Các chủng Vibrio chọn lọc được nuôi cấy trong môi trường LB 3% NaCl, rồi đem nhân sinh khối trên máy lắc trong vòng 18 giờ với tốc độ 150 vòng/phút. Sau đó đem dịch nuôi cấy đi ly tâm thu cặn tế bào. DNA tổng số được tách chiết từ tế bào vi khuẩn Vibrio bằng cách sử dụng proteinase K, đệm phân giải tế bào. Sau đó thực hiện phản ứng PCR theo quy trình Wizard®SV Genomic DNA Purification System cải tiến để nhân lên các đoạn gen độc tố toxR và tdh. Cuối cùng tiến hành điện di sản phẩm của phản ứng PCR trong đệm TBE 0,5X dưới nguồn điện 120V.
Hình 3.8. DNA tổng số của các chủng vi khuẩn đƣợc điện di và soi dƣới tia UV
(M: marker 100bp; 1-2: chủng C23 ; 3-4: chủng C2; 5-6: chủng C7)
Hình 3.9. Sản phẩm khuếch đại gen toxR đƣợc điện di và soi dƣới tia UV
(M: marker 100 bp;1: chủng23; 2: chủng2; 3: chủng7 )
Kết quả điện di từ hình 3.9 cho thấy, một sản phẩm PCR dài khoảng 370 bp tương ứng với một đoạn gen toxR dài 368 bp đã được phát hiện ở tất cả các chủng phân tích. Đây là gen bảo tồn đặc trưng của loài V. parahaemolyticus (Zulkifli và cộng sự, 2009). Đầu tiên chúng được xác định là gen điều hòa operon độc tố nhưng sau đó được nghiên cứu và chỉ ra điều hòa thêm nhiều gen khác trong bộ gen (Miller
và cộng sự, 1987). Xác định các gen độc tố nhằm xác định các chủng gây bệnh, nhưng gen toxR lại được sử dụng để xác định tất cả các chủng không gây bệnh và chủng gây bệnh cũng như chức năng điều hòa sự biểu hiện của các gen độc tố trong loài V. parahaemolyticus (Zulkifli và cộng sự, 2009).
Gen tdh chỉ có mặt trong các chủng Vibrio gây độc. Theo báo cáo Takeda và cộng sự (1978) tất cả các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ các mẫu lâm sàng (mẫu bệnh phẩm) đều có 100% gen độc tố tdh nhưng chỉ có 1-5% các chủng từ môi trường có mang gen này. Đáng chú ý là ở các loài V. mimicus, V. cholerae và V. hollisae cũng có gen độc tố tương tự gen tdh.
Một đoạn gen dài 251 bp nằm giữa 2 cặp mồi chiếm tỉ lệ gần 1/10 đoạn gen
tdh - đã thường được sử dụng để xác định gen độc tố (Lee và Pan, 1993; Luan,
≈ 370 bp 100 bp 300 bp 400 bp 100bp 1000 bp 1 2 3 M
2006). Tuy nhiên, tất cả các mẫu phân tích thu được đều không phát hiện thấy đoạn gen này. Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus được phân lập trong khu vực nghiên cứu có tỉ lệ gây bệnh không cao. Để xác nhận điều này, trong những nghiên cứu tiếp theo, đề tài cần mở rộng phạm vi lấy mẫu và số lượng mẫu trong môi trường. Việc phân lập các chủng từ các mẫu bệnh phẩm ở các bệnh viện địa phương cũng là một sự bổ sung rất quan trọng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Đề tài đã phân lập được 24 chủng vi khuẩn Vibrio trên các loài tôm, cua, mực được thu mua từ các chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, chợ Biển (Bãi Dương) ở thành phố Nha Trang.
2. Mật độ tế bào vi khuẩn Vibrio trên các loài hải sản này tương đối cao (106- 108 tế bào/gam), có thể là mối nguy về vấn đề ngộ độc thực phẩm hải sản ở địa phương.
3. Tỉ lệ tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên các loài cua, mực thấp hơn rất nhiều so với phân lập từ tôm.
4. Dựa trên các đặc điểm hình thái tế bào và các đặc tính sinh hóa đề tài đã tuyển chọn được 5 chủng có đặc điểm tương tự với V. parahaemolyticus.
5. Sử dụng kỹ thuật PCR đã xác định được gen điều hòa gen độc tố toxR có mặt trong tất cả chủng trên. ToxR là gen bảo tồn đặc trưng cho loài V. parahaemolyticus nên có thể kết luận tất cả 5 chủng này đều thuộc loài V. parahaemolyticus. Có thể sử dụng toxR như là một gen đích để xây dựng phương pháp phát hiện nhanh V. parahaemolyticus trong các mẫu hải sản bằng kỹ thuật PCR.
6. Không xác định được gen độc tố tdh có trong cả 5 loài V. parahaemolyticus nói trên. Điều này cho thấy vi khuẩn V. parahaemolyticus có nguồn gốc từ mẫu môi trường chủ yếu là các loài không mang gen độc tố.
Kiến nghị
1. Cần mở rộng phạm vi nghiên cứu lấy mẫu trên nhiều khu vực, kể cả lấy các mẫu bệnh phẩm.
2. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình phát hiện nhanh các vi khuẩn V. parahaemolyticus trên hải sản bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho các gen độc tố, trong đó có toxR.
3. Cơ chế gây bệnh của loài vi khuẩn V. parahaemolyticus, cụ thể là các protein độc tố tác động vào các tế bào vật chủ chưa được hiểu rõ nên cần tiếp tục nghiên cứu để tìm ra biện pháp điều trị bệnh kịp thời.
4. Trong đề tài chỉ thực hiện phản ứng PCR đối với hai gen toxR và tdh. Ngoài ra còn có gen trh mã hóa nên protein TRH, là hemolysin thứ hai gây nên ngộ độc thực phẩm vì vậy cần thực hiện cả phản ứng PCR để nhân gen trh.
5. Vi khuẩn V. parahaemolyticus không chỉ gây ngộ độc trên người mà chúng còn gây bệnh trên các loài hải sản (tôm, cá,…) nên cần mở rộng nghiên cứu cho các vật chủ khác nhau.
6. Tích cực tuyên truyền nguy cơ ngộ độc thực phẩm do ăn nướng, tái hải sản và cách phòng bệnh tốt nhất là ăn chín uống sôi để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm tránh rủi ro cho người tiêu dùng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ, Nguyễn Thị Thùy Giang
(2008) Nghiên cứu bệnh mòn vây, cụt đuôi ở cá mú Epinephelus spp. nuôi ở Khánh Hòa. Tạp chí KHCN số 01/2008 trường Đại học Nha Trang. 6-13 tr.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (1998) Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, 300 tr.
3. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hƣơng (2008) Thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm. Nhà xuất bản đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh. 152 tr.
4. Trần Linh Thƣớc (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm; Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, 230 tr.
5. Võ Văn Nha, Đỗ Thị Hòa (2006) Nghiên cứu tác nhân gây bệnh đỏ thân ở tôm Hùm Bông (Panulirus ornatus) nuôi lồng tại Phú Yên, Khánh Hòa. Tạp chí KHCN số 03-04/2006 trường Đại học Nha Trang, 18-23 tr.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
6. Alcaide E., Amaro C., Todoli R. and Oltra R. (1999) Isolation and characterization of Vibrio parahaemolyticus causing infection in Iberian toothcarp
(Aphanius iberus). Diseases Of Aquatic Organisms Vol. 35, p. 77-80.
7. Bockemuhl J. and Triemer A. (1974) Ecology and epidemiology of Vibrio parahaemolyticus on the coast of Togo. Bull World Health Organ, 51(4), p. 353–360.
8. Cabrera-Garcıa M.E., Vazquez-Salinas C., and Quinones-Ramırez E. I. (2004) Serologic and Molecular Characterization of Vibrio parahaemolyticus
Strains Isolated from Seawater and Fish Products of the Gulf of Mexico. Applied and environmental microbiology. Vol. 70, No.11, p.6401-6406.
9. Chowdhury N.R., Chakraborty S., Ramamurthy T., Nishibuchi M., Yamasaki S., Takeda Y., and Nair G.B.. Molecular Evidence of Clonal Vibrio parahaemolyticus Pandemic Strains. Emerging Infectious Diseases, Vol. 6, No. 6, p. 631-636.
10. Chan S.S.W., Ng K.C., Cheung W.L., Rainer T.H. (2002) Vibrio parahaemolyticus: a leading cause of infectious diarrhoea in Hong Kong. Hong Kong Journal of Emergency Medicine. Vol. 9(1).p. 23 – 29.
11. Dupray E. and Cormier M. (1983) Optimal Enrichment Time For Isolation Of Vibrio parahaemolyticus From Seafood. Appl Environ Microbiol. Vol. 46, No. 5, p. 1234-1235.
12. Fujino T., Sakazaki R., and Tamura K. (1974) Designation of the Type Strain of Vibrio parahaemolyticus and Description of 200 Strains of the Species. International Journal of systematic bacteriology, Vol.24, No.4, p. 447-449.
13. Karunasagar I., Sam T., Joseph W., Robert M.T., Hada T.H. and Rita R.C. (1994) Enhancement of Vibrio parahaemolyticus Virulence by Lysed Erythrocyte Factor and Iron. Infection and Immunity, Vol. 46, No. 1, p. 141-144.
14. Kodama T., Gotoh K., Hiyoshi H., Morita M., Izutsu K. (2010) Two Regulators of Vibrio parahaemolyticus Play Important Roles in Enterotoxicity by Controlling the Expression of Genes in the Vp-PAI Region. PLOS ONE, Volume 5,
Issue 1, p. 1-12.
15. Lee C. and Pan C. (1993) Rapid and specific detection of the thermostable direct haemolysin gene in Vibrio parahaemolyticus by the polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology, 139, p. 3225-3231.
16. Makino K., Oshima K., Kurokawa K., Yokoyama K., Uda T., Tagomori K., Iijima Y., Najima M., Nakano M., Yamashita A., Kubota Y.,
Kimura S., Yasunaga T., Honda T., Shinagawa H., Hattori M., Tetsuya I..
Genome sequence of Vibrio parahaemolyticus: a pathogenic mechanism distinct from that of V cholerae. Lancet; 361, p. 743–749.
17. Marlina E., Radu S., Kqueen C. Y., Napis S., Zakaria Z., Mutalib S. A. and Nishibuchi M. (2007) Detection of tdh and trh genes in Vibrio parahaemolyticus isolated from Corbicula moltkiana prime in West Sumatera, Indonesia. Southeast Asian J Trop Med Public Health. Vol 38 No. 2, p. 349-355.
18. Miwa N., Kashiwagi M., Kawamori F., Masuda T., Sano Y., Hiroi M. and Kurashige H. (2005) Levels of Vibrio parahaemolyticus and Thermostable Direct Hemolysin Gene-positive Organisms in Retail Seafood Determined by the Most Probable Number-polymerase Chain Reaction (MPN-PCR) Method. J. Food Hyg. Soc. Japan, Vol. 47, No. 2, p. 41-45.
19. McCarter L. (1999) The Multiple Identities of Vibrio parahaemolyticus.J Trop Med Public Heal, Vol 38 No. 2, p. 51-57.
20. Nishibuchi M. and Kaper J. B. (1995) Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus a virulence gene acquired by a marine bacterium. Infection and immunity, Vol. 63, No. 6, p. 2093–2099.
21. Nishibuchi M. and James K. P. (1985) Nucleotide sequence of the thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus. Journal of Bacteriology, Vol. 162, No. 2, p. 558-564.
22. Okuda J., Nakai T., Chang P. S., Takanori O., Nishino T., Koitabashi T. and Nishibuchi M. (2001) The toxR Gene of Vibrio (Listonella) anguillarum Controls Expression of the Major Outer Membrane Proteins but Not Virulence in a Natural Host Model. Infection and Immunity, No 10, Vol 6, p. 6091– 6101.
23. Rujiwat A. (2007) Thesis entitled Identificcation of Vibrio Cholerae, Vibrio parahaemolyticus, V. Vulnificus by Multiplex Polymerase Chain Reaction.
Mahidol University, ThaiLand, p. 114.
24. Tanil G. B., Radu S., Nishibuchi M., Napis R. A. R. S., Maurice L. and Gunsalam J. W. Characterization Of Vibrio parahaemolyticus Isolated From Coastal Seawater In Peninsular Malaysia, Southeast Asian J Trop Med Public Health, Vol 36 No. 4, p. 940-945.
25. Tetsuya I., Park K. S., Suthienkul O., Kozawa J., Yamaichi Y., Yamamoto K. and Honda T. (1998) Close proximity of the tdh, trh and we genes on the chromosome of Vibrio parahaemolyticus.Microbiology, 144, p. 2517-2523.
26. Tuyet D.T., Thiem V.D., Von Seidlein L., Chowdhury A., Park E., Canh D.G., Chien B.T., Van Tung T., Naficy A., Rao M.R., Ali M., Lee H., Sy T.H., Nichibuchi M., Clemens J. and Trach D.D. (2006) Clinical, epidemiological, and socioeconomic analysis of an outbreak of Vibrio parahaemolyticus in Khanh Hoa Province, Vietnam. Infect Dis, 186(11), p. 1615– 1620.
27. Vesth T., Wassenaar T. M., Hallin P. F., Snipen L., Lagesen K. and Ussery D. W. (2010) On the Origins of a Vibrio Species. Microb Ecol 59. p1– 13.
28. Wong H. C., Liu S. H., Wang T. K., Lee C. L., Chiou C. S., Liu D. P., Nishibuchi M., and Lee B. K. (2000) Characteristics Of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 From Asia. Applied And Environmental Microbiology, Vol. 66, No. 9, p. 3981–3986.
29. Yamaichi Y., Tetsuya I., Park K. S., Yamamoto K. and Honda M.
(1999) Physical and genetic map of the genome of Vibrio parahaemolyticus: presence of two chromosomes in Vibrio species. Molecular Microbiology 31(5), p. 1513-1521.
30. Zhang X. H. and Austin B. (1998) Haemolysins in Vibrio species. Journal Applied of Microbiology 2005, 98, p.1011-1019.
31. Zulkifli Y., Alitheen N. B., Son R., Yeap S. K., Lesley M. B. and Raha A. R. (2009) Identification of Vibrio parahaemolyticus isolates by PCR targeted to the toxR gene and detection of virulence genes. International Food Research Journal 16, p: 289-296.
32. Stewart B. J. and McCarterL. (2003) Lateral Flagellar Gene System of Vibrio parahaemolyticus. Journal of Bacteriology, Vol. 185, No. 15, p. 4508- 4518.