a. Soi tƣơi
Mục đích: Quan sát hình thái, sự chuyển động của vi khuẩn. Tiến hành:
- Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001 % lên phiến kính. - Nhỏ một giọt canh trường lên thuốc nhuộm.
- Đậy lamen.
b. Nhuộm Gram
Mục đích: Xác nhận vi khuẩn Gram âm. Tiến hành:
- Dùng bút viết kính vẽ 1 đường tròn lên lam kính để giới hạn vùng phết vi khuẩn.
- Nhỏ 1 giọt nước từ bình tia vào vòng tròn đã vẽ.
- Dùng que cấy thu sinh khối từ khuẩn lạc chọn lọc, rồi đưa vào lam kính, dàn đều vi khuẩn, để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn, tránh để lâu quá nóng sẽ làm tế bào vi khuẩn vỡ ra, làm lệch kết quả quan sát.
- Nhỏ vài giọt tím tinh thể (tím violet) lên tiêu bản, để trong 30 giây đến 1 phút. - Nghiêng đổ rồi rửa lại nước.
- Nhuộm màu tiêu bản bằng thuốc nhuộm Lugol trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa nhẹ với nước bằng bình tia.
- Rửa tiêu bản vừa nhuộm với cồn 90o cho đến khi phiến kính bạc màu trong khoảng 10-15 giây, rồi rửa lại với nước.
- Nhuộm tiếp tiêu bản với Fuchsin trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa lại với nước.
- Để khô tự nhiên hoặc dung giấy thấm lau tiêu bản cho sạch xung quanh vùng vi khuẩn, sau đó đưa lên vật kính dầu quan sát X -100.
2.3.3. Xác định khả năng sinh trƣởng Mục đích:
- Xây dựng đường cong sinh trưởng (đường chuẩn) của vi khuẩn Vibrio. - Test sinh hóa.
- Giữ giống.
Nguyên lý:
Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng cách đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm. Dựa vào đường chuẩn để xác định các pha sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó tiến hành các bước giữ giống, test sinh hóa cho đúng với các giai đoạn phát triển của tế bào.
Tiến hành:
- Pha môi trường tăng sinh vi khuẩn APW 3% NaCl. - Cấy các chủng vi khuẩn đã chọn lọc vào môi trường.
- Nuôi cấy tĩnh các chủng vi khuẩn trên máy lắc ở 150 vòng/ phút trong vòng 36 giờ. - Tiến hành đo OD600 từ lúc cấy vào và cứ mỗi 2-3 giờ đo một lần.
- Dựng đường cong sinh trưởng của các chủng Vibrio.
2.3.4. Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio
a. Xác định khả năng chịu muối của vi khuẩn Vibrio
Mục đích: Kiểm tra khả năng sống của vi khuẩn ở các nồng độ muối, đặc
biệt là nồng độ 3% vì đây là nồng độ thích hợp để vi khuẩn phát triển.
Bố trí thí nghiệm:
- Môi trường canh thang trypton muối được pha ở các nồng độ muối 0%, 3%, 6%, 8%, 10% và được kí hiệu tương ứng thành T1N0, T1N3, T1N6, T1N8, T1N10 đem hấp khử trùng ở 121OC trong thời gian 15 phút.
- Rót 10ml môi trường đã hấp vào các ống nghiệm đã sấy để nguội, ta có mỗi chủng cần 5 ống nghiệm (5 ống chứa môi trường ở mỗi nồng độ muối) và 1 ống đối chứng âm.
- Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc của các chủng, cấy vào môi trường trypton muối khác nhau trong các ống nghiệm tương ứng.
- Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37OC. Quan sát từng ngày trong 5 ngày. - Các thao tác vi sinh được làm vô trùng trong tủ cấy vô trùng, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn.
b. Xác định khả năng lên men đƣờng của các chủng Vibrio
Mục đích:
Kiểm tra khả năng lên men các loại đường lactose, arabinose, sucrose, mantose, mannitol của vi khuẩn.
Nguyên lý:
Sản phẩm của quá trình lên men có thể là các loại acid hữu cơ, các loại rượu hay các loại khí, các sản phẩm này sẽ làm thay đổi pH môi trường. Dựa vào sự thay đổi màu của chỉ thị để đánh giá khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn.
Bố trí thí nghiệm:
- Pha môi trường cơ bản và pha các loại carbonhydrate 50%: sucrose, lactose, mantose, arabinose, mannitol trong nước cất, đem hấp khử trùng 121OC trong 10 phút.
- Môi trường cơ bản chứa chất chỉ thị là phenol đỏ, chất này có màu đỏ khi pH nằm trong khoảng 7,4 ± 0,2. Màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH dưới 6,8.
- Rót 5 ml môi trường cơ bản vào các ống nghiệm. Thêm 0,5 ml dung dịch từng loại đường vào từng ống nghiệm tương ứng sao cho môi trường cuối cùng có nồng độ carbonhydrate là 5%.
- Đậy nút bông và giấy bạc lại ở mỗi ống nghiệm cho kín.
- Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc các chủng, cấy vào các ống nghiệm môi trường chứa các loại đường.
- Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37OC. Quan sát từng ngày trong 5 ngày. - Các thao tác vi sinh được làm vô trùng trong tủ cấy vô trùng, bên cạnh ngọn đèn cồn.
- Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.
c. Xác định khả năng sử dụng decarboxylase lysin (LCD) của các chủng Vibrio
Mục đích: Kiểm tra khả năng sử dụng lysin. Nguyên lý:
Enzyme xúc tác thủy phân lysin sẽ được cảm ứng tổng hợp, chúng xúc tác loại bỏ CO2 khỏi lysin, dẫn đến sự tạo thành cadaverine. Khí CO2 được phóng thích sẽ làm thay đổi pH môi trường. Dựa vào sự thay đổi màu của chỉ thị để đánh giá khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn. Môi trường cơ bản chứa chất chỉ thị là phenol đỏ, chất này có màu đỏ khi pH nằm trong khoảng 7,4 ± 0,2. Màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH dưới 6,8.
Bố trí thí nghiệm:
- Pha môi trường cơ bản chứa lysin rồi rót 5 ml môi trường vào các ống nghiệm. - Đậy nút bông và giấy bạc lại ở mỗi ống nghiệm cho kín, đem hấp khử trùng 121OC trong 10 phút.
- Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc các chủng, cấy vào các ống nghiệm môi trường
- Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37OC. Quan sát từng ngày trong 5 ngày. - Các thao tác vi sinh được làm vô trùng trong tủ cấy vô trùng, bên cạnh ngọn đèn cồn.
2.3.5. Bảo quản chủng vi khuẩn.
Mục đích: Bảo quản các chủng vi khuẩn để sử dụng trong thời gian dài (3-6 tháng). Tiến hành:
Nuôi cấy vi khuẩn trong các bình tam giác chứa môi trường lỏng, lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ. Chia nhỏ huyền phù tế bào vào trong từng ống eppendorf 1,5 ml sau đó thêm vào glycerol theo tỉ lệ 7: 3. Vortex nhẹ cho đều hỗn hợp, rồi đem bảo quản ở -80OC.
2.3.6. Tách chiết DNA hệ gen từ tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus
Mục đích:
Thu được dung dịch DNA hệ gen tinh sạch có nồng độ đáp ứng cho yêu cầu chạy PCR.
Tiến hành:
- Từ 3 chủng vi khuẩn chọn lọc ta nuôi cấy riêng lẻ trong môi trường LB 3% NaCl lỏng lắc trong 18 giờ nhằm tăng sinh sinh khối vi khuẩn.
- Chuyển 1,5 ml huyền phù tế bào vào eppendorf 1,5 ml - Ly tâm dịch huyền phù ở 13.000 vòng trong 2 phút ở 4O
C - Loại bỏ dịch nổi, thêm vào 275 µl dung dịch phá mẫu, vortex
Dịch phá mẫu gồm (proteinase K 20mg/ml 10µl, Rnase 4mg/ml 5µl; đệm TE 1X 210 µl )
- Ủ mẫu trên block nhiệt 56oC trong 30 phút, vortex - Ly tâm huyền phù tế bào ở 13.000 vòng trong 3 phút ở 4O
C - Thu dịch nổi, chuyển sang ống mới chứa cột lọc DNA.
- Rửa DNA: Thêm vào 650 µl dung dịch rửa mẫu (chứa 95% ethanol) vào mỗi ống. Ly tâm dịch ở 13.000 vòng trong 1 phút ở 4OC. Loại bỏ chất lỏng trong ống, giữ lại cột lọc chuyển sang ống mới. Lặp lại bước này một lần.
- Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml mới. Thêm vào 250 µl dung dịch Nuclease – Free Water để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Ly tâm eppendorf có ống cột lọc chứa DNA ở 13.000 vòng trong 2 phút để để thôi DNA từ cột lọc xuống đáy ống.
- Thu được DNA mẫu, bảo quản ở 40C cho đến khi chạy phản ứng PCR.
2.3.7. Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Nguyên lý phản ứng: Nguyên lý phản ứng:
Phương pháp PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1986 – đây là một quy trình dựa trên sự hoạt động của enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn và mồi đặc hiệu, số lượng DNA đích sẽ tăng theo mỗi chu kì của phản ứng.
Một chu kì gồm 3 bước: bước đầu tiên là biến tính ở 91°–97°C, là bước làm biến tính mẫu DNA kép thành các chuỗi đơn; bước thứ hai là bắt cặp mồi ở 40°– 65°C, các đoạn mồi oligonucleotide ngắn gắn với các chuỗi DNA đơn; bước thứ 3 là kéo dài ở 68°–73°C, enzyme Taq polymerase (thermostable DNA polymerase) xúc tác tổng hợp một chuỗi DNA mới bằng sự kéo dài chuỗi mồi.
Phản ứng đòi hỏi hai đoạn mồi ngắn (oligonucleotides) để khuyếch đại trình tự DNA đích. Trong suốt phản ứng, sự có mặt của các dNTP tự do: dATP, dCTP, dGTP và dTTP sẽ liên kết với đầu 3’OH đã được hoạt hóa mang năng lượng ở mồi.
Cuối cùng, số lượng các bản DNA sao chép tăng lên gấp đôi ở mỗi chu kỳ. Đây là sự khuyếch đại theo cấp số nhân. Theo lý thuyết, kết quả sau n chu kỳ của phản ứng sẽ có 2n bản sao phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi.
Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR được thiết kế theo Marlina và cộng sự (2007) và có các đặc điểm được trình bày trong bảng 2.2.
Cặp mồi 1: ToxR toxR-F: 5´-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3´ toxR-R: 5´-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3´ Cặp mồi 2: Tdh tdh-F: 5´-GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC-3´ tdh-R: 5´-TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC-3´
Bảng 2.2. Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR
S T T Tên mồi Kích cỡ (bp) Trọng lượng (g/mole) Nồng độ (nmoles ) Thể tích đệm thêm vào (µl) Nồng độ gốc (mM) Nồng độ cuối (µM) 1 toxR-F 20 6099,0 31,4 62,8 0,5 10 toxR-R 21 6492,3 25,8 51,6 0,5 10 2 Tdh-F 23 7069,6 33,0 66,0 0,5 10 tdh-R 24 7271,8 31,4 62,8 0,5 10
Phản ứng PCR được chuẩn bị trong một thể tích 50 µl với các thành phần được trình bày trong bảng 2.3 và được chạy theo chu kì nhiệt trong hình 2.2.
Bảng 2.3. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl) Nước cất (dH20) 38 MgCl2 50 mM 2 mM 2 dNTP 10 µM 0,4 µM 2 Mồi F 10 µM 0,1 µM 0,5 Mồi R 10 µM 0,1 µM 0,5 Đệm Taq 10X 1X 5
DNA hệ gen vi khuẩn 2-20 ng 2
Taq polymerase 1,25 đơn vị 0,25
Hình 2.2. Sơ đồ chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR 2.3.8. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di
Mục đích: Phân tách các sản phẩm PCR từ gen toxR, tdh trên gel agarose.
Nguyên lý:
Dưới tác động của điện trường, các phân tử DNA (tích điện âm) khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau nên chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di. Qua đó ta có thể phân tách được từng đoạn DNA hoặc gen riêng rẽ. Trên điện trường các phân đoạn DNA có kích thước càng nhỏ thì có tốc độ di chuyển trên điện trường nhanh hơn.
Sau khi điện di kết thúc, các phân tử DNA có thể quan sát thấy nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang ethidium bromide. Chất này vào sau khi gel đã nấu để nguội đến 45oC, nó có tác dụng gắn kết với DNA bằng cách cài vào khe ở giữa các nucleotide và chúng sẽ được phát sáng khi soi dưới tia UV. Mỗi một băng điện di phản ánh một tập hợp các phân tử DNA có cùng kích thước.
Tiến hành
Lấy 0,6 g agarose và thêm vào 40 ml đệm TBE 0,5X (gel agarose 1,5%) vào trong bình tam giác 100ml, đun đến sôi và tan hoàn toàn. Sau đó để nguội khoảng
50oC, rồi thêm 2µl ethidium bromide 10mg/ml vào gel, lắc đều bình. Khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 40 – 45oC, đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược. Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra. Cho gel vào bồn điện di và thêm đệm TBE 0,5X cho đến khi ngập bản gel. Trộn đều 10 µl mẫu vừa chạy PCR với 2 µl chất nhuộm tải mẫu (loading dye 6X) cho nhẹ vào các giếng thứ 2, 3 cho đến giếng thứ 7. Giếng đầu tiên cho marker 1kp. Tiến hành chạy điện di với nguồn 120 V trong 40 phút. Đọc kết quả trên máy chụp và phân tích hình ảnh gel.
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn vi khuẩn Vibrio từ thực phẩm hải sản
Hình 3.1. Các khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio sau một ngày (24 giờ) nuôi trên môi trƣờng thạch TCBS ở điều kiện pH 8,5 và nhiệt độ 37O
C
Các khuẩn lạc vi khuẩn được phân lập từ mẫu tôm (A) có tỉ lệ khuẩn lạc màu xanh cao trong khi các khuẩn lạc được phân lập từ cua (B) có tỉ lệ khuẩn lạc màu vàng cao hơn.
Hình 3.2. Các khuẩn lạc chủng C2 màu xanh (A) và khuẩn lạc chủng C13 màu vàng sữa (B)
A B
Bảng 3.1. Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng Vibrio đƣợc phân lập từ các mẫu hải sản ở chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, chợ biển (Bãi Dƣơng) S T T Tên chủng Nguồn gốc Mật độ tế bào (CFU/gam ) Đặc điểm hình thái 1 Chủng 1 (C1) Tôm bạc (Matapenaeu) 0,6.10
7 Khuẩn lạc có màu xanh: viền xanh nhạt, tâm xanh đậm, trơn bóng, bờ tròn đều, đường kính 1-2 mm.
2 Chủng 2 (C2)
Tôm bạc
(Matapenaeu) 7,7. 10
6 Khuẩn lạc có màu xanh: viền xanh nhạt, tâm xanh đậm, trơn bóng, bờ tròn đều, đường kính 1-2 mm.
3 Chủng 3 (C3)
Cua biển
(Scylla serrata) 7,4.107 Khuẩn lạc có màu vàng, to, trơn láng, bờ tròn đều, đường kính khoảng 3-4 mm.
4 Chủng 4 (C4)
Cua biển
(Scylla serrata) 5,3.107 Khuẩn lạc có màu xanh nhạt, bờ tròn đều, láng, đường kính nhỏ 1,5 mm.
5 Chủng 5 (C5)
Cua biển
(Scylla serrata) 0,6. 107 Khuẩn lạc hình tròn, viền vàng nhỏ, tâm đen, trơn bóng, đường kính khuẩn lạc khoảng 1mm. 6 Chủng 6 (C6) Tôm sú (Penaeus monodon) 9,1.107 Khuẩn lạc hình tròn, nhỏ, có màu vàng nhạt, trơn bóng, đường kính khuẩn lạc khoảng 1mm. 7 Chủng 7 (C7) Tôm bạc (Matapenaeu) 0,4.10 8
Khuẩn lạc có màu xanh đậm, trên bề mặt khuẩn lạc có các những chấm cùng màu xanh này, trơn bóng 3-4 mm. 8 Chủng 8 (C8) Tôm sú (Penaeus monodon) 1,62.108
Khuẩn lạc có màu vàng tối , trơn bóng, đường kính khoảng 2-3 mm. 9 Chủng 9 (C9) Tôm sú (Penaeus monodon) 0,11. 106
Khuẩn lạc có màu vàng xanh, bờ tròn đều, láng, đường kính nhỏ. 10 Chủng 10
(C10)
Tôm bạc
(Matapenaeu) 6,6.10
7 Khuẩn lạc có viền vàng, tâm đỏ, trơn, nhầy, đường kính 2-3 mm. 11 Chủng 11 Tôm bạc
(Matapenaeu 2,5.10
7 Khuẩn lạc có viền xanh vàng, tâm xanh nhỏ, đường kính 2-3 mm.
(C11) 12 Chủng 12 (C12) Tôm sú (Penaeus monodon) 1,4.108
Khuẩn lạc màu vàng nhạt, đường kính rất nhỏ, trơn bóng.
13 Chủng 13 (C13)
Tôm bạc
(Matapenaeu 1,2.10
8 Khuẩn lạc có màu vàng sữa, bờ tròn đều, láng, đường kính 1-2 mm. 14 Chủng 14
(C14)
Tôm bạc
(Matapenaeu 1,1.10
8 Khuẩn lạc rất nhỏ, màu đen.
15 Chủng 15 (C15) Tôm sú (Penaeus monodon) 0,92. 106
Khuẩn lạc có dạng rìa xanh tâm đen, trơn bóng, đường kính khoảng 0,5-1 mm. 16 Chủng 16 (C16) Tôm sú (Penaeus monodon) 4,6.107
Khuẩn lạc có màu đỏ, tâm đen, đường kính khuẩn lạc nhỏ. 17 Chủng 17 (C17) Mực ống (thuộc Bộ Loligo)
8,6. 106 Khuẩn lạc màu xanh, rất nhỏ. 18 Chủng 18 (C18) Mực ống (thuộc Bộ Loligo) 7,4. 105
Khuẩn lạc có màu vàng tối , trơn bóng, đường kính khoảng 2-3 mm. 19 Chủng 19
(C19)
Mực ống (thuộc
Bộ Loligo) 0,4. 10
6 Khuẩn lạc có màu vàng, to, trơn láng, bờ tròn đều, đường kính khoảng 3-4 mm.
20 Chủng 20 (C20)
Cua biển
(Scylla serrata) 10,2. 106 Khuẩn lạc có màu vàng sữa, trơn