CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu
+ Mẫu lúa thu từ 7 huyện và thành phố Tuy Hòa tỉnh Phú Yên.
+ Lúa giống: giống lúa Ma Lâm 213 đang được trồng phổ biến ở tỉnh Phú Yên.
Giống lúa Ma Lâm 213 (ML 213) được sử dụng có nguồn gốc từ Trại giống lúa Ma Lâm tỉnh Bình Thuận từ vụ Đông Xuân năm 2006 - 2007. Qua thời gian khảo nghiệm năng suất và các đặc tính thích nghi cho thấy giống lúa này có nhiều ưu điểm. Thời gian sinh trưởng ngắn, trong vụ Đông Xuân với thời gian từ 105 - 110 ngày, vụ Hè Thu từ 98 - 100 ngày. Chiều cao cây dao động từ 90 - 115 cm, chống đổ tốt, khả năng đẻ nhánh rất mạnh, dạng hạt dài, năng suất trung bình: 7,0 - 8,5/tấn/ha/vụ (Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Phú Yên, 2010).
+ Phân bón hóa học được sử dụng là phân đơn: urea (46% N), lân Văn Điển (16% P2O5) và clorua kali (60% K2O).
+ Nhà lưới Khoa Nông Nghiệp - trường Đại học Phú Yên, ruộng trồng lúa ở phường Phú Thạnh, ở huyện Đông Hòa và huyện Tuy An.
3.1.2. Dụng cụ
Ống nghiệm 10 ml; 50 ml, ống falcon 50 ml, đĩa petri, bình tam giác, ống đong, bộ micropipet Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 (Đức), đầu col vàng;
xanh; trắng, lamme, lammen, que cấy, đèn cồn, bọc nylon, thước đo, chậu đất, và một số dụng cụ khác, …
3.1.3. Thiết bị
Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức), tủ cấy vi sinh vật Esco Class II BSC (Pháp), tủ ủ vi sinh vật Binder Incubator (Mỹ), tủ lạnh trữ mẫu Hitsuji HI318HBB (Nhật), cân điện tử Shimadzu (Nhật), máy ly tâm Eppendorf Concentrator - 5310 (Đức), quang phổ kế (đo OD) Thermo Scientific - Genesys 10-s (Mỹ), máy vortex IKA - SA 07H1724 (Mỹ), máy lắc mẫu New brunswick Scientific Excella E24 - MI352-0002 (Mỹ), máy khuấy từ, tủ sấy EHRET (Đức), kính hiển vi quang học Olympus CHT (Nhật), máy đo pH kế Cyber Scan pH510-EC-PH5-TEMB01P (Mỹ), máy PCR Biorad - C1000 Thermal cycler (Mỹ), bộ điện di 1 chiều 90V Biorad SGE-014-02 (Mỹ), hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Mỹ), máy sục khí - Aco-006
3.1.4. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn
* Hóa chất phân lập, nuôi cấy và khảo sát các đặc tính vi khuẩn + Hóa chất dùng để khử trùng mẫu rễ, thân của cây lúa
Cồn 96%, hypochloride natri 1%, nước oxi già 3%, nước cất vô trùng.
+ Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh
Hóa chất trong môi trường phân lập vi khuẩn LGI (Lacto-gluco infusion) (Cavalcante và Dửbereiner, 1988).
Bảng 3.1. Công thức môi trường LGI
Hóa chất Nồng độ
Sucrose KH2PO4
K2HPO4
MgSO4. 7H2O CaCl2
FeCl3
Na2MoO4.2H2O
Bromothymol blue 0,5%
trong KOH 0,2N Agar
10,0 g/l 0,6 g/l 0,2 g/l 0,2 g/l 0,02 g/l 0,01 g/l 0,002 g/l
5 ml/1
Môi trường đặc 18 g/l, môi trường bán đặc 1,8 g/l
pH 5,5
Hóa chất trong môi trường Nfb (Nitro - free bromothymol blue) (Krieg và Dửbereiner, 1984).
Bảng 3.2. Công thức môi trường Nfb
Hóa chất Nồng độ Malic acid
K2HPO4
MgSO4. 7H2O CaCl2
NaCl KOH
FeEDTA (1,64%)
Dung dịch nguyên tố vi lượng(a) Dung dịch vitamin(b)
Bromothymol blue 0,5% trong KOH 0,2N
Agar
5 g/l 0,5 g/l 0,2 g/l 0,02 g/l 0,1 g/l 4,5 g/l 4 ml/l 2 ml/l 1 ml/l 2 ml/1
Môi trường đặc 18 g/l, môi trường bán đặc 1,8 g/l pH 6,8
(a) Dung dịch nguyên tố vi lượng gồm: 0,4 g/l CuSO4; 0,12 g/l ZnSO4.7H2O; 1,4 g/l H3BO3; 1,5 g/l MnSO4.H2O và 1g/l Na2MoO4.2H2O
(b) Dung dịch vitamin gồm: 1 mg/l biotin (vitamin H) và 2 mg/l pyridoxine-HCl (Nhãn hiệu:
Merck)
+ Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường RMR đặc và bán đặc
M ôi trường RMR (Rennie medium supplemented with rice extract and malate) đặc và bán đặc (1/10 lượng agar so với môi trường đặc) gồm có dung dịch A và dung dịch B được khử trùng riêng (Elbeltagy et al., 2001).
- Dung dịch A gồm các thành phần như sau:
K2HPO4 0,8 g KH2PO4 0,2 g
NaCl 0,1 g
Na2FeEDTA 28 mg
Na2MoO4.2H2O 25 mg
Yeast extract 100 mg
Mannitol 3 g Sucrose 5 g
Sodium lactate 60% 0,5 ml
Malic acid 2 g
Agar Agar 18 g cho môi trường đặc hoặc 1,8 g cho môi trường bán đặc Nước cất 900 ml
pH = 7,0
- Dung dịch B gồm các thành phần sau:
MgSO4.7H2O 0,2 g CaCl2.2H2O 0,06 g Nước cất 100 ml
Các dung dịch A và B sau khi khử trùng riêng lẻ được phối trộn lại với nhau và bổ sung thêm 5 μg/l biotin, 1,25 ml dịch trích chồi lúa với ethanol và 1,25 ml dịch trích chồi lúa với nước cất được khử trùng qua lọc.
+ Hóa chất dùng để xác định khả năng cố định đạm thông qua việc đo lượng ammonium hình thành:
- Hóa chất đo ammonium hình thành:
Phenol - Nitroprusside: hòa tan 7 g phenol và 34 mg sodium Nitroprusside trong nước cất cho đủ 100 ml.
Buffered hypochloride: 1,480 g NaOH hòa với 70 ml nước, bổ sung 4,98 g Na2HPO4, 20 ml NaOCl và cuối cùng bổ sung nước cất cho đủ 100 ml.
EDTA: hòa 6 g EDTA muối dinatri trong 100 ml nước, điều chỉnh pH = 7 (Page et al., 1982).
- Môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005)
Bảng 3.3. Công thức môi trường Burk không đạm Hóa chất Nồng độ Sucrose 10 (g/l) KH2PO4 0,41 (g/l) K2HPO4 0,52 (g/l) Na2SO4 0,05 (g/l) CaCl2 0,2 (g/l) MgSO4. 7H2O 0,1 (g/l) FeSO4.7H2O 0,005 (g/l) Na2MoO4.2H2O 0,0025 (g/l)
Agar môi trường đặc 18g/l, môi trường bán đặc 1,8g/l pH 7,0
+ Hóa chất đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan và đo lượng PO4- - Môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)
Bảng 3.4. Công thức môi trường NBRIP lỏng (Nautiyal, 1999) Hóa chất Nồng độ
Sucrose 10,0 (g/l) Apatit 5,0 (g/l) MgCl2.6H2O 5,0 (g/l) MgSO4.7H2O 0,25 (g/l) KCl 0,2 (g/l) (NH4)2SO4 0,1 (g/l) pH 7,0 - Hóa chất đo lượng PO43- (Murphy và Riley, 1962).
Dung dịch A:
(1) 12 g (NH4)6MoO24.4H2O + 250 ml H2O (2) 0,2908 g KsbOC4H2O6 + 100 ml H2O
(3) Đong 140 ml H2SO4 đậm đặc + H2O đủ 1 lít (4) Cho (1) và (2) vào (3) sau đó thêm H2O đủ 2 lít
Dung dịch B: 1,05 g acid ascorbic + 200 ml dung dịch A (Nhãn hiệu:
Merck)
+ Hóa chất đo IAA với thuốc thử Salkowsky (Glickmann và Desseaux, 1995) Thêm 553 ml H2SO4 vào nước cất cho đủ 1 lít, để nguội được dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8 M. Cân 4,5 g FeCl3. 6H2O và bổ sung dung dịch H2SO4
đậm đặc 10,8 M vào rồi khuấy cho FeCl3 tan đều. Bảo quản trong chai sậm màu và đặt trong tối.
+ Hóa chất trong dung dịch khoáng trồng lúa Yoshida (Yoshida, 1978) Bảng 3.5. Công thức của môi trường dinh dưỡng Yoshida (Yoshida, 1978)
Hóa chất Nồng độ
NH4NO3
NaH2PO4.2H2O K2SO4
CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O MnCl2.4H2O
(NH4)6Mo7O24.2H2O H3BO4
ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O FeCl2.6H2O
40 (mg/l) 10 (mg/l) 40 (mg/l) 40 (mg/l) 40 (mg/l) 0,5 (mg/l) 0,005 (mg/l) 0,2 (mg/l) 0,01 (mg/l) 0,01 (mg/l) 2 (mg/l)
+ Hóa chất dùng để tinh sạch DNA của vi khuẩn
TE (pH=8), SDS 10%, Isopropanol, ethanol 70%, CTAB 10%/ NaCl 0,7 M, protein K (10 mg/ml), nước cất hai lần vô trùng, chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1), dung dịch TE (gồm 1% triton X - 100; 1 M Tris HCl – (pH= 8,5); 0,5 M EDTA - (pH=8,0), nước cất vô trùng).
+ Hóa chất dùng để thực hiện PCR và điện di sản phẩm PCR
- Taq buffer, Taq DNA polymerase, DNA vi khuẩn đã phân lập, nước cất hai lần vô trùng, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP và dCTP)
- Các cặp mồi để nhận diện vi khuẩn nội sinh (Zinniel et al., 2002) Mồi xuôi: p515FPL 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’
Mồi ngược: p13B 5’-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’
- Các cặp mồi để nhận diện gen nifH:
PolF 5’ TGCGAYCCSAARGCBGACTC 3’ và
PolR 5’ ATCGCCATCATYTCRCCGGA 3’ để khuyếch đại gen nif theo quy trình của Poly et al., (2001).
- Agarose 1,5%, TAE buffer, Loading buffer, Thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo scientific - Fermentas và Bio Basic Inc - Canada), Ethidium bromide (EtBr).
+ Hóa chất phân tích đạm tổng số bằng phương pháp Micro-Kjeldahl:
H2SO4 đậm đặc, NaOH 10 N, hỗn hợp chất xúc tác (K2SO4: CuSO4: Se theo tỉ lệ 100:10:1).