Khả năng phân hủy hợp chất clo được đánh giá thông qua 2 cách. Cách thứ nhất là khảo sát trực tiếp thông qua hàm lượng cơ chất còn lại trong mẫu sau khi được các vi sinh vật sử dụng. Cách thứ 2 là gián tiếp thông qua lượng sản phẩm tạo ra (ở đây là Cl-).
Cách thứ nhất, phương pháp được sử dụng phổ biến và tính đặc hiệu cao là khối phổ, sử dụng thiết bị chính cho phân tích là GC-MS. Ưu điểm của phương pháp khối phổ này là ngoài yếu tố thời gian lưu như trong phương pháp sắc ký dùng detector ECD, việc sử dụng detector MS còn cung cấp thêm thông tin quan trọng khác cho việc định danh là khối phổ của hợp chất phân tích. Một ưu điểm khác là trong trường hợp có sự trùng lặp một phần hoặc toàn phần, hai hay nhiều peak được rửa giải ra cột thì việc chọn lại mảnh ion có thể giúp ta xác nhận lại hợp chất cần xác định và đồng thời cho phép định lượng [5].
Cách thứ 2 là xác định gián tiếp thông qua lượng sản phẩm Cl- tạo ra trong dịch ngoại bào của vi khuẩn. Khi vi sinh vật sử dụng cơ chất sinh trưởng phát trển thì enzyme dehalogenase của vi sinh vật sẽ cắt đứt liên kết C-Cl giải phóng Clo dưới dạng Cl-. Hiện này có nhiều phương pháp cho phép xác định chính xác hàm lượng Clo trong mẫu nước như:
- Phương pháp thủy ngân thyocianate.
- Phương pháp so màu với acid sulfosalicylic. - Xác định tổng sắt với thuốc thử 1-10 phenantrolin.
Phương pháp thủy ngân Thyocianate được chúng tôi lựa chọn để xác định sản phẩm Cl- tạo ra do xét về tính khả thi, chi phí cũng như thao tác và các điều kiện phòng thí nghiệm.
Phương pháp phân tích dựa trên thủy ngân thyocianate
Xác định hàm lượng Cl- ngoại bào được tiến hành theo phương pháp của Bergmann và Sanik. Cl- tạo ra cho phản ứng với thủy ngân thyocianate Hg(SCN)2
(0,69g/l) và NH4Fe(SO4)2 0,25M tạo thành sản phẩm có màu cam đỏ có thể định lượng ở bước sóng 453nm [18].
Hg(SCN)2 + 2Cl- HgCl2 + 2SCN-
Fe3+ + 3SCN- Fe(SCN)3 (màu đỏ cam)
Quy trình thí nghiệm như sau:
Bước 1. Xây dựng đường chuẩn Cl- Hóa chất cần chuẩn bị
- Hg(SCN)2 (0,69g/l) pha trong ethanol tuyệt đối. - NH4Fe(SO4)2 0,25M pha trong HNO3 9N. - Muối NaCl tinh khiết.
Các bước tiến hành
- Cân 8,775g NaCl hòa tan trong nước cất cho dung dịch NaCl 3M.
- Pha loãng từ dung dịch NaCl 3M trong đệm Tris Acetat pH=7,5 để được các nồng độ khác nhau.
- Lấy 1ml từ các nồng độ đã pha loãng cho vào các effpendof.
- Bổ sung 100µl Hg(SCN)2 (0,69g/l), trộn đều hỗn hợp để trong vòng 10 phút tại nhiệt độ phòng. Tiếp tục bổ sung 100µl NH4Fe(SO4)2 0,25M trộn đều. Sau 2 phút tiến hành đo OD 453nm.
- Dùng phần mềm excel xây dựng đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc giữa giá trị OD 453nm và hàm lượng Cl- trong mẫu.
Bước 2. Đánh giá khả năng phân hủy cơ chất.
- Tiến hành nuôi lắc các chủng vi sinh vật trên môi trường MGB lỏng theo ngày.
- Thu dịch nuôi cấy ly tâm 10000v/p trong 10p ở 4oC.
- Dịch ngoại bào cho phản ứng với phức sắt và thủy ngân thyocianate tương tự trong đường chuẩn.
- Đo OD 453nm thu được kết quả khả năng phân hủy cơ chất theo ngày.
2.4.9. Phƣơng pháp thống kê sinh học
Các thí nghiệm được lập lại ít nhất 3 lần và số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN