4.5.1. Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử của các dòng vi khuẩn Tất cả 40 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ cao nhất được tuyển chọn và đo hoạt tính nitrogenase sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường Burk lỏng, kết quả được ghi nhận ở Bảng 4.7.
Bảng 4.7. Hàm lượng nitrogenase được tổng hợp của 40 dòng vi khuẩn TT
Dòng
Vi khuẩn NH4+
(mg/l)
Nitrogenase ddBurk (àmol)
TT
Dòng
Vi khuẩn NH4+
(mg/l)
Nitrogenase ddBurk (àmol) 1 THL 103 6,26 a 0,2879 ab 21 TAL 5 3,62 mn 0,2207 hij 2 THL 105 6,08 b 0,2908 ab 22 TAM4 3,56 no 0,1591 mn 3 SHL 70 5,74 c 0,2412 fgh 23 PHM 106 3,56 no 0,1438 mno 4 TAL 22 5,54 d 0,2961 a 24 TAL 1 3,53 op 0,2021 jk 5 TAL 30 5,20 e 0,2776 a-e 25 PTHN 179 3,53 op 0,2868 ab 6 DHL 154 5,04 f 0,2851 abc 26 SHN 65 3,52 opq 0,1208 o 7 PHN 86 4,97 f 0,2826 a-d 27 DXN 146 3,52 opq 0,2778 a-e 8 TAN a5 4,89 g 0,2836 abc 28 TAM20 3,52 opq 0,1556 mn 9 TAN a7 4,35 h 0,1879 kl 29 PHM 104 3,52 op 0,1314 no 10 PHL 87 4,08 i 0,2168 hij 30 TAM14 3,46 pqr 0,2775 a-e 11 TAL 4 3,91 j 0,1974 jk 31 TAM a6 3,45 qr 0,2758 a-e 12 TAN 18 3,91 j 0,1654 lm 32 DHN 151 3,43 rs 0,0884 p 13 SHM 47 3,89 jk 0,2007 lm 33 TAN 19 3,42 rs 0,2404 fgh 14 TAM10 3,84 jk 0,1620 jk 34 TAM a9 3,42 rs 0,2325 ghi 15 PHL 76 3,83 k 0,2030 jk 35 TAM a15 3,41 rs 0,2649 b-f 16 TALa 14 3,74 l 0,2049 ijk 36 PHM 89 3,36 st 0,2333 gh 17 SHM 53 3,72 l 0,2819 a-d 37 PTHN 195 3,35 st 0,2532 efg 18 DXM 125 3,72 l 0,2765 a-e 38 SHIN 83 3,31 tu 0,2550 d-g 19 PHN 91 3,72 l 0,2891 ab 39 TAM a14 3,26 u 0,2516 efg 20 TAM18 3,64 m 0,2582 c-g 40 PTM 164 3,25 u 0,2435 fgh
F ** ** ** **
CV% 7,41 7,6 7,41 7,6
* Trong cùng một cột, các số liệu có chữ số theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ ý nghĩa 1% (**).
Kết quả ở Bảng 4.7 cho thấy tất cả 40 dòng vi khuẩn đều thể hiện hoạt tớnh nitrogenase với hàm lượng nitrogenase dao động từ 0,1208 àM đến 0,2961 àM và khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ ở mức 1%.
Kết quả ở Bảng 4.7 ghi nhận nhiều dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường Burk lỏng không đạm có hoạt tính nitrogenase khá cao như TAL 22 (0,2961 àmol), THL 105 (0,2908 àmol), PHN 91 (0,2891 àmol), THL 103 (0,2879 àmol), …. Khi so sỏnh mối tương quan giữa hoạt tớnh nitrogenase với hàm lượng NH4+ tạo ra trong dung dịch Burk sau 2 ngày thì đa số các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ cao trong dung dịch thì đều có hoạt tính nitrogenase khá cao. Hàm lượng NH4+ tạo ra trong dung dịch Burk tương quan thuận với hoạt tính nitrogenase và được ghi nhận ở Hình 4.12. Cả 2 chỉ tiêu này đều đóng vai trò quan trọng và góp phần xác định chính xác khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn.
Hình 4.12. Mối tương quan giữa hàm lượng NH4+ (mg/l) và hoạt tính Nitrogenase trong dung dịch Burk (àmol).
Sau khi đo hoạt tính nitrogenase của 40 dòng vi khuẩn trong môi trường Burk lỏng không đạm, đã chọn được 22 dòng có hoạt tính nitrogenase cao và bổ sung lên cây lúa trồng trong ống nghiệm, tiến hành đo hoạt tính nitrogenase của cây mạ sau 14 ngày, kết quả được ghi nhận ở Bảng 4.8.
Trong môi trường trồng cây, tất cả 22 dòng vi khuẩn đều có hoạt tính nitrogenase, hàm lượng nitrogenase dao động từ 0,1410 àmol - 0,3276 àmol, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% và cao nhất là dòng SHL70 (0,3276 àmol), kế đến PHL87 (0,2871 àmol), TALa14 (0,2757 àmol), TAL1 (0,2744 àmol) và thấp nhất là dũng PTHN 179 (0,1410 àmol) (Bảng 4.8).
Nitrogenase/ddBurk (àmol)
NH4+ (mg/l) y = 0.0258x + 0.1276
R2 = 0.1446
0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
r = 0,381*
n= 38 (40-2)
Bảng 4.8. Hàm lượng nitrogenase được tổng hợp của 22 dòng vi khuẩn bổ sung lên cây lúa
TT
Dòng Vi khuẩn
Nitrogenase ddBurk (àmol)
Nitrogenase MTCõy (àmol)
1 THL 103 0,2879 ab 0,1940 ef
2 THL 105 0,2908 ab 0,1916 de
3 SHL 70 0,2412 fgh 0,3276 a
4 TAL 22 0,2961 a 0,1907 def
5 TAL 30 0,2776 a-e 0,1837 d-g
6 DHL 154 0,2851 abc 0,1838 d-g
7 PHN 86 0,2826 abc 0,1446 hi
8 TAN a5 0,2836 abc 0,1690 di
9 PHL 87 0,2168 hi 0,2871 b
10 TAL 4 0,1974 ij 0,1963 d
11 TALa 14 0,2049 ij 0,2757 c
12 SHM 53 0,2819 a-d 0,1945 d
13 TAM18 0,2582 c-g 0,1655 e-i
14 TAL 5 0,2207 hi 0,2548 c
15 TAL 1 0,2021 ij 0,2744 bc
16 PTHN 179 0,2868 ab 0,1410 i
17 DXN 146 0,2778 a-e 0,1605 ghi
18 TAM14 0,2775 a-e 0,1633 f-i
19 TAM a9 0,2325 gh 0,1588 ghi
20 PHM 89 0,2333 gh 0,1511 hi
21 PTHN 195 0,2532 efg 0,1696 d-h
22 PTM 164 0,2435 fgh 0,1644 e-i
F ** **
CV% 7,41 8,33
* Như vậy, kết quả ở Bảng 4.8 cho thấy 22/22 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+ và thể hiện hoạt tính nitrogenase khi sống trong dung dịch Burk và nội sinh trong cây. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lăng Ngọc Dậu (2006) khi khảo sát hoạt tính nitrogenase của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa mùa.
4.5.2. Nhận diện gen nifH của 22 dòng vi khuẩn được tuyển chọn
Từ kết quả đo hoạt tính nitrogenase đã tuyển chọn được 22 dòng vi khuẩn có hoạt tính nitrogenase cao nhất và tiến hành nhận diện gen nifH. Kết quả điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR phát hiện gen nifH với cặp mồi PolF và PolR (Hình 4.13) cho thấy: tất cả 22 dòng vi khuẩn đều cho sản phẩm nhân bản gen với vạch DNA có kích thước khoảng 360 bp so với thang chuẩn
M 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18 19 20 21 M 22 23 24 25
360 bp
100 bp plus. Điều này chứng minh rằng cả 22 dòng vi khuẩn này đều có chứa gen nifH (Poly et al., 2001).
A B C D
Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 22 dòng vi khuẩn nội sinh trên gel agarose
Ghi chú: M: Thang chuẩn 100 bp, 1:TAMa9, 2: TAM14, 3: TAM18, 4: SHM53, 5: PHM89, 6:
PTM164, 7: ĐC (không vi khuẩn), 8: TANa5, 9: PHN86, 10: DXN146, 11: PTHN179, 12: PTHN195, 13: TALa14, 14: ĐC, 15: TAL1, 16: TAL4, 17: TAL5, 18: TAL22, 19: TAL30, 20: SHL70, 21:ĐC, 22: PHL87, 23: THL103, 24: THL105, 25: DHL154.