Tóm tắt nội dung luận án Đề tài “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” đã được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao để ứng dụng sản xuất phân sinh học bón cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên trong tương lai. Năm trăm chín mươi ba dòng vi khuẩn được phân lập từ cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên. Trong 3 loại môi trường phân lập, các dòng vi khuẩn có màu sắc khác nhau: vàng nhạt, vàng đậm, trắng đục và trắng trong. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên và nhô, hầu hết các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình que, Gram âm. Bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi p515FPL và p13B đã xác định được 556 dòng vi khuẩn là nội sinh cây lúa. Các dòng vi khuẩn này được nuôi trong môi trường Burk không đạm, môi trường NBRIP hoặc trên môi trường phân lập và xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan bằng phương pháp so màu. Kết quả cho thấy có 533 dòng có khả năng cố định đạm, trong số đó 457 dòng có khả năng hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA. Chín mươi dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm khá cao được định danh bằng kỹ thuật PCR và xác định mối quan hệ di truyền với 90 dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen. Dựa vào trình tự gen 16S rDNA có mức tương đồng 97% trở lên cho thấy các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa phân lập được có sự đa dạng về loài. Bao gồm 5 nhóm: Alphaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 1,11%), Betaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 11,11%), Gammaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 53,33%), Bacteroidetes (chiếm tỉ lệ 6,67%) và Bacilli (chiếm 27,78%). Trong số 90 dòng vi khuẩn có hoạt tính sinh học cao đã chọn được 22 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm và hòa tan lân khó tan cung cấp cho cây lúa được trồng trong ống nghiệm. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân cung cấp cho cây lúa được trồng trong điều kiện nhà lưới thì có 822 dòng vi khuẩn có khả năng giúp giảm lượng phân đạm vô cơ cung cấp từ 25% – 75% N (tương đương với 30 kg N – 90 kg Nha) và 48 dòng khảo sát có khả năng làm giảm lượng lân vô cơ cung cấp là 50% P (tương đương với 40 kg P2O5ha) cho cây lúa. Trong thí nghiệm ngoài đồng tại 2 địa điểm khác nhau trên nền đất thịt pha cát tại tỉnh Phú Yên đã tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với loài Azospirillum amazonense) và dòng PHL87 (tương đồng 99% Burkholderia kururiensis) có khả năng cung cấp 50% lượng đạm sinh học (tương đương 60 kg Nha) cho cây lúa và 2 dòng vi khuẩn TAL1 (tương đồng 99% loài Pseudomonas putida) và TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) có khả năng hòa tan lân khó tan thành dễ tan để đáp ứng nhu cầu sinh trưởng và phát triển cho cây lúa và đã tiết kiệm được 50% lượng phân lân vô cơ (tương đương 40 kg P2O5ha) nhưng vẫn đảm bảo về năng suất, cải thiện chất lượng gạo. Kết quả bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 lên cây lúa trồng ở 2 địa điểm khác nhau tại Phú Yên đều cho hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan cao hơn khi bổ sung riêng rẽ từng dòng cho cây lúa. Sự kết hợp 2 dòng SHL70 và TAL4 giúp giảm 50% N (tương đương 60 kg Nha) và 50% P (tương đương 40 kg P2O5ha) trong sản xuất lúa mà vẫn đảm bảo được năng suất lúa tốt. Ứng dụng 2 dòng vi khuẩn này trong sản xuất lúa có thể là một trong những giải pháp để hạn chế việc sử dụng phân bón hóa học trong sản xuất nông nghiệp, góp phần bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp phát triển bền vững. Từ khóa: Cố định đạm, hòa tan lân, lúa cao sản, Phú Yên, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh. 2. Những kết quả mới của luận án Đề tài đã phân lập và khảo sát các đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên, đồng thời các dòng vi khuẩn nội sinh này được nhận diện bằng kỹ thuật PCR. Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại dựa vào đoạn gen 16S rDNA đã định danh, xác định mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn đã phân lập và phân tích sự đa dạng về loài của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên ở mức độ nucleotide. Tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với loài Azospirillum amazonense) và dòng PHL87 (tương đồng 99% Burkholderia kururiensis) có khả năng cung cấp 50% lượng đạm sinh học (60 kg Nha) cho cây lúa và 2 dòng vi khuẩn TAL1 (tương đồng 99% loài Pseudomonas putida) và TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) có khả năng hòa tan lân khó tan từ các thí nghiệm in vitro, nhà lưới và ngoài đồng. 3. Các ứng dụng khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu: Sử dụng các dòng vi khuẩn có đặc tính tốt (2 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và 2 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan phân lân khó tan thành lân dễ tan cung cấp cho cây lúa) để cho việc nghiên cứu và sản xuất phân vi sinh dùng trong sản xuất lúa tại Phú Yên. Kết quả đề tài cũng góp phần làm giảm lượng phân bón hóa học, giảm giá thành sản xuất, tăng thu nhập, bảo vệ độ phì đất trong sản xuất lúa và giảm sự ô nhiễm môi trường. Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể là tài liệu tham khảo và là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo, cũng như bổ sung giáo trình giảng dạy tại Đại học Phú Yên và toàn quốc. Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với Azospirillum amazonense), dòng TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) trên cây lúa trồng ở nhiều địa bàn khác nhau ở tỉnh Phú Yên.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA
VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY LÚA TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở TỈNH PHÚ YÊN
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 01 07
Cần Thơ, 2015
Trang 2Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Cần Thơ
Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện
Trung tâm học liệu - Đại học Cần Thơ
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề
Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu trong khẩu phần dinh dưỡng cho hơn 40% dân số thế giới Năng suất cũng như sản lượng lúa tùy thuộc vào khí hậu, loại đất, độ ẩm và nguồn dinh dưỡng Cây lúa cần nhiều chất dinh dưỡng khác nhau, chủ yếu là đạm, lân và kali Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây lúa, nông dân phải sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học, chủ yếu là phân đạm, lân và kali Tuy nhiên hiệu suất sử dụng phân bón chỉ khoảng 35 - 40%, còn lại 60 - 65% lượng phân bón bị mất đi Trong số lượng phân bón cây trồng không sử dụng được, một phần bị rửa trôi theo nước và gây ô nhiễm nguồn nước ngầm, một phần bị bay hơi do tác động của nhiệt độ hay quá trình phản nitrate hóa gây ô nhiễm không khí (Nguyễn Đức Khiển, 2002)
Trước sức ép của vấn đề an ninh lương thực, người dân luôn đặt ra mục đích phải thu nhiều sản phẩm Song do ý thức và trình độ canh tác chưa cao nên tình trạng lạm dụng phân bón hóa học đã xảy ra khá phổ biến Kết quả điều tra của Sở Nông Nghiệp và PTNT Phú Yên trong năm 2012 cho thấy, chi phí mà nông dân mua phân bón để sản xuất lúa lên đến 6.000.000 đồng/ha/vụ, chi phí này > 50% tổng chi phí trong sản xuất lúa Điều này đã tác động bất lợi đến chi phí sản xuất, đến môi trường dẫn đến kết quả sản xuất không mang lại hiệu quả kinh tế cao và chưa có nền sản xuất bền vững Để khắc phục những tác động bất lợi này thì việc sử dụng phân bón sinh học trong quá trình sản xuất nói chung và sản xuất lúa nói riêng thật sự rất có ý nghĩa Trong khi đó vi khuẩn nội sinh có nhiều đặc tính tốt, có vai trò quan trọng đối với cây trồng và được ứng dụng trong sản xuất phân vi sinh Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh có ích trong sản xuất phân bón vi sinh phục vụ cho sản xuất nông nghiệp rất có ý nghĩa
và cần thiết Hơn nữa, hiện nay ở tỉnh Phú Yên chưa có một công trình nghiên cứu nào về vi khuẩn nội sinh trong cây lúa Chính vì vậy đề tài:
“Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa
trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” đã được thưc hiện
1.2 Mục tiêu
Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao để ứng dụng sản xuất phân vi sinh bón cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên
1.3 Những điểm mới và ý nghĩa thực tiễn của luận án
Đề tài đã phân lập và khảo sát các đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên, đồng thời các dòng vi khuẩn nội sinh này được nhận diện bằng kỹ thuật PCR
Trang 4Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại dựa vào đoạn gen 16S rDNA để định danh, xác định mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn
đã phân lập và phân tích sự đa dạng về loài của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên ở mức độ nucleotide
Tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với loài
Azospirillum amazonense) và dòng PHL87 (tương đồng 99% Burkholderia kururiensis) có khả năng cung cấp 50% lượng đạm sinh học (60 kg N/ha) cho cây lúa, 2 dòng vi khuẩn TAL1 (tương đồng 99% loài Pseudomonas putida) và TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) có khả năng hòa tan lân khó tan từ các thí nghiệm in vitro, nhà lưới và ngoài đồng Kết
quả nghiên cứu mang lại nhiều triển vọng cho việc ứng dụng 2 dòng vi khuẩn nội sinh này trong sản xuất phân vi sinh dùng cho sản xuất lúa tại Phú Yên
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trong phần tổng quan tài liệu, luận án đã nêu và phân tích những vấn đề liên quan đến tác động của phân bón trong sản xuất lúa Tổng quan về các đặc tính của vi khuẩn nội sinh và tình hình nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất nông nghiệp, với các nội dung chính như sau:
- Tổng quan về tình hình sản xuất lúa ở Phú Yên
- Hiện trạng sử dụng phân bón ở Việt Nam và Phú Yên
- Tổng quan về vi khuẩn nội sinh, đặc tính và vai trò của vi khuẩn nội sinh
- Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất phân vi sinh
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu
+ Mẫu lúa thu từ 7 huyện và thành phố Tuy Hòa tỉnh Phú Yên từ tháng 8/2011 đến 8/2012, giống lúa Ma Lâm 213 đang được trồng phổ biến ở tỉnh Phú Yên
+ Môi trường phân lập vi khuẩn: môi trường LGI (Cavalcante và Döbereiner, 1988), môi trường Nfb (Krieg và Döbereiner, 1984) và môi
trường RMR (Elbeltagy et al., 2001)
+ Môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005), môi trường NBRIP
(Nautiyal, 1999), thuốc thử Salkowsky đo IAA (Glickmann và Desseaux, 1995), môi trường dinh dưỡng khoáng Yoshida (Yoshida, 1978)
Trang 53.2.2 Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR khuếch đại vùng 16S rDNA được thực hiện với cặp mồi
p515FPL và p13B được thiết kế (Zinniel et al., 2002), cặp mồi: mồi 1:
p515FPL GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’, mồi 2: p13B AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’
5’-3.2.3 Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa
- Đo hàm lượng NH4
+ bằng phương pháp so màu ở bước sóng 640 nm (OD640 nm) trên quang phổ kế (Page et al., 1982)
- Đo lượng P2O5 bằng phương pháp so màu ở bước sóng 880 nm trên quang phổ kế (Murphy và Riley, 1962)
- Đo hàm lượng IAA bằng phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm
bằng phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al., 2011) và xây dựng, phân tíchsơ
đồ mối quan hệ di truyền dạng Maximum Likelihood Sự đa dạng của các trình tự nucleotide cũng được phân tích bằng phần mềm DNASP 5.10
(Rozas et al., 2003)
3.2.5 Đo lƣợng Acethylen bị khử
Đo lượng ARA (Acetylene Reduction Assay) hình thành khi vi khuẩn
được nuôi trong môi trường Burk lỏng không đạm và hàm lượng ARA hình thành khi vi khuẩn được bổ sung vào hạt lúa và trồng lúa vào môi trường Burk không đạm có bổ sung 0,8% agar bằng máy sắc khí theo
(Somasegaran và Hoben, 1985), (Elbeltagy et al., 2001) Mẫu được đo
ARA tại phòng thí nghiệm Chuyên sâu (Trường Đại học Cần Thơ)
Nhận diện gen nifH của 22 dòng vi khuẩn có hoạt tính nitrogenase cao
bằng cách thực hiện các phản ứng PCR với cặp mồi PolF 5’
Trang 6Hạt lúa nảy mầm bổ sung vi khuẩn được trồng trên môi trường dinh dưỡng khoáng Yoshida Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, với 24 nghiệm thức (NT) Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần
- Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn được bố trí
như sau: NT1 (Đối chứng âm): môi trường Yoshida không bổ sung đạm và không vi khuẩn NT2 (Đối chứng dương): môi trường Yoshida có bổ sung đạm và không vi khuẩn NT3 đến NT24: môi trường Yoshida không bổ sung đạm và lần lượt bổ sung các dòng vi khuẩn
- Thí nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn NT1
(Đối chứng âm): môi trường Yoshida không có 10 mg/l NaH2PO4.2H2O bổ sung 20 mg/l Ca3(PO4)2 và không vi khuẩn NT2 (Đối chứng dương): môi trường Yoshida có 10 mg/l NaH2PO4.2H2O bổ sung 20 mg/l Ca3(PO4)2 và không vi khuẩn NT3 đến NT24: môi trường Yoshida không có 10 mg/l NaH2PO4.2H2O bổ sung 20 mg/l Ca3(PO4)2 và lần lượt bổ sung các dòng vi khuẩn
Cây lúa được thu sau 28 ngày trồng để đánh giá các chỉ tiêu về chiều cao cây và trọng lượng khô cả cây
3.2.7 Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn
Phản ứng catalase, khả năng sinh trưởng của các dòng vi khuẩn trên các
nguồn đường khác nhau (D-glucose, Sucrose, Maltose, Manitol, Fructose)
và nguồn chitin Khả năng sinh trưởng trên môi trường nước trích khoai tây (BMS)
3.2.8 Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới
Hạt lúa đã được bổ sungvi khuẩn và trồng trong chậu theo các nghiệm thức Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm được bố trí theo thể thức
hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại với 45 nghiệm thức (Bảng 3.1 Thí
nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn được
bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại với 25 nghiệm thức
(Bảng 3.1)
Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát đạm và lân
Trang 7Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi
kết hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng trong chậu (Bảng 3.2) Cây lúa
ở giai đoạn 48 ngày được đánh giá các chỉ tiêu về chiều cao cây, số chồi/bụi, chiều dài rễ, trọng lượng khô của rễ và thân Giai đoạn thu hoạch xác định các chỉ tiêu về chiều cao cây, số bông/bụi, chiều dài bông, số hạt chắc/bông, tỷ lệ hạt lép/bông, trọng lượng 1000 hạt, trọng lượng rơm và năng suất
Bảng 3.2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tổ hợp 2 dòng vi khuẩn
+ Chuẩn bị đất: đất được cày xới, san bằng mặt và làm sạch cỏ dại Đắp
bờ phân ô, mỗi ô có diện tích 20 m2
Chuẩn bị mạ: hạt lúa được ngâm trong nước sạch trong 24 giờ và ủ 36 giờ trước khi đem gieo mạ Chuẩn bị dịch
Trang 8vi khuẩn: nuôi vi khuẩn trên môi trường Burk lỏng không đạm, mỗi dòng
20 lít với mật số vi khuẩn 108
tế bào/ml
+ Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm: thí nghiệm bố trí theo
thể thức có lô phụ Lô chính là phân đạm với 5 mức độ: 0 kg N, 30 kg N,
60 kg N, 90 kg N và 120 kg N/ha và lô phụ là vi khuẩn (gồm 2 dòng vi khuẩn và đối chứng), lặp lại 4 lần (4 khối)
+ Thí nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan: thí nghiệm bố trí
theo thể thức có lô phụ Lô chính (phân Lân) gồm 3 mức độ phân lân (0 kg,
40 kg, và 80 kg P2O5/ha) Lô phụ (Vi khuẩn) gồm: 0 VK, dòng VK1, dòng VK2
+ Thí nghiệm tổ hợp 2 dòng vi khuẩn: thí nghiệm bố trí theo thể thức
có lô phụ Lô chính (phân N - P2O5) với 3 mức độ: 0N-0P2O5 kg, 40P2O5 kg và 120N-80P2O5 kg/ha và lô phụ (vi khuẩn) gồm dòng VK1, VK2, VK1+VK2 và đối chứng, lặp lại 4 lần (4 khối)
+ Cấy lúa: mạ 21 ngày tuổi, ở lô có bổ sung vi khuẩn: rễ lúa được ngâm trong dịch vi khuẩn (riêng biệt cho từng dòng) trong 6 giờ, nghiệm thức đối chứng (ngâm trong nước) Mạ được cấy theo khoảng cách 15 x 15 cm, 2 tép/bụi Mỗi nhóm công nhân (3 người) chỉ cấy cho 1 dòng vi khuẩn riêng biệt
+ Chăm sóc, bón phân và đánh giá các chỉ tiêu về chiều cao cây, số bông/bụi, số bông/m2
, chiều dài bông, số hạt chắc/bông, tỷ lệ hạt lép/bông, trọng lượng 1000 hạt, trọng lượng rơm, năng suất thực tế của lúa Hàm lượng N trong gạo và rơm phân tích bằng phương pháp Micro-Kjeldahl, phân tích hàm lượng P trong gạo và rơm (thực hiện ở phòng Phân tích Đất,
BM Khoa học Đất - Khoa Nông Nghiệp - Đại học Cần Thơ)
3.3 Xử lý số liệu:
Bằng chương trình Excel, phần mềm MEGA 6.0, BioEDit, DNASP 5.10
và thống kê số liệu bằng phần mềm Minitab 16, MSTATC
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập và đặc điểm sinh học của vi khuẩn nội sinh cây lúa 4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
Tổng cộng có 593 dòng vi khuẩn phân lập được từ thân và rễ của 119 mẫu lúa thu được ở 7 huyện và thành phố Tuy Hòa trên 3 loại môi trường nuôi cấy LGI, Nfb và RMR Số dòng vi khuẩn phân lập từ rễ là 372 dòng chiếm tỷ lệ 62,73%, số dòng vi khuẩn phân lập từ thân là 221 dòng chiếm
tỷ lệ 37,27% Khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường bán đặc, sau 48 giờ
vi khuẩn phát triển thành vòng pellicle cách bề mặt môi trường 2 - 5 mm
(Hình 4.1)
Trang 9Hình 4.1 Vòng pellicle xuất hiện trên các môi trường nuôi cấy
1, 3, 5: Môi trường không có vi khuẩn, 2,4,6: Môi trường có vi khuẩn
4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn
Khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau sau 24 giờ nuôi cấy trên 3 loại
môi trường Khuẩn lạc có màu vàng nhạt, vàng đậm, trắng đục hoặc trắng
trong (Hình 4.2)
Hình dạng khuẩn lạc đa số là dạng tròn, bìa nguyên và nhô cao với
530/593 khuẩn lạc, có 55/593 khuẩn lạc dạng không đều, bìa cưa, lài và
8/593 khuẩn lạc có dạng tròn, nguyên, lài trên môi trường Nfb Sau 48 giờ
đường kính của 593 khuẩn lạc dao động từ 1 - 3 mm
TAL22 SHL73
TAN8 TAN14 TAN5
TAMa11 PHM95 TAM13
Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập môi trường
LGI (A), Nfb (B) và RMR (C)
- Hình dạng tế bào của các dòng vi khuẩn được phân lập trên 3 loại môi
trường đa số có dạng hình que ngắn, một số ít vi khuẩn dạng que dài và một
ít vi khuẩn có dạng hình cầu (Hình 4.3) Đa số các dòng vi khuẩn đềucó khả
năng chuyển động, Gram âm
vòng pellicle
Trang 10Hình 4.3 Hình tế bào vi khuẩn chụp dưới kính hiển vi điện tử (SEM) độ phóng đại 14.000 lần
4.2 Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
Kết quả có 556/593 dòng vi khuẩn cho sản phẩm nhân bản DNA ở vị trí
900 bp so với thang chuẩn chiếm tỷ lệ 93,76% (Hình 4.4) Như vậy 556
dòng vi khuẩn này là các dòng vi khuẩn nội sinh (Zinniel et al., 2002)
Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi
khuẩn với 2 mồi p515FPL và p13B trên gel agarose 1,5%
M: thang chuẩn 100bp, 1-15: lần lượt là các dòng vi khuẩn nội sinh TALa14, TAL1, TAL4, TAL5, TAL22, TAL30, SHL70, PHL87, PHL103, PHL105, DHL105, TANa5, PHN85, TAMa9, TAM18 và 16: đối chứng âm (không vi khuẩn)
4.3 Đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa
+ tạo ra sau 2, 4, 6 và 8 ngày Kết quả khảo sát hàm lượng NH4
+
được ghi nhận ở Hình 4.5
Hàm lượng NH4
+ biến động theo thời gian với 8 trường hợp khác nhau Kết quả của sự biến thiên này là do tốc độ phát triển của các dòng vi khuẩn không giống nhau, những dòng vi khuẩn có tốc độ phát triển nhanh nên chỉ sau 2 ngày nuôi cấy hàm lượng NH4
+ đạt cao nhất như dòng THL103 (7,26 mg/l), TANa8 (6,88 mg/l),… Đa số các dòng vi khuẩn phân lập được 305/533 dòng có lượng hàm lượng NH4
+ đạt mức cao nhất vào ngày thứ 4
Có 137/533 dòng vi khuẩn phát triển chậm hơn hàm lượng NH4+ đạt mức cao nhất vào ngày thứ 6 và một số dòng vi khuẩn phát triển rất chậm thì hàm lượng NH4+ tăng theo thời gian Ngoài ra một số dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4
+ được tạo ra cao nhất vào ngày 2 sau đó giảm vào ngày 4
và tăng lại ngày 6 hoặc ngày 8 Những dòng vi khuẩn này có lẽ rất nhạy
(0,432x1,28
4
(0,628x0,98
9
Trang 11cảm với hàm lượng NH4
+ hình thành Theo kết quả nghiên cứu của Van và Sloger (1981) trong quá trình tổng hợp NH4
+, sự hoạt động của enzyme nitrogenase bị tác động ức chế bởi hàm lượng NH4
+ Khi hàm lượng NH4
+tăng sẽ ức chế vi khuẩn tổng hợp NH4
+ trở lại Ngoài ra, quá trình tổng hợp NH4
174
110
32 0
50 100 150 200 250 300 350
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8
0 - 0.99 1.00 - 1.99 2.00 - 2.99
cả trong điều kiện thực tế ruộng lúa mà bà con nông dân bón nhiều đạm
4.3.2 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn
Có 457/533 dòng vi khuẩn phát triển mạnh trên môi trường NBRIP đặc, tiếp tục nuôi cấy các dòng này trên môi trường NBRIP lỏng và khảo sát hàm lượng P2O5 tạo ra sau 5, 10, 15 và 20 ngày Kết quả được ghi nhận ở
Hình 4.6
Khả năng hòa tan lân khó tan của 457 dòng vi khuẩn trong thời gian 5,
10, 15 và 20 ngày nuôi cấy thay đổi theo 5 hướng khác nhau Kết quả của sự biến thiên hàm lượng P2O5 tạo ra là do tốc độ phát triển của các dòng vi khuẩn không giống nhau, một số dòng vi khuẩn có tốc độ phát triển rất nhanh nên chỉ sau 5 ngày nuôi cấy hàm lượng P2O5 đạt mức cao nhất như dòng DHL136 (252,23 mg/l), DHL138 (230,27 mg/l), TALa12 (220,72 mg/l) và DHL74 (218,45 mg/l) Một số dòng có khả năng hòa tan lân khó tan rất cao sau 10 ngày nuôi cấy như dòng TAL1 (634,11 mg/l), dòng
TAL4 (454,32 mg/l), … Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Kumar et
mg/l
Trang 12al., (2008) khi phân lập Enterobacter sp trong môi trường pH = 7 có khả năng hòa tan lân khó tan 229 mg/l, theo Chen et al., (2006) tùy thuộc vào
môi trường pH vi khuẩn hòa tan lân khó tan dao động từ 31,5 mg/l đến 898 mg/l và theo báo cáo của Nguyễn Thị Thu Hà và Cao Ngọc Điệp (2008) vi khuẩn nội sinh trong cây cỏ có khả năng hòa tan lân tốt nhất với lượng lân hòa tan là 283,33 mg/l sau 10 ngày nuôi
63
51
16 0
50 100 150 200 250 300
Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Ngày 20
Hình 4.6 Sự biến thiên hàm lƣợng P 2 O 5 của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian
4.3.3 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn
Kết quả khảo sát tại 4 thời điểm là 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi, cho thấy tất cả
457 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp IAA (Hình 4.7) Hàm lượng
IAA được tổng hợp ở 4 thời điểm khảo theo 4 chiều hướng khác nhau Nhiều dòng có khả năng tổng hợp IAA khá cao sau 4 ngày nuôi cấy như dòng SHL63 (38,75 µg/ml), PHL86 (37,77 µg/ml), … Kết quả khảo sát này tương
tự với các kết quả nghiên cứu trước đây Sự tổng hợp IAA của vi khuẩn
Azospirillum brasilense ít hơn 2 µg/ml trong môi trường không đạm nhưng
trong môi trường có NH4
+
và có bổ sung tryptophan đạt được 24 µg/ml
(Tien et al., 1979) Malik et al., (1997) nhận thấy Pseudomonas có khả
năng tổng hợp IAA khá cao (35 µg/ml)
66
113 185
112 121
235
182
256 284
105
24 71
25 4 0
50 100 150 200 250 300
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8
0.15 - 4.9 5.0 - 9.9 10.0 - 20.0
> 20.0
Hình 4.7 Sự biến thiên hàm lƣợng IAA của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian
4.4 Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của 90 dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp NH 4
+
cao, hòa tan lân và tổng hợp IAA
µg/ml IAA mg/l
Trang 13Có 90 dòng vi khuẩn được tuyển chọn có hàm lượng NH4
+ dao động từ 2,23 - 6,26 mg/l, P2O5 dao động từ 28,92 - 371,31 mg/l và IAA dao động 3,56 - 22,90 µg/l Tất cả các trình tự 16S rDNA của 90 dòng vi khuẩn đã được phân tích và so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen
(NCBI) bằng công cụ BLAST nucleotid được ghi nhận ở (Bảng 4.1)
Bảng 4.1 Mối tương quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn phân lập với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA
TALa14 760 Bacillus megaterium strain p16_B11 JQ833394 99
THN128 800 Staphylococcus arlettae IHB B 8022 KF475813 97 PHN105 856 Exiguobacterium acetylicum PNS-30 JQ218452 99
PHL103 838 Burkholderia vietnamiensis RPB3 HQ606073 99