Nguyên lý phản ứng:
Phương pháp PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1986 – đây là một quy trình dựa trên sự hoạt động của enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn và mồi đặc hiệu, số lượng DNA đích sẽ tăng theo mỗi chu kì của phản ứng.
Một chu kì gồm 3 bước: bước đầu tiên là biến tính ở 91°–97°C, là bước làm biến tính mẫu DNA kép thành các chuỗi đơn; bước thứ hai là bắt cặp mồi ở 40°– 65°C, các đoạn mồi oligonucleotide ngắn gắn với các chuỗi DNA đơn; bước thứ 3 là kéo dài ở 68°–73°C, enzyme Taq polymerase (thermostable DNA polymerase) xúc tác tổng hợp một chuỗi DNA mới bằng sự kéo dài chuỗi mồi.
Phản ứng đòi hỏi hai đoạn mồi ngắn (oligonucleotides) để khuyếch đại trình tự DNA đích. Trong suốt phản ứng, sự có mặt của các dNTP tự do: dATP, dCTP, dGTP và dTTP sẽ liên kết với đầu 3’OH đã được hoạt hóa mang năng lượng ở mồi.
Cuối cùng, số lượng các bản DNA sao chép tăng lên gấp đôi ở mỗi chu kỳ. Đây là sự khuyếch đại theo cấp số nhân. Theo lý thuyết, kết quả sau n chu kỳ của phản ứng sẽ có 2n bản sao phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi.
Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR được thiết kế theo Marlina và cộng sự (2007) và có các đặc điểm được trình bày trong bảng 2.2.
Cặp mồi 1: ToxR toxR-F: 5´-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3´ toxR-R: 5´-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3´ Cặp mồi 2: Tdh tdh-F: 5´-GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC-3´ tdh-R: 5´-TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC-3´
Bảng 2.2. Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR
S T T Tên mồi Kích cỡ (bp) Trọng lượng (g/mole) Nồng độ (nmoles ) Thể tích đệm thêm vào (µl) Nồng độ gốc (mM) Nồng độ cuối (µM) 1 toxR-F 20 6099,0 31,4 62,8 0,5 10 toxR-R 21 6492,3 25,8 51,6 0,5 10 2 Tdh-F 23 7069,6 33,0 66,0 0,5 10 tdh-R 24 7271,8 31,4 62,8 0,5 10
Phản ứng PCR được chuẩn bị trong một thể tích 50 µl với các thành phần được trình bày trong bảng 2.3 và được chạy theo chu kì nhiệt trong hình 2.2.
Bảng 2.3. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl) Nước cất (dH20) 38 MgCl2 50 mM 2 mM 2 dNTP 10 µM 0,4 µM 2 Mồi F 10 µM 0,1 µM 0,5 Mồi R 10 µM 0,1 µM 0,5 Đệm Taq 10X 1X 5
DNA hệ gen vi khuẩn 2-20 ng 2
Taq polymerase 1,25 đơn vị 0,25
Hình 2.2. Sơ đồ chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR 2.3.8. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di
Mục đích: Phân tách các sản phẩm PCR từ gen toxR, tdh trên gel agarose.
Nguyên lý:
Dưới tác động của điện trường, các phân tử DNA (tích điện âm) khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau nên chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di. Qua đó ta có thể phân tách được từng đoạn DNA hoặc gen riêng rẽ. Trên điện trường các phân đoạn DNA có kích thước càng nhỏ thì có tốc độ di chuyển trên điện trường nhanh hơn.
Sau khi điện di kết thúc, các phân tử DNA có thể quan sát thấy nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang ethidium bromide. Chất này vào sau khi gel đã nấu để nguội đến 45oC, nó có tác dụng gắn kết với DNA bằng cách cài vào khe ở giữa các nucleotide và chúng sẽ được phát sáng khi soi dưới tia UV. Mỗi một băng điện di phản ánh một tập hợp các phân tử DNA có cùng kích thước.
Tiến hành
Lấy 0,6 g agarose và thêm vào 40 ml đệm TBE 0,5X (gel agarose 1,5%) vào trong bình tam giác 100ml, đun đến sôi và tan hoàn toàn. Sau đó để nguội khoảng
50oC, rồi thêm 2µl ethidium bromide 10mg/ml vào gel, lắc đều bình. Khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 40 – 45oC, đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược. Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra. Cho gel vào bồn điện di và thêm đệm TBE 0,5X cho đến khi ngập bản gel. Trộn đều 10 µl mẫu vừa chạy PCR với 2 µl chất nhuộm tải mẫu (loading dye 6X) cho nhẹ vào các giếng thứ 2, 3 cho đến giếng thứ 7. Giếng đầu tiên cho marker 1kp. Tiến hành chạy điện di với nguồn 120 V trong 40 phút. Đọc kết quả trên máy chụp và phân tích hình ảnh gel.
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập vi khuẩn vi khuẩn Vibrio từ thực phẩm hải sản
Hình 3.1. Các khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio sau một ngày (24 giờ) nuôi trên môi trƣờng thạch TCBS ở điều kiện pH 8,5 và nhiệt độ 37O
C
Các khuẩn lạc vi khuẩn được phân lập từ mẫu tôm (A) có tỉ lệ khuẩn lạc màu xanh cao trong khi các khuẩn lạc được phân lập từ cua (B) có tỉ lệ khuẩn lạc màu vàng cao hơn.
Hình 3.2. Các khuẩn lạc chủng C2 màu xanh (A) và khuẩn lạc chủng C13 màu vàng sữa (B)
A B
Bảng 3.1. Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng Vibrio đƣợc phân lập từ các mẫu hải sản ở chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, chợ biển (Bãi Dƣơng) S T T Tên chủng Nguồn gốc Mật độ tế bào (CFU/gam ) Đặc điểm hình thái 1 Chủng 1 (C1) Tôm bạc (Matapenaeu) 0,6.10
7 Khuẩn lạc có màu xanh: viền xanh
nhạt, tâm xanh đậm, trơn bóng, bờ
tròn đều, đường kính 1-2 mm.
2 Chủng 2 (C2)
Tôm bạc
(Matapenaeu) 7,7. 10
6 Khuẩn lạc có màu xanh: viền xanh nhạt, tâm xanh đậm, trơn bóng, bờ tròn đều, đường kính 1-2 mm.
3 Chủng 3 (C3)
Cua biển
(Scylla serrata) 7,4.107 Khuẩn lạc có màu vàng, to, trơn láng, bờ tròn đều, đường kính khoảng 3-4 mm.
4 Chủng 4 (C4)
Cua biển
(Scylla serrata) 5,3.107 Khuẩn lạc có màu xanh nhạt, bờ tròn đều, láng, đường kính nhỏ 1,5 mm.
5 Chủng 5 (C5)
Cua biển
(Scylla serrata) 0,6. 107 Khuẩn lạc hình tròn, viền vàng nhỏ, tâm đen, trơn bóng, đường kính khuẩn lạc khoảng 1mm. 6 Chủng 6 (C6) Tôm sú (Penaeus monodon) 9,1.107 Khuẩn lạc hình tròn, nhỏ, có màu vàng nhạt, trơn bóng, đường kính khuẩn lạc khoảng 1mm. 7 Chủng 7 (C7) Tôm bạc (Matapenaeu) 0,4.10 8
Khuẩn lạc có màu xanh đậm, trên bề mặt khuẩn lạc có các những chấm cùng màu xanh này, trơn bóng 3-4 mm. 8 Chủng 8 (C8) Tôm sú (Penaeus monodon) 1,62.108
Khuẩn lạc có màu vàng tối , trơn bóng, đường kính khoảng 2-3 mm. 9 Chủng 9 (C9) Tôm sú (Penaeus monodon) 0,11. 106
Khuẩn lạc có màu vàng xanh, bờ tròn đều, láng, đường kính nhỏ. 10 Chủng 10
(C10)
Tôm bạc
(Matapenaeu) 6,6.10
7 Khuẩn lạc có viền vàng, tâm đỏ, trơn, nhầy, đường kính 2-3 mm. 11 Chủng 11 Tôm bạc
(Matapenaeu 2,5.10
7 Khuẩn lạc có viền xanh vàng, tâm xanh nhỏ, đường kính 2-3 mm.
(C11) 12 Chủng 12 (C12) Tôm sú (Penaeus monodon) 1,4.108
Khuẩn lạc màu vàng nhạt, đường kính rất nhỏ, trơn bóng.
13 Chủng 13 (C13)
Tôm bạc
(Matapenaeu 1,2.10
8 Khuẩn lạc có màu vàng sữa, bờ tròn đều, láng, đường kính 1-2 mm. 14 Chủng 14
(C14)
Tôm bạc
(Matapenaeu 1,1.10
8 Khuẩn lạc rất nhỏ, màu đen.
15 Chủng 15 (C15) Tôm sú (Penaeus monodon) 0,92. 106
Khuẩn lạc có dạng rìa xanh tâm đen, trơn bóng, đường kính khoảng 0,5-1 mm. 16 Chủng 16 (C16) Tôm sú (Penaeus monodon) 4,6.107
Khuẩn lạc có màu đỏ, tâm đen, đường kính khuẩn lạc nhỏ. 17 Chủng 17 (C17) Mực ống (thuộc Bộ Loligo)
8,6. 106 Khuẩn lạc màu xanh, rất nhỏ. 18 Chủng 18 (C18) Mực ống (thuộc Bộ Loligo) 7,4. 105
Khuẩn lạc có màu vàng tối , trơn bóng, đường kính khoảng 2-3 mm. 19 Chủng 19
(C19)
Mực ống (thuộc
Bộ Loligo) 0,4. 10
6 Khuẩn lạc có màu vàng, to, trơn láng, bờ tròn đều, đường kính khoảng 3-4 mm.
20 Chủng 20 (C20)
Cua biển
(Scylla serrata) 10,2. 106 Khuẩn lạc có màu vàng sữa, trơn bóng, đường kính nhỏ.
21 Chủng 21 (C21)
Cua biển
(Scylla serrata) 5. 104 Khuẩn lạc có viền xanh vàng, tâm xanh nhỏ, ướt bóng, đường kính to 2-3 mm.
22 Chủng 22 (C22)
Cua biển
(Scylla serrata) 5,2.107 Khuẩn lạc có màu đỏ tía, nhỏ li ti.
23 Chủng 23 (C23) Tôm sú (Penaeus monodon) 7,8.107
Khuẩn lạc có màu xanh đậm, từ rìa cho đến tâm, bờ tròn đều, nhầy khi dùng que cấy thu lấy sinh khối. 24 Chủng 24 (C24) Mực ống (thuộc Bộ Loligo) 4,6.10 7 Khuẩn lạc có màu vàng đậm, sần sùi, đường kính 2-3 mm.
Kết quả phân lập các chủng Vibrio từ các mẫu hải sản thu được từ các chợ của thành phố Nha Trang và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc TCBS đã thu được 24 chủng vi khuẩn có mật độ tế bào và đặc điểm hình thái khác nhau (bảng 3.1). Một số chủng có một vài đặc điểm tương tự nhau, có lẽ chúng thuộc chung cùng một loài. Dựa theo khóa phân loại của Bergy và các nghiên cứu của Tetsuya và cộng sự (1998), Fujino và cộng sự (1974), Zulkifli và cộng sự (2009) khi mô tả hình thái của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, ta chọn lọc các chủng có đặc điểm như sau: tế bào hình phẩy khuẩn, khuẩn lạc hình tròn, bờ đều, màu xanh hoặc xanh đậm.
Trên các mẫu mực, thu được rất ít khuẩn lạc có đặc điểm hình thái giống loài
V. parahaemolyticus, chứng tỏ vi khuẩn này phân bố ít trên loài hải sản này. Ngược lại với loài này là tôm, hầu như mẫu nào cũng cho tỉ lệ các loài V. parahaemolyticus
rất cao, chứng tỏ đây là loài ưa thích cho loài vi khuẩn này sinh sống.
Từ kết quả từ bảng 3.1 còn cho thấy tình trạng hiện diện của vi khuẩn V.
parahaemolyticus trên hải sản đáng báo động ở tôm, bởi ở mật độ 106 – 108 có thể gây ra ngộ độc thực phẩm đối với loài mang gen độc tố (Daniel và cộng sự, 2000). Ở các loài khác như mực, cua, ghẹ thì sự phân bố của chúng không cao, đa phần là các chủng màu vàng và màu đen. Tuy không kiểm tra thấy các loài gây độc trong mẫu thu thập được từ một số chợ Nha Trang nhưng theo Cục an toàn vệ sinh thực phẩm VFA hàng năm nước ta vẫn có rất nhiều ca ngộ độc thực phẩm do ăn hải sản. Điều này có thể do môi trường, mầm bệnh hay do sự trôi dạt của các chủng gây bệnh mà các chủng không gây bệnh có thể biến chủng, thay đổi kiểu gen thành chủng gây bệnh và mẫu thu thập nằm trong phạm vi nhỏ nên chưa thể bao quát hết tình hình thực tế. Vì vậy, chúng ta không nên chủ quan trong việc lực chọn và bảo quản, chế biến thực phẩm hải sản, các thực phẩm này cần phải được mua tươi sống và ăn chín uống sôi để tránh các nguy cơ rủi ro ngoài ý muốn.
Trong các bước nuôi cấy tiếp theo, các chủng chọn lọc được quan sát hình thái tế bào và kiểm tra các phản ứng sinh hóa như khả năng lên men đường, khả năng sử dụng nguồn amino acid và khả năng chịu muối để định danh vi khuẩn.
3.2. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng Vibrio a. Soi tƣơi
a. Soi tƣơi
Tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus được nuôi cấy trên môi trường LB trong 24 giờ. Kiểm tra tính di động của chúng bằng cách cho một giọt xanh methylen 0,001% lên lam kính, sau đó thêm một giọt canh trường lên trên đó rồi đem quan sát dưới kính hiển vi (hình 3.3).
Hình 3.3. Tế bào chủng vi khuẩn C2 đƣợc soi tƣơi
(Tế bào vi khuẩn có màu xanh, hình phẩy khuẩn)
Dưới vật kính X-100, cho thấy, tế bào vi khuẩn được nhuộm bằng màu xanh của xanh methylen, chúng chuyển động trong môi trường. V. parahaemolyticus có thể đi vào cơ thể thụ động cùng với thức ăn hoặc chủ động qua vết thương và di chuyển tới cơ quan đích bằng tiêm mao này. Trên bề mặt của tiêm mao, có nhiều proton để điều khiển phương của nó, vi khuẩn chuyển động trong chất lỏng với động cơ được cung cấp bởi động lực của Natri (Stewart và McCarter, 2003), điều này cũng giải thích cho nhu cầu của vi khuẩn đối với Natri là bắt buộc. V. parahaemolyticus có tiêm mao đơn cực nên kiểu di động của nó là tiến tới chứ không quay vòng.
b. Nhuộm Gram
Sau khi chọn lọc các chủng Vibrio có màu xanh khi nuôi trên môi trường thạch TCBS ở 24 giờ, tiến hành nhuộm Gram rồi quan sát dưới kính hiển vi, ta thấy khuẩn lạc có màu hồng của Fuchsin chứng tỏ đây là vi khuẩn Gram âm. Điều này
-
i (outer (gồm lipoprotein và
96o (+
- -
).
Hình 3.4. Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio C7 sau khi nhuộm Gram
(Tế bào vi khuẩn có hình dấu phẩy, bắt màu hồng của Fuschin, và được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100)
3.3 Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Vibrio
Các chủng Vibrio được nuôi cấy trong môi trường APW 3% NaCl ở pH 8,5 ± 0,2 ở nhiệt độ phòng, được lắc với tốc độ 150 vòng/phút để xây dựng đường cong sinh trưởng. Kết quả chỉ ra rằng các chủng có tốc độ phát triển đồng đều nhau cho thấy khả năng sử dụng dinh dưỡng trong môi trường ngang nhau của các chủng ở các giai đoạn nuôi cấy.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Thời gian (giờ)
M ật độ t ế bào ( O D 600 ) C1 C2 C7 C15 C23
Hình 3.5. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Vibrio (C1, C2, C7, C15, C23) nuôi trên môi trƣờng APW, ở pH 8,5 ± 0,2, nhiệt độ phòng và lắc ở
150 vòng/phút
Quan sát các chủng trong quá trình nuôi cấy cho thấy chúng sinh trưởng và phát triển tạo nên đường cong sinh trưởng với 4 pha sinh trưởng là pha lag, pha logarit, pha cân bằng và pha suy vong. Khi cấy các chủng vào môi trường, mật độ tế bào rất thấp (OD600= 0,02-0,03). Lúc này do mới cấy chuyển từ môi trường thạch TCBS sang môi trường lỏng nên các chủng Vibrio phải thích nghi và làm quen với môi trường, sau đó chúng mới cảm ứng và sinh ra các loại enzyme phân giải thành phần môi trường. Vì vậy ở pha lag này, mật độ tế bào tăng rất chậm bởi sau 1 giờ
nuôi cấy chủng C23 có OD600 tăng lên 0,12 và chủng C2 tăng lên 0,15. Đến pha log, mất độ tế bào tăng đột ngột vì các enzyme phân giải môi trường đã sẵn có, dinh dưỡng môi trường giàu và ổn định nên các thành phần môi trường được tổng hợp với tốc độ đều và quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ nhất. Số lượng tế bào tăng theo lũy thừa, thời gian thế hệ đạt tới hằng số. Sau 5 giờ nuôi cấy OD600 tăng lên đến 0,48 đối với chủng C23 và 0,49 đối với chủng C2. Ở pha này OD600 tăng liên tục, sau 1 đến 1 giờ 30 phút thì OD600 tăng khoảng 0,2-0,3, đến khi các chủng vi khuẩn phát triển chậm lại sau 10 giờ nuôi cấy. Bước sang giai đoạn cân bằng thì tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng trao đổi chất giảm. Số lượng tế bào chết cân bằng với số tế bào sinh ra. Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH thay đổi...Theo số liệu đo được, OD600 ở pha cân bằng cao hơn so với các pha khác, độ đục này có thể vừa bao gồm sinh khối, xác tế bào và cả sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn. Chủng C2 có OD600 đạt 2,02 là cao nhất trong tất cả các chủng, còn chủng C15 đạt thấp nhất là 1,83 sau hơn 20 giờ nuôi cấy. Tiếp tục nuôi cấy, sau 21 và 25 giờ tiến hành đo OD600 thấy rằng chúng giảm mạnh đối với tất cả các chủng, chỉ sau hơn 4 giờ mà OD600 của chủng C15 chỉ còn 1,4, còn của chủng C2 là 1,73. Điều này cho thấy vi khuẩn đã đến giai đoạn suy vong, vi khuẩn chứa các enzyme tự phân giải tế bào, môi trường hết chất dinh dưỡng,…vì vậy vi khuẩn không tổng hợp các thành phần tế bào, các quá trình đình trệ và chúng bị chết.
Như vậy các chủng Vibrio đangnuôi cấy, bước sang giai đoạn cuối pha sinh trưởng thì mật độ tế bào (OD600) đạt 0,75-0,9. Ở giai đoạn này các chủng vi khuẩn đã tổng hợp đủ các thành phần tế bào và các enzyme phân giải cần thiết cho tế bào.
