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ Sinh Thực phẩm Quốc gia Đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Và cuối em xin bày tỏ lòng yêu thương, biết ơn tới gia đình bạn bè người ln động viên, giúp đỡ em q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Vũ Thị Thanh An MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Whey protein 1.1.1 Giới thiệu Whey protein 1.1.2 Tổng quan α- Lactalbumin β- Lactoglobulin 1.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng α- Lactalbumin β- Lactoglobulin 1.2 Sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC 13 1.2.1 Khái niệm 13 1.2.2 Một số thông số trình sắc ký 14 1.2.3 Sắc ký gel 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 15 2.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 16 2.2.3 Thẩm định phương pháp 18 2.2.4 Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng α-LA β-LG mẫu thực 18 2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 18 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 18 2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phương pháp chuẩn bị dung dịch chuẩn 19 2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu dự kiến 19 2.4.3 Phương pháp phân tích sắc ký dự kiến 20 2.4.4 Phương pháp thẩm định 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 23 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 23 3.1.2 Khảo sát lựa chọn pha động 25 3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 27 3.1.4 Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu 28 3.1.5 Thẩm định phương pháp 32 3.2 Phân tích mẫu thực tế 38 3.3 Bàn luận 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1 Kết luận 40 4.2 Kiến nghị 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AF Formic acid Acid formic Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân Commodities tích thức CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản D Dilute Pha loãng Enzyme-Linked Immune-Sorbent Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch AOAC ELISA Assay HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography LOD Limit Of Detection Giới hạn phát LOQ Limit Of Quantification Giới hạn định lượng Mobile phase Pha động DAD Diod Array Detector Detector mảng diod SEC Size Exclusion Chromatography Sắc ký loại cỡ SP Station phase Pha tĩnh TF Total Flow Tốc độ dòng TFA Trifluoroacetic acid Acid trifluoroacetic α-LA α- Lactalbumin α- Lactalbumin β-LG β- Lactoglobulin β- Lactoglobulin MP DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng acid amin whey protein Bảng 1.2 Tóm tắt hoạt tính sinh học thường gặp whey protein Bảng 1.3 Một số phương pháp xác định α-LA β-LG sữa sản phẩm sữa Bảng 1.4 Một số phương pháp phân tích α- Lactalbumin β- Lactoglobulin sử dụng thiết bị HPLC 11 Bảng 3.1 Khảo sát thành phần pha động 25 Bảng 3.2 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng 26 Bảng 3.3 Khảo sát dung môi chiết 30 Bảng 3.4 Đường chuẩn α- Lactalbumin .34 Bảng 3.5 Đường chuẩn β- Lactoglobulin .34 Bảng 3.6 Kết độ chụm mẫu 36 Bảng 3.7 Kết độ chụm trung gian mẫu 36 Bảng 3.8 Kết phân tích độ 37 Bảng 3.9 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 38 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sự khác biệt thành phần α- LA β-LG loại sữa Hình 1.2 Cấu trúc hóa học α- Lactalbumin Hình 1.3 Cấu trúc hóa học β- Lactoglobulin Hình 1.4 Mơ hình mơ pha tĩnh cột SEC chất phân tích bị lưu giữ .14 Hình 3.1 Lựa chọn pha tĩnh 24 Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động .26 Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát pha động 27 Hình 3.4 Khảo sát quy trình chiết α-LA β-LG 28 Hình 3.5 Biểu đồ đánh giá ảnh hưởng pH đến α- LA β- LG .28 Hình 3.6 Mẫu chiết pH khác 29 Hình 3.7 Hình ảnh cảm quan dịch chiết dung môi chiết mẫu .30 Hình 3.8 Khảo sát số lần chiết 31 Hình 3.9 Sự thay đổi α- Lactalbumin β- Lactoglobulin theo nhiệt độ chiết .31 Hình 3.10 Quy trình chiết α-LA β-LG từ mẫu 32 Hình 3.11 Sắc đồ phổ mẫu trắng, mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn mix, mẫu thực mẫu thực thêm chuẩn α-LA β-LG sữa bột 33 Hình 3.12 Đường chuẩn α- Lactalbumin 34 Hình 3.13 Đường chuẩn β- Lactoglobulin 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Chiếm gần 20% khối lượng protein sữa, whey protein biết đến nguồn dinh dưỡng dồi dào, bổ sung acid amin thiết yếu cho thể lợi ích sức khỏe khác khả chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân HIV, viêm gan B, bệnh tim mạch, loãng xương Nhờ lợi ích với thể, whey protein bổ sung vào nhiều loại sản phẩm khác nhau, phù hợp với nhóm người tiêu dùng khác nhau, từ trẻ sơ sinh đến người có nhu cầu đặc biệt [10] Đó sản phẩm thực phẩm bổ sung, thức uống dinh dưỡng cho người vận động mạnh (vận động viên, người tập thể thao, thể hình…) dùng cho số tình trạng bệnh lý (kém hấp thụ chuyển hóa protein) Thị trường thực phẩm bổ sung whey protein toàn cầu dự kiến tăng trưởng với tốc độ nhanh tính chất chức đa dạng ứng dụng rộng lớn Hiện giới, nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất whey protein loại sữa bò, sữa dê sữa cừu Tuy nhiên tỷ lệ thành phần whey protein loại sữa lại khác [24], đặc biệt khác với sữa mẹ sữa mẹ lại khơng có thành phần β- Lactoglobulin [21] (loại protein chiếm tỷ lệ lớn whey protein) gây dị ứng trẻ sơ sinh Ngoài β- Lactoglobulin, thành phần sinh học whey bao gồm αLactalbumin, lactoferrin, glycomacropeptide, immunoglobulin Trong thành phần trên, α- Lactalbumin β- Lactoglobulin, vừa protein chiếm tỷ lệ lớn vừa có hoạt tính sinh học quan trọng, thường hay tách riêng bổ sung ghi nhãn nhiều sản phẩm Đang có đà phát triển mạnh với vơ số loại sản phẩm lưu hành kèm theo khác biệt thành phần nguồn nguyên liệu, thị trường thực phẩm bổ sung whey protein cần kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng Theo FDA, loại mặt hàng thực phẩm bổ sung tập trung kiểm sốt Hoa Kỳ Tuy nhiên, tính đến thời điểm giới có Trung Quốc có cơng bố tiêu chuẩn chất lượng whey protein [44] Xét riêng phạm vi Việt Nam chưa có nghiên cứu xác định đồng thời α- Lactalbumin β- Lactoglobulin thực phẩm bổ sung có chứa whey protein Do đề tài: “Xác định hàm lượng số whey protein thực phẩm bổ sung sắc ký lỏng hiệu cao” thực với mục đích sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời α-Lactalbumin βLactoglobulin thực phẩm bổ sung mẫu: sữa bột, sữa lỏng bột whey Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng α- Lactalbumin β- Lactoglobulin số thực phẩm bổ sung thị trường 3.2 Thẩm định phương pháp - Độ đặc hiệu: phân tích đồng thời dung dịch chuẩn α-LA β-LG, dung môi chiết mẫu mẫu thực, mẫu thực thêm chuẩn hệ thống HPLC, sau so sánh thời gian lưu chuẩn, mẫu thực mẫu thực thêm chuẩn dung mơi chiết mẫu Kết phân tích cho thấy, sắc ký đồ dung môi chiết mẫu không xuất píc có thời gian lưu với píc αLA β-LG sắc ký đồ dung dịch chuẩn (Hình 1) Đồng thời sắc ký đồ mẫu thực, mẫu thực thêm chuẩn xuất píc α-LA β-LG có thời gian lưu gần với thời gian lưu chuẩn với (độ chệch 0,34%) với phổ hấp thụ tương đồng hình dạng phổ, bước sóng cực đại, số lượng bước sóng cực đại Như quy trình xây dựng cho phép phân tích hàm lượng α-LA β-LG mẫu lựa chọn 0.02 AU 0.00 -0.02 A -0.04 -0.06 10.00 20.00 30.00 Minutes 40.00 0.06 0.08 0.04 AU 0.06 0.04 0.02 0.02 B AU 280.2 0.00 23.111 Peak 0.00 201.0 0.060 0.050 -0.02 0.040 AU 0.030 0.020 -0.04 0.010 279.0 23.111 - 2898451 201.0 18.421 - 4511957 18.421 Peak 0.10 0.000 -0.010 -0.06 -0.020 200.00 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 nm 320.00 340.00 360.00 380.00 400.00 0.00 10.00 20.00 30.00 Minutes 40.00 17.360 Peak 201.0 0.015 22.908 - 2046015 0.04 0.02 0.005 280.2 318.3 C 346.5 370.4 AU 0.000 17.920 - 667466 AU 0.010 -0.005 22.534 Peak 0.00 -0.02 201.0 0.06 -0.04 AU 0.04 0.02 -0.06 276.6 0.00 5.00 10.00 -0.02 200.00 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 nm 320.00 340.00 360.00 380.00 400.00 15.00 20.00 Minutes 25.00 30.00 17.437 Peak 201.0 0.025 0.050 18.519 - 972058 0.040 AU 0.030 0.020 0.020 0.010 281.4 398.1 AU 0.000 -0.010 D -0.020 0.015 22.481 Peak 201.0 0.010 0.20 AU 0.15 22.787 - 1018063 0.060 0.005 0.10 0.000 0.05 5.00 277.8 0.00 200.00 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 nm 320.00 340.00 360.00 380.00 400.00 10.00 15.00 20.00 Minutes 25.00 Hình Sắc đồ độ đặc hiệu chọn lọc A - Dung môi chiết, B - Dung dịch chuẩn phổ hấp thụ, C - Dịch chiết mẫu thực phổ hấp thụ D - Dịch chiết mẫu thực thêm chuẩn phổ hấp thụ 30.00 - Khoảng tuyến tính: Chuẩn α-LA β-LG chuẩn bị thành dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ dao động từ 30- 800 µg/mL Kết thực nghiệm (Bảng 1) cho thấy khoảng nồng độ có quan hệ tuyến tính chặt chẽ nồng độ lý thuyết diện tích píc săc ký đồ - Giới hạn phát (LOD) - Giới hạn định lượng (LOQ): Tiến hành xác định LOD theo phương pháp thực nghiệm (phương pháp tính tốn): Dùng mẫu có nồng độ thấp gần giá trị ngưỡng phát hiện, phân tích lặp lại 10 lần tính giá trị độ lệch chuẩn, giá trị trung bình Từ tính giá trị giới hạn phát giới hạn định lượng tương ứng với quy trình phân tích (Bảng 1) - Độ lặp lại: Được đánh giá qua lần phân tích độc lập ngày Kết thực nghiệm cho thấy có độ lặp lại phù hợp với yêu cầu mức nồng độ tương ứng theo yêu cầu AOAC (Bảng 1) - Độ (độ thu hồi): Được đánh giá thêm chuẩn α-LA β-LG vào mẫu mức nồng độ khác Kết thực nghiệm cho thấy độ thu hồi mức thêm chuẩn đạt yêu cầu AOAC (Bảng 1) Bảng Tóm tắt kết thẩm định Table Validation parameters Thơng số thẩm định Khoảng tuyến tính - Khoảng nồng độ - Phương trình hồi quy - Hệ số tương quan - Độ chệch (bias %) Yêu cầu AOAC R2 ≥ 0,99 ± 15 % (max) Kết α-LA β-LG 33,6 -768ppm y = 9966,4x - 4557,5 R² = 0,9955 36,4 - 803 ppm y = 4900,7x + 192231 R² = 0,9993 LOD=0,21 (g/100g); LOQ= 0,70 (g/100g) (R=4,11) LOD=0,95 (g/100g); LOQ= 3,17 (g/100g) (R=4,60) LOD - LOQ R = [4,10] - Độ lặp lại (n = 6) RSD% độ lặp lại - Hàm lượng 1%: ≤ 2,7% RSD%=1,73% - Hàm lượng 100%: ≤ 1,3% RSD%=1,76% Độ thu hồi (thêm chuẩn mức nồng độ) R% [1,100%]= 98 102% 97,9% - 102,8% 95,0% -104,9% 3.3 Ứng dụng phân tích thực phẩm bổ sung thị trường Sau thẩm định, phương pháp phân tích áp dụng để phân tích hàm lượng αLA β-LG số mẫu thực phẩm bổ sung dành cho trẻ nhỏ lấy ngẫu nhiên địa bàn Hà Nội Các mẫu dạng bột mã hóa chữ “B”, mẫu dạng lỏng mã hóa chữ “L” Kết phân tích mẫu thực tế liệt kê Bảng Bảng Kết phân tích mẫu thực tế STT Tên mẫu α-LA (g/100g, 100mL) β-LG (g/100g, 100mL) Tỷ lệ β-LG/α-LA β-LG + α-LA (g/100g, 100mL) Protein nhãn (g/100g, 100mL) % β-LG + αLA/ protein nhãn 10 11 12 13 14 15 16 17 B1 1,13 2,89 2,55 4,03 16,5 24,4 B2 2,26 5,14 2,28 7,40 21,5 34,4 B3 1,39 2,20 1,59 3,59 11,1 32,3 B4 1,43 4,08 2,85 5,51 15,2 36,3 B5 1,45 2,95 2,03 4,41 15,5 28,4 B6 1,09 3,05 2,79 4,14 16,0 25,9 B7 1,11 3,16 2,84 4,27 16,2 26,4 B8 1,26 3,15 2,50 4,41 16,8 26,3 B9 2,62 5,40 2,06 8,02 17,9 44,8 B10 1,24 3,31 2,66 4,56 18,1 25,2 B11 1,01 4,09 4,07 5,09 13,4 38,0 B12 2,96 6,68 2,25 9,64 15,2 63,4 L1 0,23 0,67 2,88 0,90 3,36 26,7 L2 0,35 0,81 2,31 1,17 3,10 37,6 L3 0,28 0,60 2,12 0,89 3,50 25,4 L4 0,17 0,48 2,79 0,65 3,10 20,9 L5 0,26 0,64 2,52 0,90 3.40 26,4 Kết phân tích cho thấy, tỷ lệ β-LG/α-LA mẫu sữa dao động khoảng 1,59 - 4,07 lần Theo lý thuyết, α-LA chiếm khoảng 20 -25% whey, β-LG khoảng 60 65%, nên tỷ lệ β-LG/α-LA theo lý thuyết khoảng 2,4 - 3,25 Có thể thấy có 8/17 mẫu sữa cho tỷ lệ gần sát lý thuyết Ngoài ra, hàm lượng β-LG + α-L chiếm khoảng 20,87 63,42% so với hàm lượng protein ghi nhãn Sự khác biệt lý giải nguồn gốc sữa khác (bò, dê, cừu) nên tỷ lệ whey/casein khác Hơn nữa, điều kiện bảo quản khác mà tỷ lệ hư hao, chuyển hóa qua q trình lưu trữ KẾT LUẬN Phương pháp định lượng đồng thời α-LA β-LG HPLC-PDA mẫu thực phẩm bổ sung xây dựng thẩm định Phương pháp thẩm định độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chụm, độ theo hướng dẫn AOAC Kết thẩm định cho thấy phương pháp đạt yêu cầu để áp dụng phân tích hàm lượng α-LA β-LG thực phẩm bổ sung, tiến hành phân tích phòng thử nghiệm có hệ thống HPLC phương pháp thường quy Những kết phân tích ban đầu từ số mẫu thực tế thị trường cho thấy có khác biệt lớn hàm lượng α-LA β-LG mẫu, thể không đồng đáng kể chất lượng sản phẩm Tuy nhiên, để có thêm đánh giá chất lượng whey protein, cần có thêm nghiên cứu thành phần khác, chứa hàm lượng nhỏ có giá trị quan trọng cải thiện sức khỏe Do vậy, tương lai, nhóm thực đề tài tiếp tục nghiên cứu mở rộng phân tích whey protein khác, mở rộng mẫu có chứa whey protein TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiêu Chuẩn Quốc Gia 9660:2013 (ISO 13875:2005) Sữa Dạng Lỏng - Xác Định Hàm Lượng β-Lactoglobulin Tan Trong Acid - Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao Pha Đảo, 2013 R Hartmann and H Meisel, “Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications - ScienceDirect,” Current Opinion in Biotechnology, 18 (2), 2007, pp 163–169 H Meisel, “Multifunctional peptides encrypted in milk proteins,” Biofactors, 21 (1–4), 2004, pp 55–61 H W Robinson and C G Hogden, “The Biuret Reaction in the Determination of Serum Proteins I a Study of the Conditions Necessary for the Production of a Stable Color Which Bears a Quantitative Relationship to the Protein Concentration,” J Biol Chem., 135 (2), 1940, pp 707–725 F Stumr et al., “Enzyme-linked immunosorbent assay kit for beta-lactoglobulin determination: interlaboratory study,” J AOAC Int, 92 (5), 2009, pp 1519–1525 B Miralles, V Rothbauer, M A Manso, L Amigo, I Krause, and M Ramos, “Improved method for the simultaneous determination of whey proteins, caseins and para-kappa-casein in milk and dairy products by capillary electrophoresis.,” J Chromatogr A, 915 (1–2), 2001, pp 225–230 Y Ren, Z Han, X Chu, J Zhang, Z Cai, and Y Wu, “Simultaneous determination of bovine α-lactalbumin and β-lactoglobulin in infant formulae by ultra-high-performance liquid chromatography–mass spectrometry,” Analytica Chimica Acta, vol 667, no 1, pp 96–102, May 2010 Summary METHOD VALIDATION FOR SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF WHEY PROTEINS IN DIETARY SUPPLEMENTS BY HPLC Nguyen Thi Hong Ngoc1, Mac Thi Thanh Hoa1, Vu Thi Thanh An2, Pham Thi Thanh Ha2, Cao Cong Khanh1, Le Thi Hong Hao1 National Institute for Food Control Hanoi University of Pharmacy A HPLC method has been validated for simultaneous determination of Alpha-lactalbumin (α-LA) and Beta- lactoglobulin (β-LG) contents in dietary supplements by HPLC-PDA The method was carried out in C18 column with a gradient of 0.1% TFA/ water – 0.1% TFA/ acetonitrile as mobile phase The proteins were detected at 215nm wavelength within 50 minutes The method was validated in specificity, linearity, precision and accuracy; and then was applied to analyze several random dietary supplements Keywords: Alpha-lactalbumin (α-LA), Beta-lactoglobulin (β-LG), whey, whey protein, Dietary supplement, HPLC, PDA METHOD VALIDATION FOR SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF WHEY PROTEINS IN DIETARY SUPPLEMENTS BY HPLC Nguyen Thi Hong Ngoc1, Mac Thi Thanh Hoa1, Vu Thi Thanh An2, Pham Thi Thanh Ha2, Cao Cong Khanh1, Le Thi Hong Hao1 National Institute for Food Control Hanoi University of Pharmacy A HPLC method has been validated for simultaneous determination of Alpha-lactalbumin (α-LA) and Beta- lactoglobulin (β-LG) contents in dietary supplements by HPLC-PDA The method was carried out in C18 column with a gradient of 0.1% TFA/ water – 0.1% TFA/ acetonitrile as mobile phase The proteins were detected at 215nm wavelength within 50 minutes The method was validated in specificity, linearity, precision and accuracy; and then was applied to analyze several random dietary supplements Keywords: Alpha-lactalbumin (α-LA), Beta-lactoglobulin (β-LG), whey, whey protein, Dietary supplement, HPLC, PDA INTRODUCTION Whey protein, as one of the two most important components of milk protein, has become an important part of the dairy industry thanks to some health benefits Over the last few years, whey protein has become increasingly popular as a dietary supplement, functional food for adults and an important nutritional ingredient in milk - supplement for babies The biological components of whey, including lactoferrin, β-lactoglobulin (β-LG), α-lactalbumin (α-LA), glycomacropeptide and immunoglobulin, have been proven to be a range of immune enhancement properties The two main components in whey protein, α-LA and β-LG, are precursors of ACE (Angiotensin Converting Enzyme) inhibitor peptides called lactokinin [2], which have antihypertensive activity and are resistant to obesity Other multifunctional peptides produced from whey are called α-Latorphin and β-Lactorphin, which affects the fatmaking process of adipocytes due to ACE inhibitory activity and may reduce the amount of fat absorbed from the diet [3] Currently, in the world and in Vietnam, there are a number of studies on methods to determine the content of α-LA and β-LG in supplementary foods The titration method had been developed by Robinson and colleagues since the 1940s [4] This method is simple, easy to implement but only applicable to single-component and non-selective material samples for the right proteins need to be analyzed Stumr et al [5] introduced a specific ELISA method for β-LG This method gives high selectivity and specificity, precision and accuracy that meet the requirements of AOAC evaluation with quantitative limit at 0.22 mg/kg and detection limit at 0,07 mg/kg Miralles B et al [6] studied capillary electrophoresis to simultaneously determine whey protein, casein and their metabolites The limits of determination are at 0.16 and 0.14 mg/mL with an average recovery at 99.54 and 105.18% for β-LG and para-kappacasein respectively Yiping Ren and colleagues [7] developed a method to simultaneously determine α-LA and β-LG by high-performance liquid chromatography using a mass spectrometry detector Compared with previous methods, this method helps reduce analysis time and reduces detection limit The method was assessed linearly (R2 ≥ 0.9991), sensitivity (quantitative limit 0.15 - 0.19 μg/mL), recovery (94.0 - 98.7%), accuracy (relative deviation ≤ 11.1%) and reproducibility (the relative standard deviation ≤ 5.7%) According to TCVN 9660: 2013 standard (based on ISO 13875: 2005) on Liquid Milk - Determination of acid-soluble β-lactoglobulin content [1], liquid milk samples (fresh milk, pasteurized milk and condensed milk) are adjusted to pH level below 4.6 to precipitate casein The extracted solution from sample will be appropriately diluted and analyzed on HPLC system On the one hand, this method has the advantage of being easy to implement that can be applied in many laboratories, but has only been applied to liquid milk matrix samples, there has not been testing on powder milk matrix samples and some other dairy products such as cheese Otherwhile, the method just examines only one protein as β-lactoglobulin, but the α-lactalbumin is not mentioned yet So it is necessary to consider further to prove that these two proteins not overlap during analysis sample process because these two proteins almost always go together The liquid chromatography method uses a mass spectrometry detector with high sensitivity and selectivity But it requires complicated sample processing and expensive equipment Meanwhile, the HPLC method is a method noted for a stable, efficient method, using of popular chemincals and equipment, easy to implement, adapt to the condition of laboratories in Vietnam In order to increase the applicability of the study, the researchers team selected HPLC techniques to separate the whey proteins in the study RESEARCH OBJECT AND METHODS 2.1 Research object Supplementary samples contained whey are taken randomly from the market 2.2 Research methods 2.2.1 Equipment, devices and chemicals 2.2.1.1 Equipment and devies Alliance high-performance liquid chromatography system (HPLC) includes highpressure pump, column thermostat, auto-injector connected to PDA detector of Waters company C18 Sunfire column (250 mm x 4,6 mm, µm) and respectivity of pre-column (Waters) Other tools and auxiliary equipment of laboratory 2.2.1.2 Chemicals - Standard α-lactabumin from bovine milk Type III (purity ≥ 85%) and β-lactoglobulin from bovine milk ( ≥ 90% purity) of Sigma Aldrich - Acetonitrile for HPLC, Merck - Trifluoroacetic acid (TFA), 37% chlorohydric acid (HCl), glacial acetic acid (Merck) - Twice-distilled water 2.2.2 Implementation 2.2.2.1 Preparation of standard substances - Standard stock solution: Accurately weigh 50mg of the standard and transfer to a 50ml volumetric flask, dissolve completely and make up to the mark with H2O and mix well - Working standard range: prepare working ranges from 30- 800 µg/mL 2.2.2.2 Sample preparation The sample is ground, crushed, finely ground and mixed well to achieve sensorial uniformity Accurately weigh about 2,0 g of sample into a 50 mL centrifugal tube, add about within 45 mL of 0,05M acetic acid solution, vortex 30 seconds and not move in 10 minutes After that, the filted solution of samples were centrifuged and decanted into volumetric flask which made up into 50 mL with distilled water The filted solution of samples were diluted with H2O and filtered through a 0,45 µm membrane filter before analyzing on HPLC 2.2.2.3 Conditions of chromatography In order to develop a simultaneous analysis of α-LA and β-LG, the following chromatographic conditions were used: - C18 column (250 mm x 4,6 mm x µm) Flow rate of mobile phase: 0,8mL/ minute Mobile phase: channel A (TFA 0,1% (v/v) in the water); channel B (TFA 0,1% (v/v) in acetonitrile); gradient: - 35 minutes: 30% A - 50% B, 35 - 40 minutes: 50% A - 30% B - Sample pump volume: 20µl - Detector PDA: λ = 215nm RESULT AND DISCUSSION 3.1 Conditions for samples treatment and analysis With reference to documents [1] and laboratory investigation, it was found out using C18 separation column with mobile phase according to gradient elution program that consists of two channels containing TFA 0.1% domestically (channel A) and TFA 0.1% in ACN gives the best separation effect α-LA and β-LG Since the object of the study is the milk and milk-based supplements, the supplement containing whey is a complex sample background, which requires a sample treatment process to clean up impurities and types remove some co-eluting proteins during chromatography αLA and β-LG are present in the milk matrix with small amounts while the sample contains a large amount of casein, so precipitation is required to remove casein, α-LA and β-LG are separated by centrifugation and analysis on HPLC In this study, some solvents were used to investigate sample handling conditions The results showed that the 0.05 acetic acid solution for the extract after centrifugation was in the most Acetic acid is a weak acid with pKa = 4.75, 0.05M acetic acid solution has a pH level at about 3, it is possible to extract α-LA and β-LG and precipitate casein without adjusting the pH α-LA and β-LG are not precipitated and can be analyzed directly by the distillation of extracted solution Therefore, 0.05M acetic acid solution was selected to extract the α-LA and the β-LG After selecting the chromatographic conditions and sample handling conditions, the method is verified to validate the use of value and apply some actual sample analysis Thus, the specific samples treatment process includes the following steps: Weigh - g of the sample into a 50 mL centrifugal tube, add 35 ml of acetic acid 0.05M, shake the within minute and let stand for 15 minutes Shake within minute, centrifuge 6000 rpm within minutes Measure 50 mL with 0.05M acetic acid Filter and analyze by HPLC 3.2 Method validation - Specificity: simultaneous analysis of standard solutions of α-LA and β-LG, sample extraction solvent and real samples, real samples added standard on HPLC system Then, the specifity of method was evaluated by comparing the retention times between standard solution, real sample, real sample with standard and solvent used to extract samples The analytical results show that, the chromatogram of the sample extraction solvent not have any peaks in the same retention time of of α-LA and β-LG on the chromatogram of the standard solution (Figure 1) At the same time, on the chromatogram of the real sample, real sample with standard appeared the p-α-LA and β-LG’s peaks with retention time of the standard (bias in 0.34%) in which the absorption spectra is similar to the spectral shape, the maximum wavelength, the maximum number of wavelengths Thus, the process has been developed to allow analysis the content of α-LA and β-LG in the selected sample matrix 0.02 AU 0.00 -0.02 A -0.04 -0.06 10.00 20.00 30.00 Minutes 40.00 0.06 0.08 0.04 AU 0.06 0.04 0.02 0.02 B AU 280.2 0.00 23.111 Peak 0.00 201.0 0.060 0.050 -0.02 0.040 AU 0.030 0.020 -0.04 0.010 279.0 23.111 - 2898451 201.0 18.421 - 4511957 18.421 Peak 0.10 0.000 -0.010 -0.06 -0.020 200.00 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 nm 320.00 340.00 360.00 380.00 400.00 0.00 10.00 20.00 30.00 Minutes 40.00 17.360 Peak 201.0 0.015 22.908 - 2046015 0.04 0.02 0.005 280.2 318.3 C 346.5 370.4 AU 0.000 17.920 - 667466 AU 0.010 -0.005 22.534 Peak 0.00 -0.02 201.0 0.06 -0.04 AU 0.04 0.02 -0.06 276.6 0.00 5.00 10.00 -0.02 200.00 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 nm 320.00 340.00 360.00 380.00 400.00 15.00 20.00 Minutes 25.00 30.00 17.437 Peak 201.0 0.025 0.050 18.519 - 972058 0.040 AU 0.030 0.020 0.020 0.010 281.4 398.1 AU 0.000 -0.010 -0.020 D 0.015 22.481 Peak 201.0 0.010 0.20 AU 0.15 22.787 - 1018063 0.060 0.005 0.10 0.000 0.05 5.00 277.8 0.00 200.00 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 nm 320.00 340.00 360.00 380.00 400.00 10.00 15.00 20.00 Minutes 25.00 Figure Specific and selective chromatograms A - Extracted solvent, B - Standard solution and absorption spectrum, C - Extracted solution of real sample and absorption spectrum D - Extracted solution of real sample with standard addition and absorption spectra 30.00 - Linear range: Standards of α-LA and β-LG are prepared into working standards with concentrations ranging from 30 to 800 µg/mL Experimental results (Table 1) show that in this concentration range, the theoretical concentration and the peaks area on the chromatogram demonstrate the relation of closed linearity - Limitation of detection (LOD) - Limitation of quantification (LOQ): Conduct LOD determination by means of method (calculation method): Use samples with low concentration which is closed to the value of limitation of detection, repeatation of analysis 10 times and calculate the standard deviation values, the average value From that, calculate the limitation of detection and limitation of quantification were calculated correspondly to the analytical procedure (Table 1) - Repeatability: Evaluated through independent analyses of the day Experimental results show that the repeatability is consistent with the concentration level correspondly to the AOAC’s requirements - Trueness (recovery): Evaluated when adding standard α-LA and β-LG to samples matrix at different concentration levels Experimental results show that the recovery at standard addition levels meets the requirements of AOAC (Table 1) Table Summary of validation parameters Verification parameters Linear range AOAC’s requirements Results α-LA β-LG Concentration range Equation of regression Correlation coefficients R2 ≥ 0.99 ± 15 % (max) 33.6 -768ppm y = 9966.4x – 4557.5 R² = 0.9955 36.4 - 803 ppm y = 4900.7x + 192231 R² = 0.9993 LOD=0.95 (g/100g); LOQ= 3.17 (g/100g) (R=4.60) Bias LOD - LOQ R = [4.10] LOD=0.21 (g/100g); LOQ= 0.70 (g/100g) (R=4.11) - Repeatability (n = 6) RSD% - Amount 1%: ≤ 2.7% - Amount 100%: ≤ 1.3% RSD%=1.73% RSD%=1.76% Recovery (addition of standard substance at different levels of concentration R% [1.100%]= 98 102% 95.0% -104.9% 97.9% - 102.8% 3.3 Application of supplementary food analysis in the market After method verification, the analytical method was applied to analyze the content of α-LA and β-LG in some samples of supplementary foods for children randomly taken in Hanoi Powdered samples are encoded with "B", liquid samples are encoded with "L" The results of the actual sample analysis are listed in Table Table Analysed results of the actual samples Order Name of samples α-LA (g/100g, 100mL) β-LG (g/100g, 100mL) Ratio β-LG/α-LA β-LG + α-LA (g/100g, 100mL) Labeled protein (g/100g, 100mL) % β-LG + αLA/ labeled protein 10 11 12 13 14 15 16 17 B1 1.13 2.89 2.55 4.03 16.5 24.4 B2 2.26 5.14 2.28 7.40 21.5 34.4 B3 1.39 2.20 1.59 3.59 11.1 32.3 B4 1.43 4.08 2.85 5.51 15.2 36.3 B5 1.45 2.95 2.03 4.41 15.5 28.4 B6 1.09 3.05 2.79 4.14 16.0 25.9 B7 1.11 3.16 2.84 4.27 16.2 26.4 B8 1.26 3.15 2.50 4.41 16.8 26.3 B9 2.62 5.40 2.06 8.02 17.9 44.8 B10 1.24 3.31 2.66 4.56 18.1 25.2 B11 1.01 4.09 4.07 5.09 13.4 38.0 B12 2.96 6.68 2.25 9.64 15.2 63.4 L1 0.23 0.67 2.88 0.90 3.36 26.7 L2 0.35 0.81 2.31 1.17 3.10 37.6 L3 0.28 0.60 2.12 0.89 3.50 25.4 L4 0.17 0.48 2.79 0.65 3.10 20.9 L5 0.26 0.64 2.52 0.90 3.40 26.4 Analysed results showed that the ratio of the-LG / α-LA in milk samples ranged from 1.59 to 4.07 times In theory the α-LA accounts for about 20-25% whey the β-LG about 60 65% so the ratio of the β-LG / α-LA would theoretically be about 2.4 to 3.25 It could be seen that there are 8/17 milk samples that are closed to theory In addition the LG-LG + α-L content accounts for about 20.87 - 63.42% compared to the protein content on the label This difference can be explained by the different milk sources (cows goats sheep) which made the different rates of whey/casein ratio varies Moreover due to the difference of storage conditions made the differences rate of damage and transferation through each other during storage process CONCLUSION Simultaneous quantitative methods of the α-LA and β-LG by HPLC-PDA in the supplementary food samples were developed and validated The method has been assessed for specificity linear range limitation of detection limitation of quantification precision accuracy according to AOAC guidelines The validated results show that the method is satisfied to analytical application for the α-LA and β-LG in supplement foods and could be carried out in laboratories with HPLC systems as a routine method The initial analysis results from some actual samples on the market show that there is a big difference in the content of the α-LA and β-LG among samples It is a evidence that the samples are not the same quality of whey protein However for further assessment of whey protein quality it needs more researchs on other ingredients which contain small amounts but it has a highly value in improving health Therefore in the future the project team will continue to analysis expanding of other whey proteins as well as increasing the number of samples matrix with whey proteins REFERENCES Tiêu Chuẩn Quốc Gia 9660:2013 (ISO 13875:2005) Sữa Dạng Lỏng - Xác Định Hàm Lượng β-Lactoglobulin Tan Trong Acid - Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao Pha Đảo 2013 R Hartmann and H Meisel “Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications - ScienceDirect.” Current Opinion in Biotechnology 18 (2) 2007 pp 163–169 H Meisel “Multifunctional peptides encrypted in milk proteins.” Biofactors 21 (1–4) 2004 pp 55–61 H W Robinson and C G Hogden “The Biuret Reaction in the Determination of Serum Proteins I a Study of the Conditions Necessary for the Production of a Stable Color Which Bears a Quantitative Relationship to the Protein Concentration.” J Biol Chem 135 (2) 1940 pp 707–725 F Stumr et al “Enzyme-linked immunosorbent assay kit for beta-lactoglobulin determination: interlaboratory study.” J AOAC Int 92 (5) 2009 pp 1519–1525 B Miralles V Rothbauer M A Manso L Amigo I Krause and M Ramos “Improved method for the simultaneous determination of whey proteins caseins and para-kappa-casein in milk and dairy products by capillary electrophoresis ” J Chromatogr A 915 (1–2) 2001 pp 225–230 Y Ren Z Han X Chu J Zhang Z Cai and Y Wu “Simultaneous determination of bovine α-lactalbumin and β-lactoglobulin in infant formulae by ultra-high-performance liquid chromatography–mass spectrometry.” Analytica Chimica Acta vol 667 no pp 96–102 May 2010 THẦM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ WHEY PROTEIN TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Thị Hồng Ngọc1 Mạc Thị Thanh Hoa1 Vũ Thị Thanh An2 Phạm Thị Thanh Hà2 Cao Công Khánh1 Lê Thị Hồng Hảo1 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Đại học Dược Hà Nội Tóm tắt Một phương pháp xác hiệu xác định hàm lượng hai thành phần whey protein Alpha-lactalbumin (α-LA) Beta-lactoglobulin (β-LG) thực phẩm bổ sung kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo với detector PDA phát triển thẩm định Phương pháp sử dụng cột C18 pha động với chương trình gradient gồm hai kênh: kênh A (TFA 0.1% (v/v) nước kênh B (TFA 0.1% (v/v) acetonitrile) αLA β-LG phát bước sóng 215nm vòng 50 phút Phương pháp thẩm định độ đặc hiệu khoảng tuyến tính giới hạn phát giới hạn định lượng độ chụm độ đúng; sau áp dụng phân tích hàm lượng số mẫu thực phẩm bổ sung lấy ngẫu nhiên thị trường Từ khóa: Alpha-lactalbumin (α-LA); Beta-lactoglobulin (β-LG); whey; whey protein; Thực phẩm bổ sung HPLC PDA Điện thoại: 0975565542 Email: hnngoc1710@gmail.com ... DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ THANH AN Mã sinh viên: 1401007 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ WHEY PROTEIN TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS... hàm lượng số whey protein thực phẩm bổ sung sắc ký lỏng hiệu cao thực với mục đích sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời α-Lactalbumin βLactoglobulin thực phẩm bổ sung mẫu:... “Thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số whey protein thực phẩm bổ sung bẳng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao tạp chí Viện Kiểm nghiệm An tồn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia), nhóm nghiên cứu rút số