Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu gồm: Nồi khử trùng (ALP - Nhật); Máy lắc (Satorius - Đức), Wibecuse (Hàn Quốc); Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý); Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh); Cân Kern (Satorius - Đức); Cân Pressica XT 220A (Ý); Tủ ấm (Memmert - Đức); Máy li tâm sigma 3K30 (Sartorius - Đức); Vortex (Ika - Đức); Tủ sấy (Memmert - Đức); Máy khuấy từ (Ika - Đức); Kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản) tại Bộ môn Vật lý, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phƣơng pháp thu mẫu.
Mẫu đất và mẫu nước tại khu vực vườn hoa xã Sơn Đồng, huyện Hoài Đức, Hà Nội được thu vào các Falcon bằng các dụng cụ đã khử trùng và đạt quy chuẩn về độ sạch.
Mẫu đất được lấy bề mặt đất và ở độ sâu 5 cm so với bề mặt. Mẫu nước thu ở khu vực nước đọng; cống thoát nước và mương nước.
Phƣơng pháp nuôi cấy làm giàu
Các mẫu nuôi cấy được làm làm giàu 2 lần, 5 ngày/lần trong môi trường chọn lọc (môi trường MGB) bao gồm các thành phần môi trường khoáng cơ bản BS, môi trường các nguyên tố vi lượng TMSS và cơ chất 1,2-DCE, 2,2-DCP, 3,4- DCA với nồng độ lần lượt là 5mM, 20mM, 50mg/l tương ứng [37]. Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút trước khi bổ sung cơ chất mỗi bình 1g mẫu đất, 3ml mẫu nước. Các bình có chứa mẫu được nuôi cấy lắc trong 5 ngày ở 30C, 160rpm. Sau 5 ngày mẫu được chuyển sang nuôi trên môi trường MGB sạch để làm giàu lần thứ 2. Trong quá trình nuôi cấy, phân lập luôn đậy chặt nắp bình để tránh sự bay hơi của cơ chất [36, 61].
Phƣơng pháp cấy gạt
- Môi trường thạch MGB bao gồm các thành phần dung dịch BS 10x, TMSS 10x, thạch agar 20g/l, EDTA 0,5M và bổ sung cơ chất khác nhau là 1,2- DCE nồng độ 5mM, 2,2-DCP nồng độ 20mM và cơ chất 3,4-DCA nồng độ 50mg/l được đổ vào các đĩa petri thủy tinh sạch.
- Lấy 100 µl dịch nuôi cấy đưa vào ống eppendorf chứa 900 µl nước cất đã được khử trùng để được độ pha loãng 10-1. Vontex đều sau đó lấy 100 µl dung dịch ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống eppendorf chứa 900 µl nước cất vô trùng để được độ pha loãng 10-2 . Tiếp tục như vậy đến nồng độ 10-6.
- Lấy 100µl dung dịch pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp, dùng que gạt trải đều lên đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy cho đến khi bề mặt thạch khô.
2.4.3. Phƣơng pháp bảo quản giống
Tinh sạch, ria cấy 3 pha các chủng để thu nhận chủng thuần khiết, sau đó giữ giống trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng.
Vi khuẩn được nuôi trong ống thạch nghiêng thạch LB, nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau khoảng 2-3 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt cất vào tủ mát ở nhiệt độ 4-6oC. Sau 1-2 tháng cấy truyền lại một lần.
Nhằm bảo quản được giống lâu hơn, để giống trong paraffin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng đến 2 năm.
2.4.4. Phƣơng pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất clo
Môi trường chọn lọc có bổ sung thạch và bromothymol blue (75mg/l) [27]. Khả năng phát triển và tạo màu trên môi trường có bromothymol blue nhằm chọn lọc các chủng có khả năng phân giải tốt cơ chất do Bromothymol blue là chất chỉ thị màu cho khả năng phân giải hợp chất clo.
Có thể dễ dàng nhận ra sự phân giải cơ chất của các chủng vi sinh vật khi enzyme dehalogenase của vi sinh vật xúc tác phản ứng cắt đứt liên kết C-Cl, giải phóng HCl làm thay đổi pH môi trường, điều đó khiến cho bromothymol blue trong môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu vàng [64]. Các chủng có sự chuyển màu rõ rệt nhất và có khả năng sinh trưởng mạnh nhất sau 3 ngày sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.4.5. Phƣơng pháp phân loại các chủng nghiên cứu Phƣơng pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc
Dựa vào sự khác biê ̣t giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tinh thể tím [1].
Phương pháp tiến hành
- Làm vết bôi: Nhỏ 1 giọt nước cất lên lam kính. Dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn (sau khi cấy 24h) hòa đều vào giọt nước và giàn thành lớp mỏng. Sau đó, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm tiêu bản bằng tím kết tinh trong vòng 1 phút. - Nhuộm bổ sung lugol trong 30 giây.
- Tẩy cồn.
- Rửa nước, hong khô.
- Nhuộn tiếp bằng Safranin trong 20s, rửa nước, làm khô. - Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính dầu 100X.
Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ hồng.
Chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét
- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn: Các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch LB không quá 24 giờ ở 37C.
- Gắn mẫu vi khuẩn lên lamen, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu. - Gắn mẫu lên đế mạ phủ mẫu vàng trên máy JFC-1200 trong 5 phút ở 30mA. - Soi và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản) tại
phòng Chụp hiển vi điện tử quét - Trung Tâm Khoa Học Vật Liệu - Khoa Vật lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
Giải trình tự gen 16S ARNr
- Mẫu vi sinh vật được gửi đến công ty Macrogen - Hàn Quốc để tiến hành giải trình tự gen 16S ARNr.
- Kết quả phân tích trình tự được so sánh với các loài trong ngân hàng gen quốc tế bằng phương pháp Clustal X.
- Sau đó xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm Tree phylogenetic.
2.4.6. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa của các chủng nghiên cứu
Để kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ điển hình của các chủng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thử với Kit thử API 20NE cho vi khuẩn Gram (-) và Kit thử API 50CHB cho vi khuẩn (+) của hãng BioMérieus. Hóa chất và thuốc thử được cung cấp cùng với bộ kit tương ứng.
Các bước tiến hành được tóm tắt như sau:
Tiến hành với Kit API 20NE
- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn mới nuôi, không quá 24 giờ
- Sau khi nuôi cấy tiến hành bổ sung vi khuẩn vào nước cất khử trùng sao cho OD600nm đạt giá trị 0,132.
- Bổ sung 0,2ml dịch vi khuẩn đã pha loãng vào các giếng từ NO3 đến PNPG, bổ sung thêm dầu khoáng vào các ống kí hiệu GLU, ADH, URE.
- Thêm 0,2ml dịch vào các ống API AUX, trộn nhẹ cho đều, rồi bổ sung 0,2ml dịch này vào các ống còn lại từ GLU đến PAC.
- Sau 24h kiểm tra NO3- bằng thuốc thử NIT 1 và NIT 2, nếu phản ứng dương tính, sau 5 phút dịch trong ống sẽ chuyển thành màu hồng đỏ, nếu âm tính sẽ không có màu. Nếu phản ứng âm tính thì cần kiểm tra việc sản xuất nito bằng cách bổ sung thêm 2-3mg Zn2+. Sau 5 phút nếu dịch trong ống không màu thì là phản ứng dương tính, nếu chuyển sang màu hồng là âm tính. - Kiểm tra TRP bằng cách thêm 1 giọt thuốc thử JAMES, phản ứng dương tính
sẽ cho màu hồng ngay tức khắc; ESC kết quả dương tính cho màu đen, âm tính cho màu vàng; GEL dương tính cho màu đen bị khuếch tán.
- Kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất còn lại bằng cách dựa vào độ đục, phản ứng dương tính cho độ đục cao.
- Kết quả ghi lại và được phân tích với phần mềm của hãng BioMérieus. Tiến hành với Kit API 50CH.
- Lấy một vài khuẩn lạc nhất định cho vào ống API 50CHB/E sao cho OD600nm của dung dịch trong ống đạt 0,451.
- Thêm 0,2ml dung dịch trên vào các giếng.
- Đóng hộp, ủ ở 290C ± 20C sau 24 giờ và 48 giờ đọc kết quả. Phản ứng dương tính làm chất chỉ thị màu đỏ trong giếng chuyển thành màu vàng. Riêng phản ứng Esculin cho kết quả dương tính nếu màu đỏ chuyển thành màu đen. Nguyên tắc của sự đổi màu chất chỉ thị đó là trong suốt quá trình ủ, các cacbonhydrate được chuyển hóa thành acid dẫn đến làm giảm pH từ đó đổi màu chất chỉ thị.
2.4.7. Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng và khả năng sử dụng một số hợp chất clo lên các chủng nghiên cứu
Mỗi chủng vi sinh vật đều phát triển tốt nhất ở những điều kiện thích hợp. Khi nhiệt độ, nồng độ cơ chất không thích hợp sẽ tác động đến vi sinh vật và có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển cũng như khả năng phân hủy cơ chất của vi sinh vật.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những yếu tố của môi trường tác động trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn nói riêng, cũng có
thể thông qua yếu tố này đánh giá tiềm năng ứng dụng của vi sinh vật để xử lý ô nhiễm các hợp chất clo ngoài thực tế.
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, chủng vi khuẩn được nuôi ở các mốc nhiệt độ 25, 30, 37, 45, 55C trên môi trường MGB, cơ chất 2,2-DCP được thêm với nồng độ cuối cùng là 20mM, cơ chất 3,4- DCA nồng độ cuối cùng là 50mg/l. Đối với cơ chất 1,2-DCE thí nghiệm được thực hiện ở các mốc nhiệt độ 20, 25, 30, 37C với nồng độ cơ chất là 5mM. Sau đó thu dịch nuôi cấy đo mật độ tế bào ở bước sóng 620nm.
Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất
Nồng độ cơ chất trong môi trường có ảnh hưởng quan trọng đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi sinh vật, nồng độ quá cao hay quá thấp đều có thể làm chậm hay gây ức chế quá trình sinh trưởng của loài. Tối ưu nồng độ cơ chất với cơ chất 1,2-DCE các chủng vi sinh vật phân lập được nuôi cấy ở các nồng độ 5, 10, 15, 20mM. Thí nghiệm được thực hiện với 10, 20, 40, 60, 80mM với cơ chất 2,2-DCP và với cơ chất 3,4-DCA là ở nồng độ 25, 50, 100, 150, 200mg/l. Tương tự thí nghiệm nhiệt độ các chủng vi sinh vật được nuôi lắc qua đêm ở 160rpm ở 30C. Kết quả phân tích được đo OD 620nm.
Khả năng sử dụng một số hợp chất clo
Các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường MGB thạch bổ sung cơ chất 1,2-DCE, 2,2-DCP, 3,4-DCA là nguồn cacbon, nguồn năng lượng duy nhất với nồng độ cuối cùng lần lượt là 5mM, 20mM, 50mg/l. Quan sát khả năng phát triển của các chủng.
Tiếp tục thử lại trên môi trường MGB thạch bổ sung bromothymol blue, quan sát sự phát triển và phát màu của các chủng vi khuẩn để đánh giá khả năng sử dụng một số hợp chất clo khác nhau.
Thí nghiệm đánh giá khả năng sử dụng một số hợp chất clo theo ngày của chủng phân lập, chủng được nuôi lắc trên môi trường MGB có bổ sung 2,2-DCP, 1,2-DCE, 3,4-DCA với các nồng độ thích hợp. Sau các khoảng thời gian 0, 2, 3, 4, 5 ngày nuôi cấy mật độ tế bào được đo ở bước sóng OD 620nm để đánh giá khả năng sinh trưởng.
2.4.8. Đánh giá khả năng phân hủy hợp chất clo
Khả năng phân hủy hợp chất clo được đánh giá thông qua 2 cách. Cách thứ nhất là khảo sát trực tiếp thông qua hàm lượng cơ chất còn lại trong mẫu sau khi được các vi sinh vật sử dụng. Cách thứ 2 là gián tiếp thông qua lượng sản phẩm tạo ra (ở đây là Cl-).
Cách thứ nhất, phương pháp được sử dụng phổ biến và tính đặc hiệu cao là khối phổ, sử dụng thiết bị chính cho phân tích là GC-MS. Ưu điểm của phương pháp khối phổ này là ngoài yếu tố thời gian lưu như trong phương pháp sắc ký dùng detector ECD, việc sử dụng detector MS còn cung cấp thêm thông tin quan trọng khác cho việc định danh là khối phổ của hợp chất phân tích. Một ưu điểm khác là trong trường hợp có sự trùng lặp một phần hoặc toàn phần, hai hay nhiều peak được rửa giải ra cột thì việc chọn lại mảnh ion có thể giúp ta xác nhận lại hợp chất cần xác định và đồng thời cho phép định lượng [5].
Cách thứ 2 là xác định gián tiếp thông qua lượng sản phẩm Cl- tạo ra trong dịch ngoại bào của vi khuẩn. Khi vi sinh vật sử dụng cơ chất sinh trưởng phát trển thì enzyme dehalogenase của vi sinh vật sẽ cắt đứt liên kết C-Cl giải phóng Clo dưới dạng Cl-. Hiện này có nhiều phương pháp cho phép xác định chính xác hàm lượng Clo trong mẫu nước như:
- Phương pháp thủy ngân thyocianate.
- Phương pháp so màu với acid sulfosalicylic. - Xác định tổng sắt với thuốc thử 1-10 phenantrolin.
Phương pháp thủy ngân Thyocianate được chúng tôi lựa chọn để xác định sản phẩm Cl- tạo ra do xét về tính khả thi, chi phí cũng như thao tác và các điều kiện phòng thí nghiệm.
Phương pháp phân tích dựa trên thủy ngân thyocianate
Xác định hàm lượng Cl- ngoại bào được tiến hành theo phương pháp của Bergmann và Sanik. Cl- tạo ra cho phản ứng với thủy ngân thyocianate Hg(SCN)2
(0,69g/l) và NH4Fe(SO4)2 0,25M tạo thành sản phẩm có màu cam đỏ có thể định lượng ở bước sóng 453nm [18].
Hg(SCN)2 + 2Cl- HgCl2 + 2SCN-
Fe3+ + 3SCN- Fe(SCN)3 (màu đỏ cam)
Quy trình thí nghiệm như sau:
Bước 1. Xây dựng đường chuẩn Cl- Hóa chất cần chuẩn bị
- Hg(SCN)2 (0,69g/l) pha trong ethanol tuyệt đối. - NH4Fe(SO4)2 0,25M pha trong HNO3 9N. - Muối NaCl tinh khiết.
Các bước tiến hành
- Cân 8,775g NaCl hòa tan trong nước cất cho dung dịch NaCl 3M.
- Pha loãng từ dung dịch NaCl 3M trong đệm Tris Acetat pH=7,5 để được các nồng độ khác nhau.
- Lấy 1ml từ các nồng độ đã pha loãng cho vào các effpendof.
- Bổ sung 100µl Hg(SCN)2 (0,69g/l), trộn đều hỗn hợp để trong vòng 10 phút tại nhiệt độ phòng. Tiếp tục bổ sung 100µl NH4Fe(SO4)2 0,25M trộn đều. Sau 2 phút tiến hành đo OD 453nm.
- Dùng phần mềm excel xây dựng đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc giữa giá trị OD 453nm và hàm lượng Cl- trong mẫu.
Bước 2. Đánh giá khả năng phân hủy cơ chất.
- Tiến hành nuôi lắc các chủng vi sinh vật trên môi trường MGB lỏng theo ngày.
- Thu dịch nuôi cấy ly tâm 10000v/p trong 10p ở 4oC.
- Dịch ngoại bào cho phản ứng với phức sắt và thủy ngân thyocianate tương tự trong đường chuẩn.
- Đo OD 453nm thu được kết quả khả năng phân hủy cơ chất theo ngày.
2.4.9. Phƣơng pháp thống kê sinh học
Các thí nghiệm được lập lại ít nhất 3 lần và số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng một số hợp chất clo
Từ các mẫu đất và nước thu được tại các khu vực khác nhau tại vườn hoa Sơn Đồng, sau 2 lần làm giàu liên tiếp (5 ngày/lần) trên môi trường MGB lắc ở 30C, 160rpm, dịch làm giàu được cấy trải trên môi trường thạch MGB thạch bổ sung các loại cơ chất khác nhau với các nồng độ tương ứng 1,2- DCE nồng độ 5mM, 2,2-DCPS nồng độ 20mM và cơ chất 3,4-DCA nồng độ 50mg/l.
Sau thời gian từ 3 đến 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất khác nhau chúng tôi đã thu được kết quả như trình bày ở bảng 4, 5, 6. Kết quả nghiên cứu cho thấy cho thấy chúng tôi không phân lập được chủng vi nấm nào mọc trên môi trường chọn lọc, vì thế chúng tôi lựa chọn đối tượng là các chủng vi