Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải phế phụ phẩm sau thu hoạch để tạo chế phẩm dùng trong sản xuất phân bón hữu cơ tại đồng ruộng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐINH HỒNG DUYÊN TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PHẾ PHỤ PHẨM SAU THU HOẠCH ĐỂ TẠO CHẾ PHẨM DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ TẠI ĐỒNG RUỘNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐINH HỒNG DUYÊN TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PHẾ PHỤ PHẨM SAU THU HOẠCH ĐỂ TẠO CHẾ PHẨM DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ TẠI ĐỒNG RUỘNG Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Nguyễn Xuân Thành PGS.TS Phạm Văn Toản Hà Nội - Năm 2011 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết đầy đủ Chữ viết tắt ADNr Axit deoxyribonucleic riboxom ARNr Axit ribonucleic riboxom CEC Cacboxyetyl xenluloza CFU Colony forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CMC Carboxy methyl cellulose (Cacboxy metyl xenluloza) CTĐC Công thức đối chứng CTTN Công thức thí nghiệm CV 5% Sai số thí nghiệm EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid (Axit etylen diamin tetra axetic) ETS Externally Transcribed Spacer (Khoảng chép bên ngoài) G+C Guanin + Cytozin IGS Inter Genic Spacer ISP International Streptomyces Project (Chƣơng trình xạ khuẩn quốc tế) ITS Internal Transcribed Spacer (Khoảng hai đoạn gen chép) LSD 5% Least Significance difference (Sai khác cơng thức có ý nghĩa) MMTCE Million Metric Tons of Carbon Equivalent (triệu cacbon tƣơng đƣơng) MPN Most probable number (Số lƣợng chắn có thể) NSHH Nốt sần hữu hiệu NSTT Năng suất thực thu NTS Non - Transcribed Spacer (Khoảng không chép) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PDA Potato- dextrose - agar (Khoai tây - glucoza - thạch) SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) TAE Tris-axit axetic - axit etylenediaminetetra axetic TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam VSV Vi sinh vật YS Yeast extract-soluble starch (Tinh bột tan - cao nấm men) i DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Bảng 1.1 Ƣớc tính khối lƣợng nguồn phế phụ phẩm nơng nghiệp Việt Nam Bảng 1.2 Trang Giá trị dinh dƣỡng số phế phụ phẩm nông nghiệp Việt Nam Bảng 1.3 Hàm lƣợng lipit số rau Bảng 1.4 Các chủng vi sinh vật đống ủ 40 Bảng 1.5 Nhiệt độ thời gian chết số loài vi sinh vật 41 Bảng 2.1 Địa điểm lấy mẫu phân lập vi sinh vật xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp 61 Bảng 3.1 Hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật thuộc nhóm an tồn 91 Bảng 3.2 Đặc điểm chủng XX-7 nuôi cấy môi trƣờng khác 94 Bảng 3 So sánh đặc điểm phân loại chủng XX-7 với S.griseoflavus Waksman Henrici 1948 Bảng 3.4 97 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng sinh enzym ngoại bào chủng VP-14, XX-7, NT-18 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng sinh enzym ngoại bào chủng VP-14, XX-7, NT-18 Bảng 3.6 106 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ đến sinh trƣởng sinh enzym ngoại bào chủng VP-14, XX-7, NT-18 Bảng 3.9 104 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến sinh trƣởng sinh enzym ngoại bào chủng VP-14, XX-7, NT-18 Bảng 3.8 103 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng sinh enzym ngoại bào chủng VP-14, XX-7, NT-18 Bảng 3.7 101 107 Mật độ hoạt tính enzym ngoại bào VP-14, XX-7, NT-18 ni cấy riêng lẻ hỗn hợp chất mang cám gạo khử trùng ii 109 Bảng 3.10 Mật độ hoạt tính enzym ngoại bào VP-14, XX-7, NT-18 nuôi cấy riêng lẻ hỗn hợp môi trƣờng dịch thể 110 Bảng 3.11 Chất lƣợng chế phẩm vi sinh vật dạng bột 114 Bảng 3.12 Chất lƣợng chế phẩm vi sinh vật dạng dịch 114 Bảng 3.13 Kết phân tích rơm rạ cơng thức thí nghiệm sau 40 ngày 117 Bảng 3.14 Diễn biến nhiệt độ đống ủ loại phế phụ phẩm nông nghiệp khác 121 Bảng 3.15 Kết phân tích phế phụ phẩm nơng nghiệp trƣớc sau xử lý 124 Bảng 3.16 Chất lƣợng phân hữu tái chế từ phế phụ phẩm nông nghiệp 128 Bảng 3.17 Sinh vật gây bệnh đống ủ rơm rạ 129 Bảng 3.18 Tính chất nơng hóa học loại đất thực nghiệm với lúa nƣớc 131 Bảng 3.19 Tính chất nơng hóa học loại đất thực nghiệm với đậu tƣơng 132 Bảng 3.20 Hiệu phân hữu tái chế từ phế phụ phẩm nơng nghiệp bón cho lúa xuân huyện Nam Sách, Hải Dƣơng 134 Bảng 3.21 Hiệu phân hữu tái chế từ phế phụ phẩm nơng nghiệp bón cho lúa xn huyện Gia Lâm - Hà Nội 135 Bảng 3.22 Hiệu phân hữu tái chế từ phế phụ phẩm nơng nghiệp bón cho lúa xn huyện Hiệp Hòa - Bắc Giang 137 Bảng 3.23 Hiệu phân hữu tái chế từ phế phụ phẩm nơng nghiệp bón cho đậu tƣơng huyện Hiệp Hòa - Bắc Giang 140 Bảng 3.24 Hiệu phân hữu tái chế từ phế phụ phẩm nông nghiệp bón cho đậu tƣơng huyện Gia Lâm - Hà Nội 141 Bảng 3.25 Hiệu phân hữu tái chế từ phế phụ phẩm nông nghiệp bón cho đậu tƣơng huyện Nam Sách - Hải Dƣơng iii 143 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc phân tử xenluloza 21 Hình 1.2 Sự biến động nhiệt độ pH theo thời gian ủ 35 Hình 1.3 Sự biến động quần thể vi sinh vật suốt trình ủ phân vỏ 41 Hình 1.4 Cấu trúc nhóm gen ARNr 59 Hình 1.5 Sơ đồ biểu diễn phả hệ 59 Hình 2.1 Đƣờng chuẩn nồng độ glucoza 69 Hình 2.2 Đƣờng chuẩn tyrosine 71 Hình 2.3 Mơ hình cấy vạch nghiên cứu tính đối kháng 78 Hình 3.1 Tỷ lệ VSV có hoạt tính enzym tổng số VSV phân lập đƣợc 89 Hình 3.2 Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng VP-14 92 Hình 3.3 Hình thái cuống sinh bào tử, bào tử khuẩn lạc chủng XX-7 93 Hình 3.4 Hình dạng quan sinh sản chủng NT-18 95 Hình 3.5 Vị trí phân loại chủng VP-14 với lồi có quan hệ họ hàng gần 96 Hình 3.6 Vị trí phân loại chủng XX-7 với lồi có quan hệ họ hàng gần 98 Hình 3.7 Vị trí phân loại chủng NT-18 với lồi có quan hệ họ hàng gần 99 Hình 3.8 Quy trình sản xuất chế phẩm dạng dịch từ VP-14 112 Hình 3.9 Quy trình sản xuất chế phẩm dạng bột từ XX-7 NT-18 113 Sơ đồ 3.1 Quy trình xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp đồng ruộng 118 Hình 3.10 Diễn biến nhiệt độ đống ủ rau 122 Hình 3.11 Diễn biến nhiệt độ đống ủ rơm rạ 122 Hình 3.12 Diễn biến nhiệt độ đống ủ vỏ hành tỏi 123 Hình 3.13 Sự biến động OC% trƣớc sau ủ 125 Hình 3.14 Sự biến động hàm lƣợng photpho trình ủ 126 Hình 3.15 Sự biến động hàm lƣợng kali trình ủ 127 iv MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn Danh mục ký hiệu chữ viết tắt ii iii Danh mục bảng iv Danh mục hình vẽ, đồ thị Mục lục vi vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI NIỆM THUẬT NGỮ 1.2 KHỐI LƢỢNG VÀ THÀNH PHẦN PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP 1.2.1 Phụ phẩm từ sản xuất nông nghiệp lƣơng thực rau màu 1.2.2 Phụ phẩm từ sản xuất ngành mía đƣờng .9 1.2.3 Phụ phẩm từ sản xuất ngành cà phê 11 1.3 BIỆN PHÁP XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP .11 1.3.1 Đốt 11 1.3.2 Ủ làm phân 13 1.3.3 Biện pháp vùi trực tiếp vào đất, ruộng .16 1.3.4 Biện pháp tái sử dụng tạo sản phẩm hữu ích khác 18 1.4 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA Q TRÌNH PHÂN GIẢI PHẾ PHỤ PHẨM NƠNG NGHIỆP 19 1.4.1 Hệ thống enzym vi sinh vật 19 1.4.2 Cơ sở khoa học trình phân hủy 20 1.4.2.1 Phân giải xenluloza 20 1.4.2.2 Phân giải tinh bột 26 1.4.2.3 Phân giải protein 29 1.4.2.4.Phân giải hemixenluloza .30 1.4.2.5 Phân giải lignin 32 1.4.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình xử lý phế thải làm phân bón .33 1.4.3.1 Yếu tố phi sinh học 34 1.4.3.2 Yếu tố sinh học 38 1.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ PHẾ THẢI LÀM PHÂN BÓN VÀ CÁC SẢN PHẨM TÁI SỬ DỤNG KHÁC 43 1.5.1 Nghiên cứu giới 43 v 1.5.2 Nghiên cứu Việt Nam 46 1.5.3 Vai trò phân hữu 53 1.6 PHÂN LOẠI VI SINH VẬT XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP 56 1.6.1 Phƣơng pháp phân loại thông thƣờng 57 1.6.2 Phƣơng pháp phân loại đại 57 1.6.2.1 Hoá phân loại .57 1.6.2.2 Sinh học phân tử 58 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 61 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 61 2.1.1 Mẫu phế thải 61 2.1.2 Giống 61 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị hóa chất .61 2.1.4 Môi trƣờng 62 2.2 PHƢƠNG PHÁP 65 2.2.1 Phân lập vi sinh vật từ mẫu phế thải 65 2.2.2 Đánh giá đặc tính sinh học chủng vi sinh vật 65 2.2.2.1 Xác định thời gian nuôi cấy chủng vi sinh vật 65 2.2.2.2 Xác định hình thái, kích thƣớc khuẩn lạc hình thái vi sinh vật .65 2.2.2.3 Lựa chọn mơi trƣờng thích hợp 66 2.2.2.4 Ảnh hƣởng nguồn cacbon nitơ 67 2.2.2.5 Ảnh hƣởng pH ban đầu 67 2.2.2.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ ban đầu 67 2.2.2.7 Xác định hoạt tính enzym phƣơng pháp khuếch tán thạch 68 2.2.2.8 Định lƣợng enzym 68 2.2.3 Bảo quản giống 72 2.2.4 Phân loại vi sinh vật phƣơng pháp sinh học phân tử 72 2.2.4.1 Đọc trình tự ADNr .72 2.2.4.2 Xây dựng phát sinh chủng loại 77 2.2.5 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật .78 2.2.5.1 Nguyên liệu chế tạo chất mang 78 2.2.5.2 Nghiên cứu tính đối kháng chủng vi sinh vật 78 2.2.5.3 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật 79 2.2.6 Các phƣơng pháp phân tích vi sinh vật, sinh vật 80 2.2.6.1 Kiểm tra mật độ tế bào vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm 80 vi 2.2.6.2.Kiểm tra vi sinh vật tạp 80 2.2.6.3 Kiểm tra mật độ Colifom .80 2.2.6.4 Kiểm tra mật độ Salmonella .80 2.2.6.5 Kiểm tra mật độ E.coli 81 2.2.6.6 Xác định trứng giun .82 2.2.7 Phân tích tiêu lý tính, hố tính 82 2.2.7.1 Các tiêu lý tính .82 2.2.7.2 Các tiêu hố tính .83 2.2.8 Nghiên cứu hiệu chế phẩm vi sinh vật 83 2.2.8.1 Thí nghiệm chậu vại .83 2.2.8.2 Thử nghiệm hiệu chế phẩm vi sinh vật đống ủ phế phụ phẩm nông nghiệp .83 2.2.9 Thực nghiệm hiệu phân hữu tái chế từ phế phụ phẩm nông nghiệp đồng ruộng 84 2.2.9.1 Hiệu thực nghiệm bón phân cho lúa giống KD18 84 2.2.9.2 Hiệu thực nghiệm bón phân cho đậu tƣơng giống ĐT84 .86 2.2.10 Phƣơng pháp phân tích xử lý số liệu 87 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 88 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT 88 3.1.1 Phân lập vi sinh vật có khả phân huỷ xenluloza, tinh bột, protein .88 3.1.1.1 Phân lập vi sinh vật phân huỷ xenluloza 88 3.1.1.2 Phân lập vi sinh vật phân huỷ tinh bột 89 3.1.1.3 Phân lập vi sinh vật phân huỷ protein 90 3.1.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân huỷ phế phụ phẩm nông nghiệp 90 3.2 PHÂN LOẠI VÀ ĐỊNH TÊN VI SINH VẬT 92 3.2.1 Đặc điểm hình thái, kích thƣớc 92 3.2.2 Giải trình tự ADNr16S phân loại vi sinh vật 95 3.2.2.1 Chủng VP-14 96 3.2.2.2 Chủng XX-7 97 3.2.2.3 Chủng NT-18 .99 3.3 KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐÃ LỰA CHỌN 100 3.3.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy khác 100 vii 3.3.2 Ảnh hƣởng pH ban đầu nhiệt độ 102 3.3.3 Ảnh hƣởng nguồn chất 105 3.4 SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT .108 3.4.1 Nghiên cứu tính đối kháng chủng vi sinh vật tuyển chọn 108 3.4.2 Khả tồn chủng vi sinh vật môi trƣờng nuôi cấy hỗn hợp chủng .108 3.4.2.1 Trong điều kiện chất mang dạng bột 108 3.4.2.2 Trong điều kiện chất mang dạng lỏng 110 3.4.3 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật 111 3.4.4 Đánh giá chất lƣợng chế phẩm vi sinh vật sau sản xuất thời gian bảo quản 114 3.5 XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP BẰNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT .117 3.5.1 Kết thí nghiệm chậu vại 117 3.5.2 Kết xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp chế phẩm vi sinh vật .118 3.5.2.1 Diễn biến nhiệt độ đống ủ .120 3.5.2.2 Chất lƣợng đống ủ sau xử lý 124 3.5.3 Kiểm tra, đánh giá sinh vật gây bệnh đống ủ 129 3.6 HIỆU QUẢ CỦA PHÂN HỮU CƠ TÁI CHẾ TỪ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP TRÊN ĐỒNG RUỘNG 130 3.6.1 Tính chất nơng hố học đất thực nghiệm 130 3.6 Hiệu phân hữu tái chế từ phế phụ phẩm nông nghiệp 133 3.6.2.1 Hiệu thực nghiệm bón phân cho lúa nƣớc .133 3.6.2.2 Hiệu thực nghiệm bón phân cho đậu tƣơng 139 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 146 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ Error! Bookmark not defined LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 148 PHỤ LỤC .162 viii ... ĐINH HỒNG DUYÊN TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PHẾ PHỤ PHẨM SAU THU HOẠCH ĐỂ TẠO CHẾ PHẨM DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ TẠI ĐỒNG RUỘNG Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số:... mùn hữu vi? ??c làm quan trọng cần thiết Xuất phát từ thực tế tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Tuyển chọn vi sinh vật có khả phân giải phế phụ phẩm sau thu hoạch để tạo chế phẩm dùng sản xuất phân bón. .. trƣờng từ đồng ruộng Để có chế phẩm vi sinh vật tốt xử lý phế phụ phẩm đồng ruộng vi? ??c phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sản sinh enzym ngoại bào xenlulaza, proteaza, amylaza… để chuyển