Để kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ điển hình của các chủng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thử với Kit thử API 20NE cho vi khuẩn Gram (-) và Kit thử API 50CHB cho vi khuẩn (+) của hãng BioMérieus. Hóa chất và thuốc thử được cung cấp cùng với bộ kit tương ứng.
Các bước tiến hành được tóm tắt như sau:
Tiến hành với Kit API 20NE
- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn mới nuôi, không quá 24 giờ
- Sau khi nuôi cấy tiến hành bổ sung vi khuẩn vào nước cất khử trùng sao cho OD600nm đạt giá trị 0,132.
- Bổ sung 0,2ml dịch vi khuẩn đã pha loãng vào các giếng từ NO3 đến PNPG, bổ sung thêm dầu khoáng vào các ống kí hiệu GLU, ADH, URE.
- Thêm 0,2ml dịch vào các ống API AUX, trộn nhẹ cho đều, rồi bổ sung 0,2ml dịch này vào các ống còn lại từ GLU đến PAC.
- Sau 24h kiểm tra NO3- bằng thuốc thử NIT 1 và NIT 2, nếu phản ứng dương tính, sau 5 phút dịch trong ống sẽ chuyển thành màu hồng đỏ, nếu âm tính sẽ không có màu. Nếu phản ứng âm tính thì cần kiểm tra việc sản xuất nito bằng cách bổ sung thêm 2-3mg Zn2+. Sau 5 phút nếu dịch trong ống không màu thì là phản ứng dương tính, nếu chuyển sang màu hồng là âm tính. - Kiểm tra TRP bằng cách thêm 1 giọt thuốc thử JAMES, phản ứng dương tính
sẽ cho màu hồng ngay tức khắc; ESC kết quả dương tính cho màu đen, âm tính cho màu vàng; GEL dương tính cho màu đen bị khuếch tán.
- Kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất còn lại bằng cách dựa vào độ đục, phản ứng dương tính cho độ đục cao.
- Kết quả ghi lại và được phân tích với phần mềm của hãng BioMérieus. Tiến hành với Kit API 50CH.
- Lấy một vài khuẩn lạc nhất định cho vào ống API 50CHB/E sao cho OD600nm của dung dịch trong ống đạt 0,451.
- Thêm 0,2ml dung dịch trên vào các giếng.
- Đóng hộp, ủ ở 290C ± 20C sau 24 giờ và 48 giờ đọc kết quả. Phản ứng dương tính làm chất chỉ thị màu đỏ trong giếng chuyển thành màu vàng. Riêng phản ứng Esculin cho kết quả dương tính nếu màu đỏ chuyển thành màu đen. Nguyên tắc của sự đổi màu chất chỉ thị đó là trong suốt quá trình ủ, các cacbonhydrate được chuyển hóa thành acid dẫn đến làm giảm pH từ đó đổi màu chất chỉ thị.
2.4.7. Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng và khả năng sử dụng một số hợp chất clo lên các chủng nghiên cứu
Mỗi chủng vi sinh vật đều phát triển tốt nhất ở những điều kiện thích hợp. Khi nhiệt độ, nồng độ cơ chất không thích hợp sẽ tác động đến vi sinh vật và có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển cũng như khả năng phân hủy cơ chất của vi sinh vật.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những yếu tố của môi trường tác động trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn nói riêng, cũng có
thể thông qua yếu tố này đánh giá tiềm năng ứng dụng của vi sinh vật để xử lý ô nhiễm các hợp chất clo ngoài thực tế.
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, chủng vi khuẩn được nuôi ở các mốc nhiệt độ 25, 30, 37, 45, 55C trên môi trường MGB, cơ chất 2,2-DCP được thêm với nồng độ cuối cùng là 20mM, cơ chất 3,4- DCA nồng độ cuối cùng là 50mg/l. Đối với cơ chất 1,2-DCE thí nghiệm được thực hiện ở các mốc nhiệt độ 20, 25, 30, 37C với nồng độ cơ chất là 5mM. Sau đó thu dịch nuôi cấy đo mật độ tế bào ở bước sóng 620nm.
Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất
Nồng độ cơ chất trong môi trường có ảnh hưởng quan trọng đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi sinh vật, nồng độ quá cao hay quá thấp đều có thể làm chậm hay gây ức chế quá trình sinh trưởng của loài. Tối ưu nồng độ cơ chất với cơ chất 1,2-DCE các chủng vi sinh vật phân lập được nuôi cấy ở các nồng độ 5, 10, 15, 20mM. Thí nghiệm được thực hiện với 10, 20, 40, 60, 80mM với cơ chất 2,2-DCP và với cơ chất 3,4-DCA là ở nồng độ 25, 50, 100, 150, 200mg/l. Tương tự thí nghiệm nhiệt độ các chủng vi sinh vật được nuôi lắc qua đêm ở 160rpm ở 30C. Kết quả phân tích được đo OD 620nm.
Khả năng sử dụng một số hợp chất clo
Các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường MGB thạch bổ sung cơ chất 1,2-DCE, 2,2-DCP, 3,4-DCA là nguồn cacbon, nguồn năng lượng duy nhất với nồng độ cuối cùng lần lượt là 5mM, 20mM, 50mg/l. Quan sát khả năng phát triển của các chủng.
Tiếp tục thử lại trên môi trường MGB thạch bổ sung bromothymol blue, quan sát sự phát triển và phát màu của các chủng vi khuẩn để đánh giá khả năng sử dụng một số hợp chất clo khác nhau.
Thí nghiệm đánh giá khả năng sử dụng một số hợp chất clo theo ngày của chủng phân lập, chủng được nuôi lắc trên môi trường MGB có bổ sung 2,2-DCP, 1,2-DCE, 3,4-DCA với các nồng độ thích hợp. Sau các khoảng thời gian 0, 2, 3, 4, 5 ngày nuôi cấy mật độ tế bào được đo ở bước sóng OD 620nm để đánh giá khả năng sinh trưởng.
2.4.8. Đánh giá khả năng phân hủy hợp chất clo
Khả năng phân hủy hợp chất clo được đánh giá thông qua 2 cách. Cách thứ nhất là khảo sát trực tiếp thông qua hàm lượng cơ chất còn lại trong mẫu sau khi được các vi sinh vật sử dụng. Cách thứ 2 là gián tiếp thông qua lượng sản phẩm tạo ra (ở đây là Cl-).
Cách thứ nhất, phương pháp được sử dụng phổ biến và tính đặc hiệu cao là khối phổ, sử dụng thiết bị chính cho phân tích là GC-MS. Ưu điểm của phương pháp khối phổ này là ngoài yếu tố thời gian lưu như trong phương pháp sắc ký dùng detector ECD, việc sử dụng detector MS còn cung cấp thêm thông tin quan trọng khác cho việc định danh là khối phổ của hợp chất phân tích. Một ưu điểm khác là trong trường hợp có sự trùng lặp một phần hoặc toàn phần, hai hay nhiều peak được rửa giải ra cột thì việc chọn lại mảnh ion có thể giúp ta xác nhận lại hợp chất cần xác định và đồng thời cho phép định lượng [5].
Cách thứ 2 là xác định gián tiếp thông qua lượng sản phẩm Cl- tạo ra trong dịch ngoại bào của vi khuẩn. Khi vi sinh vật sử dụng cơ chất sinh trưởng phát trển thì enzyme dehalogenase của vi sinh vật sẽ cắt đứt liên kết C-Cl giải phóng Clo dưới dạng Cl-. Hiện này có nhiều phương pháp cho phép xác định chính xác hàm lượng Clo trong mẫu nước như:
- Phương pháp thủy ngân thyocianate.
- Phương pháp so màu với acid sulfosalicylic. - Xác định tổng sắt với thuốc thử 1-10 phenantrolin.
Phương pháp thủy ngân Thyocianate được chúng tôi lựa chọn để xác định sản phẩm Cl- tạo ra do xét về tính khả thi, chi phí cũng như thao tác và các điều kiện phòng thí nghiệm.
Phương pháp phân tích dựa trên thủy ngân thyocianate
Xác định hàm lượng Cl- ngoại bào được tiến hành theo phương pháp của Bergmann và Sanik. Cl- tạo ra cho phản ứng với thủy ngân thyocianate Hg(SCN)2
(0,69g/l) và NH4Fe(SO4)2 0,25M tạo thành sản phẩm có màu cam đỏ có thể định lượng ở bước sóng 453nm [18].
Hg(SCN)2 + 2Cl- HgCl2 + 2SCN-
Fe3+ + 3SCN- Fe(SCN)3 (màu đỏ cam)
Quy trình thí nghiệm như sau:
Bước 1. Xây dựng đường chuẩn Cl- Hóa chất cần chuẩn bị
- Hg(SCN)2 (0,69g/l) pha trong ethanol tuyệt đối. - NH4Fe(SO4)2 0,25M pha trong HNO3 9N. - Muối NaCl tinh khiết.
Các bước tiến hành
- Cân 8,775g NaCl hòa tan trong nước cất cho dung dịch NaCl 3M.
- Pha loãng từ dung dịch NaCl 3M trong đệm Tris Acetat pH=7,5 để được các nồng độ khác nhau.
- Lấy 1ml từ các nồng độ đã pha loãng cho vào các effpendof.
- Bổ sung 100µl Hg(SCN)2 (0,69g/l), trộn đều hỗn hợp để trong vòng 10 phút tại nhiệt độ phòng. Tiếp tục bổ sung 100µl NH4Fe(SO4)2 0,25M trộn đều. Sau 2 phút tiến hành đo OD 453nm.
- Dùng phần mềm excel xây dựng đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc giữa giá trị OD 453nm và hàm lượng Cl- trong mẫu.
Bước 2. Đánh giá khả năng phân hủy cơ chất.
- Tiến hành nuôi lắc các chủng vi sinh vật trên môi trường MGB lỏng theo ngày.
- Thu dịch nuôi cấy ly tâm 10000v/p trong 10p ở 4oC.
- Dịch ngoại bào cho phản ứng với phức sắt và thủy ngân thyocianate tương tự trong đường chuẩn.
- Đo OD 453nm thu được kết quả khả năng phân hủy cơ chất theo ngày.
2.4.9. Phƣơng pháp thống kê sinh học
Các thí nghiệm được lập lại ít nhất 3 lần và số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng một số hợp chất clo
Từ các mẫu đất và nước thu được tại các khu vực khác nhau tại vườn hoa Sơn Đồng, sau 2 lần làm giàu liên tiếp (5 ngày/lần) trên môi trường MGB lắc ở 30C, 160rpm, dịch làm giàu được cấy trải trên môi trường thạch MGB thạch bổ sung các loại cơ chất khác nhau với các nồng độ tương ứng 1,2- DCE nồng độ 5mM, 2,2-DCPS nồng độ 20mM và cơ chất 3,4-DCA nồng độ 50mg/l.
Sau thời gian từ 3 đến 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất khác nhau chúng tôi đã thu được kết quả như trình bày ở bảng 4, 5, 6. Kết quả nghiên cứu cho thấy cho thấy chúng tôi không phân lập được chủng vi nấm nào mọc trên môi trường chọn lọc, vì thế chúng tôi lựa chọn đối tượng là các chủng vi khuẩn trong các nghiên cứu tiếp theo. Định hướng sử dụng vi khuẩn trong phương pháp sinh học cho việc phân giải hợp chất Halogen cũng là hướng nghiên cứu chủ yếu trong các công trình công bố trước đây [6].
Bảng 4. Đặc điểm các khuẩn lạc trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 3,4- DCA
STT Kí hiệu Hình dạng khuẩn lạc Màu sắc Đƣờng kính (mm)
Mẫu nước 8 chủng
1 NA1 Tròn, bóng, có tâm ở giữa Trắng ngà 1,0-1,5 mm 2 NA2 Dẹt, khô, có tâm ở giữa Vàng nhạt Không xác định
3 NA3 To, bóng Vàng nhạt Không xác định
4 NA4 Tròn, bóng, dẹt, rìa KL nhăn nheo
Trắng ngà 2,0 mm
5 NA5 Tròn dẹt Trắng ngà 1,5 mm
6 NA6 Tròn, bóng, lồi, KL rất bé Trắng trong
7 NA7 Bóng, dẹt, rìa phẳng Trắng ngà Không xác định 8 NA8 Khuẩn lạc rất bé, lồi Vàng nhạt
1 DA1 Tròn, to, dẹt, bóng Trắng trong 3,0 mm 2 DA2 Dẹt, bóng, rìa khuẩn lạc có
rãnh
Trắng trong Không xác định
3 DA3 Tròn, dẹt, bé Trắng sữa 0,3 mm
4 DA4 To, dẹt, bóng Trắng trong Không xác định 5 DA5 Bé, dẹt, khô Trắng trong Không xác định 6 DA6 Tròn, dẹt, khô, nhẵn Trắng đục 1,0 mm
7 DA7 Tròn, lồi, bóng, bề mặt nhẵn, có tâm
Trắng sữa 0,3 mm
8 DA8 Tròn, lồi, bóng Cam nhạt 0,5 mm
9 DA9 Tròn, dẹt, bóng Trắng sữa 0,8 mm
Trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 3,4-DCA chúng tôi đã phân lập được 17 loại khuẩn lạc khác nhau trong đó có 9 chủng từ mẫu đất và 8 chủng từ mẫu nước. Các khuẩn lạc hầu hết có hình tròn, màu trắng sữa, có một vài khuẩn lạc màu cam đến vàng nhạt, nhìn chung đường kính khuẩn lạc dao động từ 0,3 đến 3,0mm. Một số khuẩn lạc không xác định được đường kính do có hình tia hoặc chia thùy.
Hình 6. Ảnh khuẩn lạc trên môi trường MGB cơ chất 3,4-DCA
Bảng 5. Đặc điểm các khuẩn lạc trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 2,2- DCPS
STT Kí hiệu Hình dạng khuẩn lạc Màu sắc Đƣờng kính (mm)
Mẫu nước 3 chủng
1 NP1 Tròn, bé, lồi, bề mặt khô Trắng sữa 0,5 mm 2 NP2 Tròn, lồi, bóng Trắng sữa 1,0-1,5 mm
3 NP3 Rất bé, bóng Trắng trong
Mẫu đất 7 chủng
1 DP1 Tròn, lồi, bóng Trắng sữa 1,5 mm
2 DP2 Tròn, lồi, bề mặt khô, tâm ở giữa Trắng sữa 1,2-1,5 mm 3 DP3 Tròn, lồi, bé, bóng Trắng ngà 0,5 mm 4 DP4 Tròn, nhỏ, bóng Trắng trong 0,3 mm 5 DP5 Tròn, dẹt, bóng Trắng sữa 1,0-1,3 mm 6 DP6 Rất bé, lồi, bóng Trắng trong 7 DP7 Tròn, bé, lồi, bóng Trắng sữa 0,2-0,4 mm Trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 2,2-DCPS chúng tôi đã chọn được 10 loại khuẩn lạc khác nhau đó có 7 chủng phân lập từ mẫu đất và 3 chủng phân lập từ mẫu nước. Hầu hết các khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng sữa đến trắng ngà, đường kính khuẩn lạc nhỏ từ 0,2 đến 1,5mm.
Bảng 6. Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường MGB bổ sung cơ chất 1,2-DCE
STT Kí hiệu Hình dạng khuẩn lạc Màu sắc Đƣờng kính (mm)
Mẫu nước 9 chủng
1 NE1 Tròn, to, dẹt, bóng, có tâm ở giữa
Trắng sữa 3,0 mm
2 NE2 To, lồi, bóng, rìa răng cưa. Trắng sữa Không xác định 3 NE3 To, dẹt, bóng. Trắng ngà Không xác định. 4 NE4 Tròn, lồi, bóng Trắng trong 1,0 mm
5 NE5 Dẹt, khô, có tâm ở giữa Trắng ngà Không xác định 6 NE6 Tròn, bé, lồi, bóng. Trắng sữa 0,5 mm
7 NE7 Tròn, rất bé, lồi, khô. Trắng sữa 0,2-0,3 mm 8 NE8 Rất bé, khô, có tâm ở giữa
9 NE9 Dẹt, khô Trắng đục Không xác định.
Mẫu đất 5 chủng
1 DE1 Tròn, bóng, nhầy. Vàng nhạt 1,5 mm
2 DE2 To, dẹt, rìa răng cưa. Trắng ngà Không xác định 3 DE3 Tròn, to, lồi, bóng Trắng ngà 3,0 mm
4 DE4 Rất bé, lồi, khô Trắng trong Không xác định 5 DE5 Trònm, bóng, lồi Trắng sữa 2,0 mm
Tương tự, 14 chủng chúng tôi phân lập được từ môi trường MGB có bổ sung cơ chất 1,2-DCE như trình này ở bảng trên cho thấy phần lớn các khuẩn lạc bóng, dẹt, có nhiều khuẩn lạc kích thước ko xác định.
Hình 8. Ảnh khuẩn lạc trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 1,2-DCE
Như vậy, từ các mẫu đất và nước thải thu được từ Sơn Đồng, huyện Hoài Đức, Hà Nội chúng tôi đã phân lập được tổng số 41 chủng vi sinh vật trên môi trường chọn lọc MGB thạch có bổ sung 3 loại cơ chất khác nhau. Số lượng chủng phân lập trên mỗi cơ chất được tóm tắt ở bảng 7.
Bảng 7. Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập được
Cơ chất Môi trƣờng thạch MGB
Mẫu nƣớc Mẫu đất
3,4-DCA 8 chủng 9 chủng
2,2-DCP 3 chủng 7 chủng
1,2-DCE 9 chủng 5 chủng
3.2. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất clo
Từ 41 chủng vi khuẩn phân lập chúng tôi tiến hành tuyển chọn các đại diện cho khả năng phân hủy cao đối với từng hợp chất chứa clo. Các chủng được tuyển chọn cần đáp ứng 2 tiêu chí đó là có khả năng sinh trường tốt trên môi trường chọn lọc MGB bổ sung cơ chất đồng thời có khả năng phân giải mạnh hợp chất clo thể hiện qua mức độ chuyển màu mạnh nhất trên môi trường thạch MGB có bổ sung Bromothymol blue.
Các khuẩn lạc phân lập được sau 3 ngày nuôi lắc trên môi trường MGB ở 30oC, 160rpm, dịch nuôi cấy được đo mật độ tế bào ở OD 620nm để xem khả năng
sinh trưởng và phát triển. Trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 3,4-DCA, kết quả cho thấy một số chủng NA1, NA4, NA7, DA1 có khả năng phát triển mạnh. Tuy vậy, kết hợp với kết quả chuyển màu trên môi trường thạch bổ sung Bromothymol blue (75mg/l) chúng tôi đã chọn ra được chủng NA4 với khả năng