• Phương pháp nuôi cấy làm giàu
Các mẫu nuôi cấy được làm làm giàu 2 lần, 5 ngày/lần trong môi trường chọn lọc (môi trường MGB) bao gồm các thành phần môi trường khoáng cơ bản BS, môi trường các nguyên tố vi lượng TMSS và cơ chất 1,2-DCE, 2,2-DCP, 3,4- DCA với nồng độ lần lượt là 5mM, 20mM, 50mg/l tương ứng [Hareland W. A., Crawford R. L., Chapman P. J., Dagley S. (1975) “Metabolic function and properties of 4-hydroxyphenylacetic acid 1-hydroxylase from Pseudomonas
acidovorans”, Journal of Bacteriology, 183(1), pp. 5058- 5066.]. Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút trước khi bổ sung cơ chất mỗi bình 1g mẫu đất, 3ml mẫu nước. Các bình có chứa mẫu được nuôi cấy lắc trong 5 ngày ở 30°C, 160rpm. Sau 5 ngày mẫu được chuyển sang nuôi trên môi trường MGB sạch để làm giàu lần thứ 2. Trong quá trình nuôi cấy, phân lập luôn đậy chặt nắp bình để tránh sự bay hơi của cơ chất [Hamid AAA, Hamdan S, Ariffin AHZ, Huyop F. (2010), “Molecular prediction of dehalogenase producing microorganism using 16S DNA analysis of 2,2 dichloropropionate degrading bacterium isolated from volcanic soil”, Journal
of Biology Science, 10(3), pp. 190-199., Van den Wijngaard A.J., van der
KampK. W. H. J., van der Ploeg J., Pries F., Kazemier B., Janssen D. B. (1992), “Degradation of 1, 2-Dichloroethane by Ancylobacter aquaticus and other facultative methylotrophs”, Applied and Environmental Microbiology, 58(3), pp. 976-983., Govender A., Pillay B. (2011), “Characterization of 1, 2-
dichloroethane (DCA) degrading bacteria isolated from South African waste water”, African Journal of Biotechnology, 10(55), pp. 11567-11573.].
• Phương pháp cấy gạt
- Môi trường thạch MGB bao gồm các thành phần dung dịch BS 10x, TMSS 10x, thạch agar 20g/l, EDTA 0,5M và bổ sung cơ chất khác nhau là 1,2- DCE nồng độ 5mM, 2,2-DCP nồng độ 20mM và cơ chất 3,4-DCA nồng độ 50mg/l được đổ vào các đĩa petri thủy tinh sạch.
- Lấy 100 µl dịch nuôi cấy đưa vào ống eppendorf chứa 900 µl nước cất đã được khử trùng để được độ pha loãng 10-1. Vontex đều sau đó lấy 100 µl dung dịch ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống eppendorf chứa 900 µl nước cất vô trùng để được độ pha loãng 10-2 . Tiếp tục như vậy đến nồng độ 10-6.
- Lấy 100µl dung dịch pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp, dùng que gạt trải đều lên đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy cho đến khi bề mặt thạch khô.