Khả năng phân hủy hợp chất clo được đánh giá thông qua 2 cách. Cách thứ nhất là khảo sát trực tiếp thông qua hàm lượng cơ chất còn lại trong mẫu sau khi được các vi sinh vật sử dụng. Cách thứ 2 là gián tiếp thông qua lượng sản phẩm tạo ra (ở đây là Cl-).
Cách thử nhất, phương pháp được sử dụng phổ biến và tính đặc hiệu cao là khối phổ, sử dụng thiết bị chính cho phân tích là GC/MS. Ưu điểm của phương pháp khối phổ này là ngoài yếu tố thời gian lưu như trong phương pháp sắc ký dùng detector ECD, việc sử dụng detector MS còn cung cấp thêm thông tin quan trọng khác cho việc định danh là khối phổ của hợp chất phân tích. Một ưu điểm khác là trong trường hợp có sự trùng lặp một phần hoặc toàn phần, hai hay nhiều peak được rửa giải ra cột thì việc chọn lại mảnh ion có thể giúp ta xác nhận lại hợp chất cần xác định và đồng thời cho phép định lượng.
[Lê Bảo Hưng (2012), “Nghiên cứu điều kiện phân tích các hợp chất hữu cơ clo PCB trong mẫu môi trường bằng phương pháp GC-MS”, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.]
Cách thứ 2 là xác định gián tiếp thông qua lượng sản phẩm Cl- tạo ra trong dịch ngoại bào của vi khuẩn. Khi vi sinh vật sử dụng cơ chất sinh trưởng phát trển thì enzyme dehalogenase của vi sinh vật sẽ cắt đứt liên kết C – Clo giải phóng Clo dưới dạng Cl-. Hiện này có nhiều phương pháp cho phép xác định chính xác hàm lượng Clo trong mẫu nước như:
- Phương pháp thủy ngân thyocianate.
- Phương pháp so màu với acid sulfosalicylic. - Xác định tổng sắt với thuốc thử 1-10 phenantrolin.
Phương pháp thủy ngân Thyocianate được chúng tôi lựa chọn để xác định sản phẩm Cl- tạo ra do xét về tính khả thi, chi phí cũng như thao tác và các điều kiện phòng thí nghiệm.
Phương pháp phân tích dựa trên thủy ngân thyocianate
Cl- tạo ra cho phản ứng với NH4Fe(SO4)2 0,25M và thủy ngân thyocianate Hg(SCN)2 (0,69g/l) tạo thành sản phẩm có màu cam đỏ có thể định lượng ở bước sóng 453nm [Bergman, J. G. and Sanik, J. Jr. (1957), “Determination of trace amounts of chlorine in Naphtha”, Analytical Chemistry 29, 241-243.]
Phương trình phản ứng:
Hg(SCN)2 + 2Cl- HgCl2 + 2SCN-
Fe3+ + 3SCN- Fe(SCN)3
(màu đỏ cam) Quy trình thí nghiệm như sau:
- Bước 1: Xây dựng đường chuẩn Cl-
Hóa chất cần chuẩn bị:
Hg(SCN)2 (0,69g/l) pha trong ethanol tuyệt đối. NH4Fe(SO4)2 0,25M pha trong HNO3 9N. Muối NaCl tinh khiết.
Các bước tiến hành:
Cân 8,775g NaCl hòa tan trong nước cất cho dung dịch NaCl 3M.
Pha loãng từ dung dịch NaCl 3M trong đệm Tris Acetat pH=7,5 để được các nồng độ khác nhau.
Lấy 1ml từ các nồng độ đã pha loãng cho vào các effpendof.
Bổ sung 100µl Hg(SCN)2 (0,69g/l), trộn đều hỗn hợp để trong vòng 10 phút tại nhiệt độ phòng. Tiếp tục bổ sung 100 µl NH4Fe(SO4)2 0,25M trộn đều. Sau 2 phút tiến hành đo OD 453nm.
Dùng phần mềm excel xây dựng đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc giữa giá trị OD 453nm và hàm lượng Cl- trong mẫu.
• Khả năng phân hủy hợp chất 1,2-DCE
Khả năng phân hủy hợp chất 1,2-DCE được xác định gián tiếp thông qua hàm lượng Cl- tạo ra trong dịch ngoại bào của vi khuẩn. Khi vi sinh vật sử dụng cơ chất 1,2- DCE, chúng cắt đứt liên kết giữa C-Cl giải phóng Cl-. Hợp chất sẽ bị phân giải thành các sản phẩm trung gian ít độc hơn hoặc bị phân hủy hoàn toàn thành CO2 và H2O. Xác định hàm lượng Cl- ngoại bào được tiến hành theo phương pháp của Bergmann và Sanik [Bergmann J. G., Sanik J. (1957), “Determination of trace amount of chlorine in Naphtha”, Analytical
Chemistry, 29(2), pp. 241-243.].
Nguyên tắc:
Cl- tạo ra cho phản ứng với phức sắt NH4Fe(SO4)2 0,25M và thủy ngân thyocinate Hg(SCN)2 0,69g/l tạo thành sản phẩm có màu cam đỏ có thể định lượng ở bước sóng 453nm.
• Khả năng phân hủy hợp chất 2,2-DCPS
Tiến hành nuôi lắc các chủng vi sinh vật trên 2 môi trường có bổ sung cao nấm men 0,1% và môi trường MGB lỏng theo ngày.
Thu dịch nuôi cấy ly tam 10000v/p trong 10p ở 4oC.
Dịch ngoại bào cho phản ứng với phức sắt và thủy ngân thyocianate tương tự trong đường chuẩn.