Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy hợp chất chứa clo tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Nhật Ánh PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤT CHỨA CLO TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội – 2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Quang Huy, người Thầy tận tình hướng dẫn, bảo cho em kĩ nghiên cứu kiến thức cần thiết suốt thời gian học tập thực đề tài Bên cạnh Thầy tạo điều kiện học tập nghiên cứu tốt cho em để em hồn thành tốt luận văn Tiếp đến em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn cung cấp cho em kiến thức bổ ích suốt khóa học Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, anh chị, bạn, em sinh viên Bộ mơn Sinh lý thực vật Hóa Sinh, phịng Enzyme học Phân tích hoạt tính sinh học, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Protein Enzym, Trung tâm Nghiên cứu khoa học sống hướng dẫn giúp đỡ em thời gian em nghiên cứu phịng thí nghiệm Đề tài thực với hỗ trợ kinh phí đề tài mã số KLEPT 01-12 PGS.TS Nguyễn Quang Huy chủ trì ĐHQG Hà Nội, Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ enzym protein, em xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ quý báu Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên ủng hộ em suốt thời gian học tập q trình hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Nhật Ánh Nguyễn Thị Nhật Ánh Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Hợp chất halogen hợp chất clo hữu 1.1.1 Sự phổ biến hợp chất halogen tự nhiên .3 1.1.2 Ứng dụng hợp chất clo hữu 1.1.3 Sự ô nhiễm môi trường hợp chất clo hữu 1.1.4 Tác động hợp chất clo hữu môi trường người .7 1.1.5 Cách thức gây độc hợp chất clo hữu thể 1.2 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc halogen Việt Nam 10 1.3 Một số phương pháp xử lý ô nhiễm hợp chất clo hữu .12 1.3.1 Phương pháp vật lý 12 1.3.2 Phương pháp hóa học……………………………………………………… 12 1.3.3 Phương pháp sinh học .14 1.4 Vi sinh vật phân hủy hợp chất clo hữu 16 1.5 Tình hình nghiên cứu phân hủy hợp chất halogen vi sinh vật Việt Nam 18 1.6 Một số hợp chất clo hữu 19 1.6.1 Hợp chất 1,2 - Dichloroethane (1,2 - DCE) .19 1.6.2 Hợp chất 2,2-Dichloropropionate Sodium (2,2-DCPS) 20 1.6.3 Hợp chất 3,4-Dichloroaniline (3,4-DCA) .21 CHƢƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 Nguyên liệu .23 2.2 Hóa chất – Dụng cụ 23 2.2.1 Môi trường nuôi cấy .23 2.2.2 Hóa chất 24 2.3 Máy móc, thiết bị 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 Nguyễn Thị Nhật Ánh Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 2.4.1 Phương pháp thu mẫu 24 2.4.2 Phân lập vi sinh vật 24 2.4.3 Phương pháp bảo quản giống 25 2.4.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sử dụng hợp chất clo………………………………………………………………………………… 26 2.4.5 Phương pháp phân loại chủng nghiên cứu 26 2.4.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng nghiên cứu 27 2.4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường khả sử dụng số hợp chất clo lên chủng nghiên cứu .28 2.4.8 Đánh giá khả phân hủy hợp chất clo 30 2.4.9.Phương pháp thống kê sinh học……………………………………… ……30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả sử dụng số hợp chất clo 32 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sử dụng hợp chất clo .36 3.3 Đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu 37 3.3.1 Nhuộm Gram 37 3.3.2 Chụp hiển vi điện tử quét chủng nghiên cứu 38 3.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa chủng nghiên cứu sử dụng kit thử API 39 3.5 Phân loại chủng nghiên cứu phương pháp giải trình tự gen 16S ARNr 43 3.6 Ảnh hưởng số điều kiện môi trường lên khả sinh trưởng chủng nghiên cứu 45 3.6.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy………………………………………… 44 3.6.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 47 3.6.3 Ảnh hưởng nồng độ chất .48 3.7 Khả sử dụng hợp chất clo khác 50 3.8 Đánh giá khả phân hủy Cl- 51 3.8.1 Đường chuẩn Cl-…………………………………………………………….50 Nguyễn Thị Nhật Ánh Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 3.8.2 Khả phân hủy hợp chất 2,2 DCP chủng NP2 511 3.8.3 Khả phân hủy hợp chất 1,2 DCE chủng DE1 53 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ .55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Nguyễn Thị Nhật Ánh Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Cơng thức số thuốc hợp chất halogen hữu Hình Tác động thuốc BVTV đến môi trường Hình Cơng thức hóa học 1,2-DCE 19 Hình Cơng thức hóa học 2,2-DCPS .21 Hình Cơng thức hóa học 3,4-DCA 21 Hình Ảnh khuẩn lạc mơi trường MGB chất 3,4-DCA……………… 32 Hình Ảnh khuẩn lạc môi trường MGB chất 2,2-DCPS 34 Hình Ảnh khuẩn lạc môi trường MGB chất 1,2-DCE .36 Hình Ảnh phát triển khuẩn lạc mơi trường MGB bổ sung Bromothymol blue hợp chất clo tương ứng chủng NP2, NA4 DE1 .37 Hình 10 Ảnh hình thái chủng vi khuẩn kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100…………………………………………………………………… 37 Hình 11 Ảnh hình thái chủng vi khuẩn kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 10000 39 Hình 12 Sơ đồ phát sinh chủng loại chủng NA4 43 Hình 13 Sơ đồ phát sinh chủng loại chủng NP2 44 Hình 14 Sơ đồ phát sinh chủng loại chủng DE1 44 Hình 15 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng chủng NP2 .45 Hình 16 Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên sinh trưởng chủng NA4 46 Hình 17 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng chủng DE1 .46 Hình 18 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng chủng NP2 NA4 47 Hình 19 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng chủng DE1 48 Hình 20 Ảnh hưởng nồng độ chất lên sinh trưởng chủng NA4 .49 Hình 21 Ảnh hưởng nồng độ chất lên sinh trưởng chủng NP2 49 Hình 22 Ảnh hưởng nồng độ chất lên sinh trưởng chủng DE1 50 Hình 23 Đường chuẩn biểu thị phụ thuộc tuyến tính 51 Hình 24 Khả phân hủy chất 2,2-DCP chủng NP2 .52 Hình 25 Khả phân hủy chất 1,2-DCE chủng DE1 53 Nguyễn Thị Nhật Ánh Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Ứng dụng số hợp chất clo hữu Bảng Một số loại thuốc BVTV có nguồn gốc Clo sử dụng………… Bảng Giới hạn tối đa cho phép dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật nguồn gốc clo hữu đất 11 Bảng Đặc điểm khuẩn lạc phân lập môi trường MGB bổ sung chất 3,4DCA .32 Bảng Đặc điểm khuẩn lạc phân lập môi trường MGB bổ sung chất 2,2DCPS 33 Bảng Đặc điểm khuẩn lạc phân lập môi trường MGB bổ sung chất 1,2DCE 35 Bảng Số lượng chủng vi sinh vật phân lập 36 Bảng Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng nghiên cứu (kit API 20NE) 40 Bảng Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng nghiên cứu (kit API 50CHB) 41 Bảng 10 Khả phát triển chủng môi trường thạch MGB bổ sung loại chất khác nhau…………………………………………………………50 Nguyễn Thị Nhật Ánh Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt BVTV Bảo vệ thực vật 1,2- DCE 1,2-Dichloroethane 2,2-DCP 2,2-Dichloropropionate Sodium 3,4-DCA 3,4-Dichloroaninline MMY Minimal media containing yeast extract CMAI Chemical Market Associates Inc Nguyễn Thị Nhật Ánh Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm MỞ ĐẦU Hợp chất nhóm halogen hợp chất sử dụng rộng rãi công nghiệp, nông nghiệp, y học… Bên cạnh lợi ích mang lại việc sử dụng tràn lan thải mơi trường mà khơng có phương pháp xử lý triệt để gây hậu nghiêm trọng đến môi trường, hệ sinh thái sức khỏe người Việc áp dụng phương pháp vật lý, hóa học để giải tình trạng ô nhiễm gây hợp chất halogen cho hiệu cao song chi phí đắt địi hỏi công nghệ đại Phương pháp sinh học sử dụng khả phân giải vi sinh vật tự nhiên đánh giá tiềm cao không cho hiệu nhanh chóng mà cịn mang tính bền vững, tốn kém, thân thiện với mơi trường Trong tự nhiên tồn nhóm vi sinh vật có khả sử dụng hợp chất halogen để thực trình trao đổi chất, trì hoạt động sống thể, chuyển hóa hợp chất halogen từ dạng độc hại trở nên độc khơng cịn độc với mơi trường sinh thái người Việt Nam nước sản xuất nông nghiệp với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm thuận lợi cho phát triển trồng song thuận lợi cho phát sinh, phát triển sâu bệnh, cỏ dại gây hại mùa màng, hàng năm Việt Nam sử dụng lượng lớn hóa chất bảo vệ thực vật mà chủ yếu hợp chất nguồn gốc clo hữu Việc sử dụng tràn lan hợp chất dẫn đến tồn dư loại hợp chất lớn gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu việc ứng dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải hợp chất halogen để giải ô nhiễm môi trường, đồng thời nhận thấy tiềm phương pháp sinh học chúng tơi tiến hành thực đề tài “PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤT CHỨA CLO TẠI VIỆT NAM” với mục tiêu phân lập, xác định đặc điểm sinh học chủng có hoạt tính sử dụng hợp chất chứa clo Việt Nam Nguyễn Thị Nhật Ánh Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Chƣơng - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hợp chất halogen hợp chất clo hữu Các hợp chất halogen hữu lớp lớn chất hóa học tự nhiên tổng hợp, có chứa nhiều gốc halogen gồm Flo, Clo, Brom, Iot kết hợp với cacbon yếu tố khác Hợp chất hữu halogen sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực quan trọng đời sống công nghiệp, nông nghiệp, y học,… Ngày với phát triển nông nghiệp đại thực trạng sử dụng nhiều hóa chất bảo vệ thực vật có thành phần hợp chất halogen mà chủ yếu hợp chất có chứa clo Bên cạnh lợi ích to lớn diệt trừ sâu bệnh, tăng suất… việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật lại ảnh hưởng xấu đến môi trường, phá hủy bền vững hệ sinh thái tính độc hại, khó bị phân hủy, tích tụ đất, nước, động vật, thực vật, nghiêm trọng gây ảnh hưởng đến sức khỏe người 1.1.1 Sự phổ biến hợp chất halogen tự nhiên Số lượng hợp chất halogen tự nhiên phát tăng từ 30 loại năm 1968 lên gần 3.900 loại đầu năm 2000 Chúng tổng hợp từ sinh vật biển, vi khuẩn, nấm, thực vật, trùng số động vật có vú Ví dụ tảo, nấm, số cây, thực vật phù du sản xuất chloromethane, mối sản xuất chloroform Một số loại rau sản xuất bromomethane Trong rong biển người ta tìm thấy trăm loại hợp chất hữu halogen [34] Muối clo muối brom thường xuất thực vật, đất, mỏ địa chất; cháy rừng núi lửa sinh hợp chất halogen Lượng chloromethane toàn cầu tạo từ sinh khối triệu năm, lượng tổng hợp có 26.000 năm Núi lửa tạo khí hydro clorua (3 triệu / năm) hydro florua (11 triệu / năm), hai chất phản ứng với hợp chất hữu để hình thành hợp chất nhóm halogen [34] Nguyễn Thị Nhật Ánh Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 0.35 Khả sinh trưởng (OD 620nm) 0.3 0.25 0.2 NA4 0.15 0.1 0.05 0 25 50 100 150 200 Nồng độ 3,4-DCA (mg/l) Hình 20 Ảnh hưởng nồng độ chất lên sinh trưởng chủng NA4 Với chất 2,2-DCP, chúng tơi thực thí nghiệm với dải nồng độ từ 10 đến 80mM, dải nồng độ phù hợp với thí nghiệm thực tế nhiễm Kết hình 21 cho thấy chủng NP2 phát triển tốt nồng độ 40mM có khả phát triển nồng độ 60mM 80mM cao gấp 3, lần nồng độ chất sử dụng cho thí nghiệm phân lập tuyển chọn ban đầu (20mM) Khả sinh trưởng (OD 620nm) 0.3 0.25 0.2 0.15 NP2 0.1 0.05 0 10 20 40 60 80 Nồng độ 2,2-DCPS (mM) Hình 21 Ảnh hưởng nồng độ chất lên sinh trưởng chủng NP2 Với chất 1,2-DCE thí nghiệm dải nồng độ từ đến 20mM kết (hình 22) cho thấy nồng độ phù hợp cho sinh trưởng chủng DE1 10mM Nguyễn Thị Nhật Ánh 49 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 0.4 Khả sinh trưởng (OD620nm) 0.35 0.3 0.25 0.2 DE1 0.15 0.1 0.05 0 10 15 20 Nồng độ 1,2 DCE (mM) Hình 22 Ảnh hưởng nồng độ chất lên sinh trưởng chủng DE1 Khả sinh trưởng nồng độ cao gấp 3,4 lần so với nồng độ thí nghiệm ban đầu chủng nghiên cứu sở thuận lợi để ứng dụng vào việc xử lý nhiễm thực tế, mà mức độ ô nhiễm hợp chất clo cao 3.7 Khả sử dụng hợp chất clo khác Khả sử dụng hợp chất clo khác chủng vi sinh vật đánh giá thông qua khả phát triển môi trường MGB bổ sung chất 1,2DCE, 2,2-DCP, 3,4-DCA khả hình thành màu mơi trường MGB thạch có chất thị màu bromothymol blue Bảng 10 Khả phát triển chủng môi trường thạch MGB bổ sung loại chất khác Cơ chất thí nghiệm Chủng 1,2-DCE 2,2-DCP 3,4-DCA NP2 ++ ++ ± NA4 + + ++ DE1 ++ ++ + Ghi chú: ± Phát triển yếu, ++ phát triển mạnh, + phát triển/ có Nguyễn Thị Nhật Ánh 50 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Kết nghiên cứu cho thấy chủng phát triển chất 1,2-DCE 2,2-DCP tốt chất 3,4-DCA kết phù hợp với kết nghiên cứu S Amini cộng [56] 3.8 Đánh giá khả phân hủy Cl3.8.1 Đƣờng chuẩn ClTiến hành thiết kế xây dựng đường chuẩn Cl- theo phương pháp trình bày mục 2.4.8, sau xử lý số liệu phần mềm Excel Kết khoảng tuyến tính giá trị OD 453nm nồng độ Cl- thể hình 23 OD 453nm Đường chuẩn Cl1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 y = 111.64x + 0.2086 R2 = 0.9945 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 Nồng độ Cl- (mol/l) Hình 23 Đường chuẩn biểu thị phụ thuộc tuyến tính giá trị OD453nm hàm lượng Cl3.8.2 Khả phân hủy hợp chất 2,2 DCP chủng NP2 Đánh giá khả phân giải chất 2,2-DCPS chủng NP2 môi trường MGB thu kết sau: Nguyễn Thị Nhật Ánh 51 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 0.45 0.4 OD 453nm 0.35 0.3 0.25 NP2 0.2 0.15 0.1 0.05 0 Thời gian (ngày) Hình 24 Khả phân hủy chất 2,2-DCP chủng NP2 Kết nghiên cứu bước đầu cho thấy tốc độ phân giải chất chủng NP2 mạnh sau ngày nuôi cấy với hàm lượng Cl- tạo 1,70mM tương đương với 8,5% so với nồng độ chất 2,2-DCP ban đầu 20mM bị phân hủy Kết ngày nuôi cấy lượng Cl- tạo tăng chậm, đồng nghĩa với việc tốc độ phân giải chất chậm Điều giải thích giới hạn điều kiện mơi trường nuôi cấy lượng chất giảm dần, hiệu suất phân giải giảm dần Theo nghiên cứu Wen-Yong Wong Fahrul Huyop [63] khả phân giải 2,2-DCPS chủng Dw sau ngày nuôi cấy 10% (tương đương với nồng độ Cl- 100µM/1mM chất) Trong thời gian tới, chúng tơi hi vọng việc tối ưu môi trường nuôi cấy cho sinh enzyme phân giải 2,2DCPS chủng NP2 cho kết phân giải cao Nguyễn Thị Nhật Ánh 52 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 3.8.3 Khả phân hủy hợp chất 1,2 DCE chủng DE1 0.35 0.3 OD 453nm 0.25 0.2 DE1 0.15 0.1 0.05 0 12 24 48 Thời gian (giờ) Hình 25 Khả phân hủy chất 1,2-DCE chủng DE1 Kết hình 25 cho thấy, sau 48 ni cấy hàm lượng Cl- tạo chủng DE1 0,88 mM tương đương với 17,67% so với nồng độ chất 1,2 - DCE ban đầu 5mM bị phân hủy Kết định lượng Cl- tăng chậm ngày ni cấy Đặc tính dễ bay chất 1,2-DCE làm lượng lớn chất thời gian làm thí nghiệm nguyên nhân làm giảm nhanh hiệu suất phân giải vi khuẩn Chủng Ancylobacter aquaticus UV6 nghiên cứu Pillay (2011) khả phân giải 6,1mM 1,2-DCE sau 84 tương đương với 12,2 % chất bị phân hủy nuôi cấy môi trường tối thiểu bổ sung cao nấm men (MMY) 5mM 1,2-DCE [31] So với kết nghiên cứu chủng DE1 chúng tơi phân lập có khả phân giải 1,2-DCE tốt Đối với chủng NA4, q trình làm thí nghiệm hóa chất 3,4-DCA pha loãng Ethanol 90%, nên việc thực việc định lượng Clo tạo sau nuôi cấy phương pháp so màu chủng NP2 DE1 Ethanol làm ảnh hưởng đến phản ứng màu thyocinate [44] kết định lượng thiếu xác Trong nhiều nghiên cứu việc định lượng chất 3,4-DCA cịn lại mơi trường chủ yếu sử dụng phương pháp HPLC (High-performance liquid chromatography) [58, 60] Dự kiến thời gian tới tiến hành Nguyễn Thị Nhật Ánh 53 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm thực phương pháp định lượng để đánh giá khả phân giải chất 3,4DCA chủng NA4 Nguyễn Thị Nhật Ánh 54 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm KẾT LUẬN Từ kết thu rút số kết luận sau đây: Từ mẫu đất nướcthu thập xã Sơn Đồng, huyện Hoài Đức, Hà Nội khu vực ô nhiễm phân lập 41 chủng vi sinh vật môi trường MGB chất (1,2-DCE, 2,2-DCP, 3,4-DCP), tuyển chọn chủng NP2, NA4, DE1 có khả phân giải hợp chất clo mạnh Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa kết giải trình tự gen 16S ARNr kết luận chủng NA4 tương đồng 99% với loài Klebsiella Pseudomonia, chủng NP2 tương đồng 99% với loài Klebsiella oxytoca, chủng DE1 tương đồng 99% với loài Staphylococcus sciuri Chủng NP2 phát triển tốt sau ngày nuôi cấy, dải nhiệt độ 30-370C, nồng độ chất 2,2-DCPS 40mM Thời gian phát triển tối ưu chủng NA4 sau 10 ngày nuôi cấy, sinh trưởng tốt nhiệt độ từ 25-30°C, nồng độ chất 3,4-DCA phù hợp 25mg/l Tương tự điều kiện tối ưu cho chủng DE1 sau 12 nuôi cấy, nhiệt độ 25-30°C, nồng độ chất 1,2-DC 10mM Chủng NP2 có khả phân hủy 8,5% chất 2,2DCP sau ngày nuôi cấy Chủng DE1 có khả phân hủy 17,67% chất 1,2DCE sau 48 nuôi cấy KIẾN NGHỊ Phối hợp chủng phân lập việc ứng dụng phân giải nhóm hợp chất chứa clo khác Tìm hiểu chế phân giải hợp chất chứa clo từ chủng vi sinh vật phân lập tuyển chọn Nguyễn Thị Nhật Ánh 55 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Kiều Hữu Ảnh (2006), Giáo trình vi sinh vật học phần 1, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 81-82 Nguyễn Thị Kim Cúc; Phạm Việt Cường; Nguyễn Thị Tuyết Mai (2000), “Một số tính chất vi khuẩn phân hủy methyl parathion phân lập từ mẫu đất Hà Nội”, Hội nghị sinh học Quốc gia Những vấn đề nghiên cứu sinh học, Hà Nội, tr 29-34 Đào Hùng Cường, Nguyễn Minh Thiên, Nguyễn Trần Nguyên (2008), “Nghiên cứu xác định số hợp chất clo nước mặt, đất thuộc địa bàn thành phố Đà Nẵng”, Tạp chị Khoa học Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 6(29), tr 57-58 Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Bá Hữu, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đương Nhã, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Nguyên Quang (2008), “Khảo sát vi sinh vật vùng nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin khu vực sân bay Đà Nẵng khử độc đất nhiễm điều kiện phịng thí nghiệm”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(4A), tr.138-143 Lê Bảo Hưng (2012), “Nghiên cứu điều kiện phân tích hợp chất hữu clo PCB mẫu môi trường phương pháp GC-MS”, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007), “Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử loại clo Dehalococcoides mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sân bay Đà Nẵng kỹ thuật PCR-DGGE”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, 16, tr 41-45 Lô Thị Hồng Lê (2003), Nghiên cứu thực trạng sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật, tình hình sức khỏe người chuyên canh chè nông trường Sông Cầu xã Minh Lập - Đồng Hỷ - Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ Y học, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên Nguyễn Thị Nhật Ánh 56 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Nguyễn Trần Oánh (Chủ biên), TS Nguyễn Văn Viên, KS Bùi Trọng Thủy (2007), Giáo trình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, Trường Đại học Nông nghiệp, Hà Nội Trần Thị Vân Thi (2007), “Đánh giá tồn dư tích lũy hợp chất nhiễm chứa clo khó phân hủy vùng cửa sơng đầm phá Thừa Thiên Huế, miền Trung Việt Nam”, Báo cáo Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á, ĐHQGHN 10 Thông xã Việt Nam (2005), Loại bỏ dần 12 chất thải nguy hại khỏi sống 11 Tổng cục Môi trường Vụ Pháp chế (2008), Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật đất 12 Nguyễn Văn Tư (2003), Nghiên cứu số số hóa sinh, kiến thức hiểu biết, sức khỏe người sử dụng thuốc trừ sâu chuyên canh chè, Đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ, mã số B2001 – 04 – 08, Trường Đại học Y Khoa Thái Nguyên 13 Nguyễn Thành Yên (2010), Đánh giá trạng công nghệ xử lý chất thải nguy hại Việt Nam nay, Hội nghị Mơi trường tồn quốc lần thứ Ba, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 14 A Field & R Sierra-Alvarez (2004) “Biodegradability of chlorinated solvents and related chlorinated aliphatic compounds”, Rev Environ Sci Biotechnol, 3(3), pp 185–254 15 Allison N., Skinner A J., Cooper R A (1983), “The dehalogenases of a 2,2dichloropropionate degrading bacterium”, Journal General Microbiology, 129, pp 1283-1293 16 Ann Link (1991), “Chlorine, Pollution and the Parents of Tomorrow”, The Women's Environmental Network, 15(3), pp 68-70 17 Bayer A G (1987), Unpublished test on biodegradation of 3,4-DCA 18 Bergman, J G and Sanik, J Jr (1957), “Determination of trace amounts of chlorine in Naphtha”, Analytical Chemistry 29, pp 241-243 Nguyễn Thị Nhật Ánh 57 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 19 Berry E K M., Allison N., Skinner A J., Cooper R A (1979), “Degradation of the selective herbicide 2,2-dichloropropionate (Dalapon) by a soil bacterium”, Journal Genenal Microbiology, 110, pp 39- 45 20 Chiba K., Yoshida T., Norihiro I., Nishimura H., Imada C., Yashuda H., Sako Y., (2009), “Isolation of bacterium possessing a haloacid dehalogenase from marine sediment core”, Microbes and Environments, 24(3), pp 276279 21 Doucette W.J., Hall A J and Gorder K A (2010), "Emissions of 1, 2Dichloroethane from Holiday Decorations as a Source of Indoor Air Contamination", Ground Water Monitoring & Remediation, Vol 30 (1), pp 67–73 22 Dwivedi, A H and Pande, U C (2001), “Photochemical degradation of halogenated compounds A review”, Scientific reviews and Chemical Communications, (1), pp 41-65 23 Euro Chlor, Chlorine Industry Review 2007-2008, Belgium 24 European Union Risk Assessment Report (2006), 3,4-Dichloroaniline, 4, pp 202-448 25 Eyferth, D (2003), "The Rise and Fall of Tetraethyllead 2", Organometallics, 22 (25), pp 5154–5178 26 Fetzner S and Ligens F (1994), “Bacterial dehalogenases Biochemistry, genetics, and biotechnological application”, Microbiol Rev, 58 (4), pp 641685 27 Fortin N., Fulthorpe R R., Allen D G., Greer C W (1998), “Molecular analysis of bacterial isolates and total community DNA from kraft pulp mill effluent treatment systems”, Canadian Journal of Microbiology, 44(6), pp 537-46 28 Fred S Tanaka, Ronald G W (1973), “Hydrolysis of aqueous solutions of sodium 2,2-dichloropropionate under self- induced alkaline conditions”, Journal of Agriculture and Food chemistry, 21(2), pp 285-288 Nguyễn Thị Nhật Ánh 58 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 29 Gilden RC, Huffling K, Sattler B (2010), "Pesticides and health risks", J Obstet Gynecol Neonatal Nurs, 39 (1), pp.103–107 30 González Valasco J R., Aranzabal A., Lospez Fonseca R., Feret R., González- Marcos J A (2000), “Enhancement of the catalytic oxidation of hydrogen-lean chlorinated VOCs in the presence of hydrogen-supplying compounds”, Applied Catalysis B Environmental, 24(1), pp 33-43 31 Govender A Pillay B (2011), “Characterization of 1, 2-dichloroethane (DCA) degrading bacteria isolated from South African waste water”, African Journal of Biotechnology, 10(55), pp 11567-11573 32 Greaves, M P., Davies, H A and Marsh, J A (1981), “Effects of pesticides on soil microflora using dalapon as an example”, Arch Environ Contam Toxicol, 10(4), pp 437-49 33 Gribble, Gordon W (1994) "Natural Organohalogens - Many More Than You Think!", Journal of Chemical Education, 71(11), pp 907–911 34 Gribble, Gordon W (2003) "The Diversity of Naturally Occurring Organohalogen Compounds.", Chemosphere, 52, pp 289–297 35 Habe H, Ide K, Yotsumoto M, Tsuji H, Hirano H, Widada J, Yoshida T, Nojiri H, Omori T (2001), “Preliminary examinations for applying a carbazole-degrader, Pseudomonas sp strain CA10, to dioxin-contaminated soil remediation”, Journal of Bacteriology, 181(10), pp 105-113 36 Hamid AAA, Hamdan S, Ariffin AHZ, Huyop F (2010), “Molecular prediction of dehalogenase producing microorganism using 16S DNA analysis of 2,2 dichloropropionate degrading bacterium isolated from volcanic soil”, Journal of Biology Science, 10(3), pp 190-199 37 Hareland, W A., Crawford, R L., Chapman, P J and Dagley, S (1975), “Metalolic function and properties of a 4-hydroxyphenyl acetic acid 1hydroxylase from Pseudomonas acidovorans”, Journal of Bacteriology, 121, pp 272-285 Nguyễn Thị Nhật Ánh 59 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 38 Henschler, D (1994), “Toxicity of Chlorinated Organic Compounds: Effects of the Introduction of Chlorine in Organic Molecules”, Angew Chem., 33, pp 1920–1935 39 Hirsch P., Alexander M (1960), “Microbial decomposition of halogenated propionic and acetic acids”, Can j microbial, 6, pp 241-249 40 Horisaki T, Yoshida E, Kaori S, Takemura T, Yamane T and Nojiri H (2011), “Isolation and characterization of monochloroacetic acid – degradation bacteria”, J Gen Appl Microbiol, 57, pp 277-284 41 Hunkeler D., Aravena R., Berry-Spark K., and Cox E (2005), “Assessment of degradation pathways in an aquifer with mixed chlorinated hydrocarbon contamination using stable isotope analysis”, Environmental science & technology, Vol 39 (16), pp 7975-8111 42 I.C MacRae, Martin Alexander (1965), "Herbicide Degradation, Microbial Degradation of Selected Herbicides in Soil”, J Agric Food Chem., 13 (1), pp 72–76 43 Institute for Health and Consumer Protection (2006), Summary Risk Assessment Report of 3,4-DICHLOROANILINE (3,4-DCA), European Chemicals Bureau, Italy 44 Iwaji Iwasaki, Satori Utsumi, Takejiro Ozawa (1952), “New Colorimetric Determination of Chloride using Mercuric Thiocyanate and Ferric Ion”, Bulletin of The Chemical Society of Japan, 25(3), pp.226 45 Jacobus, C H and Sybe, H., (1999), “Monooxygenase-mediated 1,2- Dichloro ethane degradation by Pseudomonas sp strain DCA1”, Apply Environ Microbiol, 65(6), pp 2466-2470 46 Janssen D B., Pries F., van der Ploeg J., Kazemier B., Terpstra P., Witholt B (1989), “Cloning of 1, 2-dichloroethane degradation genes of Xanthobacter autotrophicus GJ10 and expression and sequencing of the dhlA gene”, Journal of Bacteriology, 171, pp 91-99 47 Kurihara T (2011), “A Mechanistic analysis of enzymatic degradation of Organohalogen Compounds”, Biosci Bitechnol Bioche, 75(2), pp.189-198 Nguyễn Thị Nhật Ánh 60 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 48 Lauralynn, T McKernan, Avima M Ruder, Martin R Petersen, Misty J Hein (2008), “Biological exposure assessment to tetrachloroethylene for workers in the dry cleaning industry’’, Environmental Health, 7(12), pp 159-162 49 Lee, Fournier (1978), “A study on the evolution of 3,4-DCA and TCAB in some selected soils, degradation of 14C-3, 4-DCA and 14C-TCAB”, Journal Korean Agricutural Chemical Society, 2, pp 71-80 50 Marzorati M, Balloi A, Ferra F, Corallo L, Carpani G, Lieven W, Verstraete W Daffonchio D (2010), “Bacterial diversity and reductive dehalogenase redundancy in a 1,2-dichloroethane degrading bacterial consortium enriched from a contaminated aquifer, Microbial Cell Factories, 9, pp 12 51 Mowafy AM, Kurihara T, Kurata A, Uemura T, Esaki N (2010), “2haloacrulate Hydratase, a new class of flavoenzyme that catalyzes the addition of water to the substrate for dehalogenation”, Appl Environ Microbiol, 76(18), pp 6032-6037 52 Niki Gupta (2009), Chlorine in Medicine, India 53 Ordóđez S., Sastre H., Dı́ez F V (2001), “Catalytic hydrodechlorination of tetrachloroethylene over red mud”, Journal of Hazardous Materials, 81(1-2), pp 103-114 54 Poland A, Greenlee WF, Kende AS (1979), “Studies on the mechanism of action of the chlorinated dibenzo-p-dioxins and related compounds”, Ann N Y Acad Sci., 31, pp 214–230 55 Rodriguez L N H Khan F., Robins K T., Meyer H P (2011), “Perspectives on Biotechnological halogenation”, Scientific article, 1, pp 31 56 S Amini, A.H Zulkifly, Wong Wen-Yong and F Huyop (2011), “Molecular Identification and Characterization of a Bacterium that has Potential to Degrade Haloalkanoic Acid”, Research Journal of Microbiology, 6, pp 552-559 57 Sylvain Brisse, Francine Grimont and Patrick A D Grimont (2006), Prokaryotes, 6, chapter 3.3.8 The Genus Klebsiella, pp.159-196 Nguyễn Thị Nhật Ánh 61 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 58 Tian Li, Xin- Ping Deng, Jin- Jun Wang, Hui Zhao Lei Wang, Kun Qian (2012), “Biodegradation of 3,4-Dichloroaniline by a Novel Myroides odoratimimus strain LWD09 with moderate salinity tolerance”, Water Air Soil Polluttion, 223, pp 3271-3279 59 Tixier C., Sancelme M., Ait-Aissa S., Widehem P., Bonnemoy F., Cuer A., Truffaut N., Veschambre H (2002), “ Biotransformation of phenylurea herbicides by a soil bacterial strain, Arthrobacter sp N2 structure, ecotoxicity and fate of diuron metabolite with soil fungi”, Chemosphere, 46(4), pp 519-526 60 Travkin VM, Solyanikova IP, Rietjens IM, Vervoort J, van Berkel WJ, Golovleva LA (2003), “Degradation of 3,4-dichloro- and 3,4-difluoroaniline by Pseudomonas fluorescens 26-K”, J Environ Sci Health B., 38(2), pp.121-32 61 Van den Wijngaard A.J., Van der KampK W H J., Van der Ploeg J., Pries F., Kazemier B., Janssen D B (1992), “Degradation of 1, 2-Dichloroethane by Ancylobacter aquaticus and other facultative methylotrophs”, Applied and Environmental Microbiology, 58(3), pp 976-983 62 Vinyl Environmental Council (2007), PVC Leads Climate Change Mitigation and Risk Reduction for Sustainable Development, Japan 63 Wen, Y W and Fahrul, H (2012), “Molecular identification and characterization of Dalapon-2,2-dichloropropionate (2,2 DCP) degrading bacteria from a rubber estate agricultural area”, African Journal of Microbiology Research, 6(7), pp 1520-1526 64 Wildeman S D and Verstraete W (2003) "The quest for microbial reductive dechlorination of C2 to C4 chloroalkanes is warranted", Applied Microbiology and Biotechnology, Vol 61 (2), pp 94–102 65 World Health Organization (1993), Persistent Organic Pollutants 66 Xie-Feng Yao, Fazlurrahman K., Rinku P., Janmejay P., Roslyn G M., Rakesh K J., Jian-Hua Guo, Robyn J R., John G O., Gunjan P (2011), “Degradation of dichloroaniline isomers by a newly isolated strain, Bacillus megaterium IMT21”, Microbiology, 157, pp 721-726 Nguyễn Thị Nhật Ánh 62 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 67 Yadav J S and Reddy C A (1993), “Mineralization of 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and mixtures of 2,4-D and 2,4,5trichlorophenoxyacetic acid by Phanerochaete chrysosporium”, Applied and Environmental Microbiology, 59, pp 2904-2908 68 Young M K., Kunbawui P., Won C K., Jae H S, Jang E K., Heui D P., Koo R (2007), “Cloning and characterization of a catechol degrading gene cluster from 3,4-dichloroaniline degrading bacterium Pseudomonas sp KB35B”, Journal of Agricultural and Food chemistry, 55, pp 4722-4727 Website 69 http//www.trangvangnongnghiep.com/bao-ve-thuc-vat/11009-thuoc-nhomclo-huu-co.html 70 http //vietbao.vn/Khoa-hoc/ 71 http//suckhoedoisong.vn/2010060404122443p0c14/thuoc-bao-ve-thuc-vatdang-hoa-chat-loi-it-hai-nhieu.htm 72 http//www.eurochlor.org/ 73 http//www.substech.com/dokuwiki/ 74 http//ytehagiang.org.vn/old/index.php?option=com_content&view=article&i d=423:tachaithuocbaovethucvatdenconnguoi&catid=94 75 http//phantichmoitruong.com 76 http//nicotex.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=154:coche-tac-dong-cua-thuoc-bao-ve-thuc-vat&catid=44:tai-lieu-thamthao&Itemid=66 77 http//www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_ENCB5696598.htm 78 http//greensol.com.vn/nuoc-cap/82-giai-phap-khu-clo-trong-nuoc Nguyễn Thị Nhật Ánh 63 Khóa 2011-2013 ... pháp sinh học tiến hành thực đề tài “PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤT CHỨA CLO TẠI VI? ??T NAM? ?? với mục tiêu phân lập, xác định đặc. .. pháp phân loại chủng nghiên cứu 26 2.4.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng nghiên cứu 27 2.4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường khả sử dụng số hợp chất clo lên chủng nghiên. .. 3,4-DCA chủng chủng 2,2-DCP chủng chủng 1,2-DCE chủng chủng 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sử dụng hợp chất clo Từ 41 chủng vi khuẩn phân lập tiến hành tuyển chọn đại diện cho khả phân hủy