Kết quả khảo sát 457 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+, hòa tan lân và tổng hợp IAA. Hiệu quả tổng hợp của các dòng vi khuẩn biến động theo thời gian với nhiều chiều hướng khác nhau. Một số dòng vi khuẩn tổng hợp NH4+, IAA đạt mức cao nhất vào ngày thứ 2 nhưng lại giảm vào ngày 4, ngày 6 hoặc ngày 8, một số dòng khác thì khả năng tổng hợp NH4+, IAA cao nhất ngày 4 hoặc ngày 6 nhưng giảm ngày 6 hoặc 8. Về hiệu quả hòa tan lân cũng tương tự như vậy, một số dòng có khả năng hòa tan lân khó tan cao nhất vào ngày thứ 5, sau đó lại giảm vào ngày 10, ngày 15 hoặc ngày 20, một số dòng khác hòa tan lân cao vào ngày 10 hoặc ngày 15 sau đó giảm vào ngày 15 hoặc 20. Vì vậy, tiêu chí tuyển chọn là dựa vào giá trị trung bình của hàm lượng NH4+, P2O5 và IAA qua 4 thời điểm khảo sát và trong 3 đặc tính này thì khả năng tổng hợp NH4+ là tiêu chí quan trọng nhất, P2O5 tiêu chí quan trọng thứ hai và IAA là thứ ba để tuyển chọn. Dựa trên tiêu chí này, 90 dòng vi khuẩn được tuyển chọn thể hiện ở Bảng 4.4.
Tất cả 90 dòng vi khuẩn tuyển chọn đều cho kết quả PCR dương tính với mồi p515FPL và p13B có nghĩa chúng là những dòng vi khuẩn nội sinh. Hơn nữa, kết quả giải trình tự vùng gen 16S rDNA của 90 dòng vi khuẩn đều cho tín hiệu tốt với số nucleotide lớn hơn 700 bp (Bảng 4.5). Tất cả các trình tự 16S rDNA của 90 dòng vi khuẩn đã được phân tích và so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ BLAST nucleotid. Kết quả phân tích được so sánh với nhau và xây dựng sơ đồ mối quan hệ di truyền của 90 dòng vi khuẩn được phân lập (Hình 4.10). Theo Rowland và Taber (1996), khi so sánh trình tự chuỗi 16S rDNA với nhau, nếu tỷ lệ tương đồng >
99% có thể kết luận 2 dòng vi khuẩn được so sánh thuộc cùng 1 loài, từ 97% -
99% thì 2 dòng so sánh cùng một chi, nếu mức độ tương đồng < 97% thì 2 dòng được so sánh thuộc về 2 chi khác nhau.
Bảng 4.4. Hàm lượng NH4+, P2O5 và IAA của 90 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường LGI, Nfb và RMR
TT Vi Khuẩn NH4+
(mg/l)
P205
(mg/l)
IAA (àg/ml)
1 PHL 103 6,26 a 108,76 m 16,27 e
2 PHL 105 6,08 b 51,11 ad 9,09 q
3 SHL 70 5,74 c 88,31 s 8,44 r
4 TAL 22 5,54 d 73,81 xy 14,31 gh
5 TAL 30 5,20 e 77,01 w 14,98 f
6 DHL 154 5,04 f 122,67 j 9,94 nop
7 PHN 86 4,97 f 110,40 l 13,91 h
8 TAN a5 4,89 g 207,24 c 17,53 d
9 TAN a7 4,35 h 92,21 q 10,61 m 10 PHL 87 4,08 i 153,91 g 16,03 e 11 TAL 4 3,91 j 275,44 b 12,45 j
12 TAN 18 3,91 j 106,20 n 13,27 i 13 SHM 47 3,89 jk 42,35 a-f 10,28 mno
14 TAM10 3,84 jk 76,67 w 12,13 j 15 PHL 76 3,83 k 124,56 i 7,61 s 16 TALa 14 3,74 l 195,45 d 5,90 t 17 SHM 53 3,72 l 71,71 z 11,36 l 18 DXM 125 3,72 l 65,68 ab 14,61 fg 19 PHN 91 3,72 l 100,39 p 15,79 e 20 TAM18 3,64 m 86,01 t 9,49 pq 21 TAL 5 3,62 mn 176,01 e 9,48 pq 22 TAM4 3,56 no 119,80 k 14,53 fg 23 PHM 106 3,56 no 123,24 ij 10,03 nop 24 TAL 1 3,53 op 371,31 a 10,39 mn 25 PTHN 179 3,53 op 81,02 v 11,97 jk 26 SHN 65 3,52 o-q 44,71 ae 19,04 b 27 DXN 146 3,52 o-q 102,66 o 5,94 t 28 TAM20 3,52 o-q 73,92 xy 10,58 m 29 PHM 104 3,52 o-q 110,59 l 9,55 pq 30 TAM14 3,46 pqr 75,03 x 9,80 op 31 TAM a6 3,45 qr 174,07 f 10,23 mno 32 DHN 151 3,43 rs 90,61 r 18,46 c 33 TAN 19 3,42 rs 105,47 n 19,05 b 34 TAM a9 3,42 rs 85,18 tu 21,12 a 35 TAM a15 3,41 rs 68,77 aa 11,46 kl
TT Vi Khuẩn NH4+
(mg/l)
P205
(mg/l)
IAA (àg/ml) 37 PTHN 195 3,35 st 83,91 u 12,51 j 38 SHIN 83 3,31tu 62,45 ac 10,58 m 39 TAM a14 3,26 u 73,16 yz 17,75 d 40 PTM 164 3,25 u 85,61 t 15,01 f
F ** ** **
CV% 1,2 0,85 2,68
41 DHM 134 3,24 a 128,99 jk 10,97 no 42 DHN 164 3,24 a 83,42 x 4,87 v
43 DXL 41 3,23 ab 102,88 p 5,57 u
44 TAN 15 3,23 ab 94,52 r 12,08 m
45 PHN 90 3,21 a-c 107,75 o 13,82 hi
46 TAL 12 3,21 a-d 58,76 ae 5,32 uv
47 SHL 65 3,19 b-d 81,06 y 10,99 n
48 DXN 147 3,19 b-d 45,72 a-i 12,61 kl
49 DXN 142 3,17 cd 74,86 z 10,45 opq
50 TAM3 3,16 de 65,40 ac 13,30 j
51 SHL 57 3,12 ef 140,75 e 12,92 jk
52 PHM 85 3,11 f 135,50 g 11,03 n
53 DHM 139 3,10 fg 124,80 l 13,32 ij
54 TAM a5 3,09 fg 128,95 jk 3,56 w
55 SHIM 64 3,09 fg 91,36 t 11,10 n
56 PHN 110 3,06 gh 50,07 a-h 5,00 v
57 TAN 26 3,04 hi 108,00 o 17,33 de
58 TAM6 3,04 hi 59,74 a-e 16,58 f
59 PTHL 163 3,03 hi 129,10 j 8,94 r
60 PHN 101 3,03 hi 83,12 x 16,50 f
61 PTHM 159 3,03 hi 69,82 ab 14,99 g
62 THM 74 3,00 ij 28,92 aj 16,95 ef
63 SHN 52 2,98 jk 93,31 s 18,18 c
64 PHM 93 2,97 j-l 87,21 v 12,22 lm
65 THN 113 2,95 k-m 55,99 ag 6,96 t 66 SHIM 60 2,95 k-m 245,11 b 12,86 jk
67 TAL 21 2,94 k-m 89,58 u 5,64 u
68 TAN 22 2,94 k-m 110,94 n 22,90 a
69 PTHL 168 2,93 lm 134,32 h 6,83 t
70 PHN 105 2,92 mn 91,48 t 8,64 r
71 PHM 112 2,87 no 83,30 x 15,15 g 72 TAM2 2,85 op 57,30 af 18,01 c 73 DHL 136 2,84 op 270,90 a 8,67 r
74 PHN 94 2,83 op 93,08 s 9,02 r
TT Vi Khuẩn NH4+
(mg/l)
P205
(mg/l)
IAA (àg/ml) 75 TAN 17 2,83 m 181,69 c 23,33 a 76 THM 78 2,82 p 130,35 i 10,91 nop 77 TAN 6 2,81 p 94,09 rs 17,38 de 78 TAM1 2,75 q 64,72 ac 19,22 b 79 PHN 89 2,73 q 128,05 k 17,67 cd
80 THN 114 2,72 q 50,31 ah 10,47 opq 81 TAN 3 2,72 q 99,46 q 12,61 kl
82 TAM a7 2,60 r 158,84 d 5,78 u 83 TAN 14 2,58 rs 102,70 p 16,67 f
84 TAM11 2,58 rs 62,87 ad 10,67 n-q 85 DXM 116 2,55 st 56,09 ag 14,18 h
86 DXM 126 2,56 r-t 107,58 o 12,42 klm 87 SHIM 65 2,53 tu 116,72 m 10,28 q
88 THM 81 2,50 u 137,58 f 10,43 pq 89 THN 128 2,34 v 72,33 aa 12,72 kl 90 SHN 74 2,23 w 85,17 w 7,92 s
F ** ** **
CV% 1,00 0,63 2,62
* Trong cùng một cột, các số liệu có chữ số theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ ý nghĩa 1% (**).
Bảng 4.5. Mối tương quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn phân lập với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA
Nhóm vi khuẩn
Chiều dài (bp)
Các loài quan hệ Mã số Tương
đồng
Bacilli %
TALa14 760 Bacillus megaterium strain p16_B11 JQ833394 99 PHL105 812 Bacillus megaterium strain p19_A07 JQ834169 99 DHL154 830 Bacillus megaterium strain IARI-K-86 JN411367 99 TANa5 846 Bacillus megaterium strain Y18-04 GU143908 98 SHIM65 866 Bacillus megaterium strain GC61 KF158230 99 DXM126 857 Bacillus megaterium strain ACCC11011 KC768806 99
TAL4 830 Bacillus subtilis strain V90 HQ268534 99
DXL136 860 Bacillus subtilis strain Gr5 KC813165 99
THM60 847 Bacillus subtilis strain M18SP4Q(ii) KC886741 99 PHN 89 860 Bacillus subtilis strain CHP610B JF262038 99
TAMa7 860 Bacillus subtilis strain GHt1-7 GU434357 99
TAM18 849 Bacillus methylotrophicus strain VSD607 KC534272 99 TAN17 900 Bacillus methylotrophicus strain LZ023 JQ023616 99 DHN151 856 Bacillus koreensis strain TSI-2 JN993703 99
TAM4 809 Bacillus cereus strain SCD10 KF476040 99
THM81 820 Bacillus cereus strain p28_F07 JQ835716 97
SHIM64 860 Bacillus aryabhattai strain YN24 KC511542 99 TAN18 835 Bacillus pumilus strain vit bac1 KC845305 98
PHM104 769 Bacillus sp. Y19(2013) KC708569 99
PHM85 720 Bacillus sp. B-23286 AF169504 99
THN114 870 Paenibacillus hunanensis strain Fek21 EU741031 98 THN128 800 Staphylococcus arlettae strain IHB B 8022 KF475813 97 PHN105 856 Exiguobacterium acetylicum strain PNS-30 JQ218452 99 Alphaproteobacteria
SHL70 826 Azospirillum amazonense strain LMG 22237 KC109787 98 Betaproteobacteria
TAN3 860 Acidovorax oryzae strain YNA110 JN700196 99 PTHN195 853 Herbaspirillum rubrisubalbicans strain PPs-3 FJ605419 99 THM78 875 Herbaspirillum huttiense, strain: NBRC 102521 AB681855 99 TAL22 872 Burkholderia kururiensis strain LUC24 AY586518 100 PHL87 850 Burkholderia kururiensis strain PR1 JX083379 99 PHL103 838 Burkholderia vietnamiensis strain RPB3 HQ606073 99 PHN 86 850 Burkholderia vietnamiensis strain NSP-35 JQ743669 99 TAL5 865 Burkholderia pyrrocinia strain A12 JQ283970 99 PHN 91 860 Burkholderia cepacia strain SB335 FJ608711 99 TAM11 869 Mitsuaria chitosanitabida strain R8-376 JQ659937 97 Gammaproteobacteria
TAM14 818 Acinetobacter soli strain MBR4 JX966422 99
TAM10 871 Acinetobacter calcoaceticus strain B40 JX010982 98 SHN65 779 Acinetobacter. sp. U1369-101122-SW178-2 JQ082154 97
TAMa9 805 Acinetobacter sp. 1064 KC236451 99
SHIN83 802 Pantoea ananatis strain 3Pe76 EF178449 99
PHL 76 862 Pantoea ananatis strain LN-4 GU937431 99
PHN90 862 Pantoea ananatis strain LN-1 GU937430 99
PTHL 168 849 Pantoea ananatis strain O-2-2 GU324770 98 TAN14 860 Pantoea cypripedii strain Dc-08 KC153127 99 PHM93 720 Pantoea agglomerans strain T224 KC764985 99 TAL30 792 Pantoea agglomerans strain BJCP3 HM130694 99
TANa7 855 Pantoea agglomerans strain M20 JN979985 99
THM74b 859 Pantoea calida strain 1400/07 GQ367478 99 DXL41 860 Pantoea anthophila strain L7-748 JQ659455 99
PHN110 850 Pantoea sp. B2011 JX266366 98
SHN74 856 Pseudomonas geniculata strain JS3 JX042459 99 TAL1 853 Pseudomonas putida strain C-S-TSA6 HM755575 99 TAMa15 870 Pseudomonas hibiscicola strain R4-722 JQ659712 99 TAMa6 865 Pseudomonas hibiscicola strain R4-790 JQ659719 98
TAN22 869 Pseudomonas sp. ZR3 JQ433923 99
PHN101 856 Klebsiella pneumoniae strain R3 KC990817 99
TAM1 800 Klebsiella pneumoniae strain U6 KC434997 98
TAMa14 870 Klebsiella oxytoca strain AIMST 10.Pl.3 HQ683968 99
PHM112 853 Klebsiella sp. A712 JF946802 99
DXN146 856 Enterobacter cloacae strain GAQ39 JX827464 99 TAL12 860 Enterobacter cloacae strain ENTCLO KC660137 98 TAL21 871 Enterobacter cloacae strain BM0285 JQ680728 99 TAMa5 844 Enterobacter cancerogenus strain TY-1 KC210856 98 DXM125 856 E. cancerogenus strain 46 (C2P1) KF254599 99
THN113 788 E. cancerogenus, strain: NMB8-2 AB776824 99 SHM47 749 Enterobacter aerogenes strain p62_A05 JQ829356 99 DXN142 889 Enterobacter aerogenes strain gx-32 FJ823005 99 PTHM159 854 Enterobacter aerogenes strain gx-32 FJ823005 99 SHN52 720 Enterobacter aerogenes strain DCH-2 KC166865 99 TAM2 720 Enterobacter hormaechei strain RB12 KC431790 99 DXM116 850 Enterobacter sacchari strain SP1 JQ001784 99 PTHL 163 860 Enterobacter ludwigii strain NS111 KC312156 99
PHN 94 860 Enterobacter sp. A5C HQ179967 99
SHL65 860 Enterobacter sp. 1FTM7 KC342873 99
SHL 57 855 Enterobacter sp. b49 JN975210 99
TAN15 872 Enterobacter sp. YR2-2 JQ229706 98
TAN26 871 Enterobacter sp. isolate CCM6B FN433019 99
DHM139 876 Stenotrophomonas maltophilia strain L1 KF358247 99 SHM53 856 Stenotrophomonas maltophilia strain TWNG12 KF312295 99 TAN6 889 Stenotrophomonas maltophilia strain G8 KC136825 99
TAM6 851 Erwinia soli strain AR_PINLTS1 HM582880 99
TAN19 849 Erwinia soli strain AR_PINLTS1 HM582880 98 DXN147 850 Aeromonas enteropelogenes strain RS113 KC122705 98 Bacteroidetes
PTHN179 856 Sphingomonas sanguinis strain L3-149 JQ659330 98 PTHM164 850 Sphingomonas sanguinis strain L3-149 JQ659330 99 ĐHN164 864 Chryseobacterium indologenes strain N6 KC189901 99 TAM3 813 Chryseobacterium gleum strain AOLR31 GQ916521 98 TAM20 846 Chryseobacterium. kwangyangense strain Cb EU169201 99 ĐHM134 850 Chryseo. indologenes strain ZYF120413-7 KF017580 99
Bacilli, 27.78%
Alphaproteobacteria, 1.11%
Betaproteobacteria, 11.11%
Gammaproteobacteria, 53.33%
Bacteroidetes, 6.67%
Hình 4.10. Đa dạng về loài của 90 dòng vi khuẩn nội sinh
Kết quả Hình 4.10 cho thấy, 180 dòng vi khuẩn (bao gồm 90 dòng vi khuẩn phân lập và 90 dòng vi khuẩn đồng hình) trong sơ đồ quan hệ di truyền rất đa dạng về loài thuộc 5 nhóm khác nhau, phần lớn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm chiếm ưu thế với 72,22% bao gồm 4 nhóm Alphaproteobacteria (chiếm 1,11%), Betaproteobacteria (chiếm 11,11%) Gammaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 53,33%) và Bacteroides (chiếm 6,67%) và Bacilli (chiếm 27,78%) thuộc vi khuẩn Gram dương (Hình 4.10), kết quả này cho thấy tỉ lệ vi khuẩn Gram âm chiếm ưu thế trong nhóm vi khuẩn nội sinh trong cây lúa nói riêng
và cây hòa bản nói chung, phù hợp với các kết quả của Olivares et al., (1996), Reinhold-Hurek và Hurek (1998), Prakambang et al., (2009).
Phân tích mối quan hệ di truyền thông qua cây phả hệ (phylogenetic tree) của 90 dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên với 90 dòng vi khuẩn có trên ngân hàng NCBI cho thấy chúng được phân bố như Hình 4.11.
Hình 4.11.A được chia thành 2 nhánh lớn: nhánh A và B, trong nhánh A gồm 23 dòng vi khuẩn và được chia thành 2 nhánh A1 và A2. Nhánh A1 gồm 22 dòng vi khuẩn được chia thành 2 nhánh nhỏ A1.1 và A1.2. Nhánh A1.1 gồm 11 dòng vi khuẩn được phân lập từ các huyện lân cận nằm ở phía tây và phía bắc tỉnh Phú Yên bao gồm Đồng Xuân, Tuy An, Sông Hinh, Tây Hòa và Phú Hòa có mối quan hệ di truyền với các loài Bacillus subtilis, B.
methylotrophicus, B. pumilus và B. cereus. Nhóm A.1.2 gồm 11 dòng vi khuẩn được phân lập từ huyện Đồng Xuân, Tuy An, Sông Hinh, Phú Hòa và Đông Hòa có mối quan hệ di truyền chủ yếu thuộc loài B. megaterium. Nhánh A2 chỉ có 1 dòng và có mối quan hệ di truyền với loài Staphylococus arlettae với hệ số Bootstrap là 100. Nhánh B gồm có 2 dòng, trong đó PHN105 có mối quan hệ di truyền với loài Exigubacterium acetylicum và THN114 có mối quan hệ di truyền với loài Paenibacillus hunanensis với hệ số Bootstrap là 100.
A
B A1
A2 A1.1.
A1.2
DXL136
GU434357 Bacillus subtilis strain GHt1-7 JF262038 Bacillus subtilis strain CHP610B PHN89
JQ023616 Bacillus methylotrophicus strain LZ023 TAN17
KC886741 Bacillus subtilis strain M18SP4Q(ii) SHIM60
KC534272 Bacillus methylotrophicus strain VSD607 KC813165 Bacillus subtilis strain Gr5
TAL4 TAM18
HQ268534 Bacillus subtilis strain V90 TAMa7
KC845305 Bacillus pumilus strain vit bac1 KM226929 Bacillus pumilus strain PPL-SC14
TAN18
PHM85 AF169504 Bacillus sp. B-23286 KJ733983 Bacillus sp. KT82
KF476040 Bacillus cereus strain SCD10 TAM4
THM81
JQ835716 Bacillus cereus strain p28_F07 PHM89
PHM104 PHM106
KF535131 Bacillus nealsonii strain BAB-2836 KF032671 Bacillus nealsonii strain EkC3-4 KC708569 Bacillus sp. Y19(2013)
DHN151
JN993703 Bacillus koreensis strain TSI-2
KC768806 Bacillus megaterium strain ACCC11011 KC511542 Bacillus aryabhattai strain YN24 KF158230 Bacillus megaterium strain GC61 GU143908 Bacillus megaterium strain Y18-04 JQ834169 Bacillus megaterium strain p19_A07
TALa14
JQ833394 Bacillus megaterium strain p16_B11 SHIM64
TANa5 SHIM65
JN411367 Bacillus megaterium strain IARI-K-86 PHL105
DHL154 DXM126 THN128
KF475813 Staphylococcus arlettae strain IHB B 8022 PHN105
JQ218452 Exiguobacterium acetylicum strain PNS-30 THN114
EU741031 Paenibacillus hunanensis strain Fek21
Hình 4.11.A. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacilli có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào
trình tự 16S rDNA.
A
B
PHL103
HQ606073_Burkholderia_vietnamiensis_strain_RPB3 JQ743669_Burkholderia_vietnamiensis_strain_NSP-35 AB681855_Herbaspirillum_huttiense_strain:_NBRC_102521
TAN3 THM78
JN700196_Acidovorax_oryzae_strain_YNA110 JX083379_Burkholderia_kururiensis_strain_PR1
JQ659937_Mitsuaria_chitosanitabida_strain_R8-376 TAL22
FJ608711_Burkholderia_cepacia_strain_SB335 PTHN195
FJ605419_Herbaspirillum_rubrisubalbicans_strain_PPs-3 AY586518_Burkholderia_kururiensis_strain_LUC24
TAM11
PHN91 PHL87
JQ283970_Burkholderia_pyrrocinia_strain_A12 TAL5
PHN86
Hình 4.11.B. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Betaproteobacteria có trong ngân hàng gen
(NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA.
Hình 4.11.B cho thấy có 2 nhánh: nhánh A gồm 5 dòng vi khuẩn được phân lập từ các huyện Tuy An, Phú Hòa, Tây Hòa và thành phố Tuy Hòa và có mối quan hệ di truyền với nhiều loài: Burkholderia vietnamiensis, B.
kururiensis, B. cepacia, loài Herbaspirillum huttiense, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Acidovorax oryzae và Mitsuaria chitosanitabida. Nhánh B gồm 5 dòng vi khuẩn thuộc chi Burkholderia.
Kết quả ở Hình 4.11.C cho thấy 18 dòng vi khuẩn được phân lập từ huyện lân cận Đồng Xuân, Tuy An, Sơn Hòa, Phú Hòa, Tây Hòa và thành phố Tuy Hòa đều có mối quan hệ di truyền với chi Enterobacter thuộc nhiều loài khác nhau như Enterobacte cancerogenus, E. hormaechei, E. aerogenes, E.
ludwigii, E. cloacae và E. sacchari.
TAMa5
KC210856 Enterobacter cancerogenus strain TY-1 KC342873 Enterobacter sp. 1FTM7
HQ179967 Enterobacter sp. A5C
KF254599 Enterobacter cancerogenus strain 46 (C2P1) DXM125
TAM2
KC431790 Enterobacter hormaechei strain RB12 PHN94
SHL65 THN113
JQ829356 Enterobacter aerogenes strain p62 A05 SHM47
PTHL163
KC312156 Enterobacter ludwigii strain NS111 JQ680728 Enterobacter cloacae strain BM0285 TAL21
JX827464 Enterobacter cloacae strain GAQ39 AB776824 Enterobacter cancerogenus strain: NMB8-2
SHL57
JN975210 Enterobacter sp. b49 DXN146
DXN142 SHN52
KC166865 Enterobacter aerogenes strain DCH-2 PTHM159
FJ823005 Enterobacter aerogenes strain gx-32 FJ823005 Enterobacter aerogenes strain gx-32(2) TAL12
KC660137 Enterobacter cloacae strain ENTCLO DXM116
JQ001784 Enterobacter sacchari strain SP1 TAN15
JQ229706 Enterobacter sp. YR2-2 TAN26
FN433019 Enterobacter sp. isolate CCM6B
Hình 4.11.C. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng thuộc chi Enterobacter có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình
tự 16S rDNA.
A
B A2
THM74
GQ367478 Pantoea calida strain 1400/07 PTHL168
GU324770 Pantoea ananatis strain O-2-2 SHIN83
EF178449 Pantoea ananatis strain 3Pe76 PHN110
JX266366 Pantoea sp. B2011 PHL76
GU937431 Pantoea ananatis strain LN-4 PHN90
GU937430 Pantoea ananatis strain LN-1 TAN14
KC153127 Pantoea cypripedii strain Dc-08 PHM93
KC764985 Pantoea agglomerans strain T224 TANa7
JN979985 Pantoea agglomerans strain M20 DXL41
JQ659455 Pantoea anthophila strain L7-748 TAL30
HM130694 Pantoea agglomerans strain BJCP3 TAMa15
JQ659712 Pseudomonas hibiscicola strain R4-722 JX042459 Pseudomonas geniculata strain JS3
TAMa6
JQ659719 Pseudomonas hibiscicola strain R4-790 TAL1
HM755575 Pseudomonas putida strain C-S-TSA6 SHN74
TAN22
JQ433923 Pseudomonas sp. ZR3
Hình 4.11.D. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc chi Pantoea và Pseudomonas có trong ngân hàng gen
(NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA.
Sơ đồ Hình 4.11.D cho thấy có 2 nhánh lớn A và B, nhánh A gồm 12 dòng và chia thành 2 nhánh nhỏ A1 và A2. Nhánh A1 gồm có 11 dòng vi khuẩn được phân lập từ 5 huyện lân cận với nhau, chủ yếu là các huyện miền núi bao gồm Đồng Xuân, Tuy An, Phú Hòa, Sông Hinh và Tây Hòa, tất cả các dòng vi khuẩn này có mối quan hệ di truyền với chi Pantoea thuộc nhiều loài khác nhau. Nhánh A2 chỉ có một loài TAMa15 có mối quan hệ với loài Pseudomonas hihiscicola với chỉ số Bootstrap là 99. Nhánh B gồm có 4 dòng được phân lập từ 2 huyện Tuy An và Sơn Hòa, cả 4 dòng đều có mối quan hệ di truyền với chi Pseudomonas.
A1
A
B
TAM14
JX966422 Acinetobacter soli strain MBR4 SHN65
JQ082154 Acinetobacter sp. U1369-101122-SW178-2 KC236451 Acinetobacter sp. 1064
TAMa9 SHM53
KF312295 Stenotrophomonas maltophilia strain TWNG12 KF358247 Stenotrophomonas maltophilia strain L1 KC136825 Stenotrophomonas maltophilia strain G8 DHM139
TAN6 DXN147
KC122705 Aeromonas enteropelogenes strain RS113 TAN19
TAM6
HM582880 Erwinia soli strain AR PINLTS1 TAM1
KC434997 Klebsiella pneumoniae strain U6 PHN101
KC990817 Klebsiella pseumoniae strain R3 PHM112
JF946802 Klebsiella sp. A712 TAMa14
HQ683968 Klebsiella oxytoca strain AIMST 10.Pl.3 TAM10
JX010982 Acinetobacter calcoaceticus strain B40
Hình 4.11.E. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc các chi Acinetobacter, Stenotrophomonas, Aeromonas, Erwinia và Klebsiella có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào
trình tự 16S rDNA.
Sơ đồ Hình 4.11.E có 2 nhánh A và B, nhánh A gồm 12 dòng vi khuẩn được phân lập từ 5 huyện như Đồng Xuân, Tuy An, Sơn Hòa, Đông Hòa và Phú Hòa đã có mối quan hệ di truyền với nhiều loài như Acinetobacter soil strain MBR4, Stenotrophomonas maltophilia, Aeromonas enteropelogenes, Erwinia soil strain AR, Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca. Kết quả đã cho thấy chỉ có 12 dòng vi khuẩn đã có mối quan hệ với nhiều loài. Điều này chứng minh sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh cây lúa ở tỉnh Phú Yên.
Nhánh B chỉ có 2 dòng vi khuẩn phân lập từ huyện Tuy An và có mối quan hệ
A
B
DHN164 PTHN179 TAM20
TAM3
GQ916521_Chryseobacterium_gleum_strain_AOLR31 KF017580_Chryseobacterium_indologenes_strain_ZYF120413-7
EU169201_Chryseobacterium_kwangyangense_strain_Cb DHM134
PTHM164
JQ659330_Sphingomonas_sanguinis_strain_L3-149
KC189901_Chryseobacterium_indologenes_strain_N6 JQ659330_Sphingomonas_sanguinis_strain_L3-149(2)
Hình 4.11.F. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacteroides có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào
trình tự 16S rDNA.
Kết quả sơ đồ Hình 4.11.F gồm 2 nhánh, nhánh A có 4 dòng phân lập từ 3 huyện Tuy An, Đông Hòa và thành phố Tuy Hòa có mối quan hệ di truyền với 2 loài Chryseobacterium gleum và Chryseobacterium indologenes. Nhánh B gồm 2 dòng và có mối quan hệ di truyền với loài Chryseobacterium kwangyangenes, Chryseobacterium indologenes và Sphingomonas sanguinis.
* Như vậy, các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa được phân lập từ các vùng trồng lúa trong tỉnh Phú Yên thể hiện sự đa dạng khá cao. Trong số 90 dòng đã có đến 48 dòng vi khuẩn có mối quan hệ di truyền gần với các loài thuộc chi Enterobacter và Pantoea xếp trong nhóm Gammaproteobacteria, 25 dòng có mối quan hệ di truyền gần với các loài thuộc chi Bacillus trong nhóm Bacilli và một số dòng thuộc nhóm Betaproteobacteria, Bacteroidetes và Alphaproteobacteria với các chi như Azospirillum, Sphingomonas, Pseudomonas, Klebsiella, … Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu của Mano và Morisaki (2008) về vi khuẩn nội sinh cây lúa.
Ngoài sự đa dạng về loài, sự đa dạng của các trình tự nucleotide cũng được phân tích bằng phần mềm DNASP 5.10 và được thể hiện ở Bảng 4.6.
Theo kết quả nghiên cứu của Truong Trong Ngon et al., (2012), chỉ số Pi (π) và Theta (θ) càng cao thì độ đa dạng trình tự chuỗi nucleotide trong chuỗi haplotype càng cao và chỉ số θ được gọi là cao khi θ >100, chỉ số Pi (π) cao khi π > 0,5 (Yongle et al., 2011). Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn thuộc 9 chi và 4 nhóm trong Bảng 4.6 đều có chỉ số Pi ≥ 0,66623 và theta ≥ 171,451 chứng tỏ rằng sự đa dạng trong trình tự chuỗi nucleotide của các dòng vi khuẩn nội sinh trong chuỗi haplotype là khá cao.
Bảng 4.6. Sự đa dạng của trình tự nucleotide được phân tích trong phần mềm DNASP 5.10
STT Chi vi khuẩn Số dòng Chỉ số
Pi Theta
1 Acinetobacter 4 0,66623 397,091 ± 216,595
2 Bacillus 22 0,71958 171,451 ± 47,033
3 Burkhoderia 6 0,69996 366,131 ± 160,350
4 Chryseobacterium 4 0,75318 438,000 ± 238,909
5 Enterobacter 18 0,71459 185,489 ± 53,928
6 Klebsiella 4 0,73996 416,182 ± 227,008
7 Pantoea 11 0,70470 244,796 ± 83,578
8 Pseudomonas 5 0,67562 360,960 ± 173,261
9 Stenotrophomonas 3 0,74182 532,667 ± 355,111
Nhóm vi khuẩn
1 Bacilli 25 0,72294 165,521 ± 43,835
2 Betaproteobacteria 10 0,71534 265,468 ± 93,839
3 Grammaproteobacteria 48 0,71811 143,309 ± 32,292
4 Bacteroidetes 6 0,73506 355,182 ± 155,554
Kết quả so sánh trình tự chuỗi nucleotide của các dòng vi khuẩn ở Phụ lục 4.3 cho thấy, khi so sánh chuỗi nucleotide có độ dài từ 250 - 613 bp thì các dòng vi khuẩn trong cùng một loài ở hầu hết các nhóm vi khuẩn có tính tương đồng rất cao. Tuy nhiên, một số dòng vi khuẩn thuộc cùng một loài nhưng vẫn có sự khác biệt về trình tự nucleotide.
- Trong chi Bacillus có 2 dòng Bacillus cereus: B. cereus TAM4 và B.
cereus THM81 trình tự nucleotide khác biệt ở 3 vị trí 510, 511 và 636 trong đoạn so sánh.
- Trong chi Enterobacter: có 4 dòng Enterobacter aerogenes khác nhau 6 vị trí nucleotide, 2 dòng Enterobacter cancerogenus TAMa5 và Enterobacter cancerogenus THN113 khác nhau 3 vị trí nucleotide, tương tự như vậy 3 dòng Enterobacter cloacae cũng khác biệt ở 4 vị trí 322, 348, 480 và 512.
- Trong chi Pantoea: có 3 dòng Pantoea agglomerans có trình tự chuỗi nucleotide khác biệt ở 13 vị trí, 4 dòng Pantoea ananatis có độ tương đồng rất cao chỉ có dòng Pantoea ananatis PTHL 168 khác với 3 dòng còn lại ở 1 nucleotide tại ví trí 626.
- Trong chi Burkhoderia có 2 dòng Burkhoderia vietnamiensis PHL103