... chủng vi khuẩn, nấm men có khả lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh thơm ngon, bổ dƣỡng Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh. .. vi sinh vật lên men kombucha môi trƣờng nƣớc chè đƣờng Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: Tuyển chọn vi sinh vật có khả lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn số... Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh 26 3.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh acid acetic 26 3.1.1.1 Phân lập vi khuẩn
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ---------- ĐINH THỊ TUYẾT TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN KOMBUCHA TỪ CHÈ NGỌC THANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tổ Thực vật – Vi sinh, Trƣờng Đại hoc Sƣ phạm Hà Nội 2, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu đề này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thƣ viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân, những ngƣời luôn quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài. Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Đinh Thị Tuyết năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây là kết quả của riêng tôi. Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử ly thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dƣới sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung. Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình. Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Xin trân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Đinh Thị Tuyết năm 2015 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ........................................................................................................ 1 2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 2 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ....................................................................... 2 4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................. 2 5. Điểm mới của đề tài ................................................................................................... 2 NỘI DUNG. CHƢƠNG 1 ................................................................................................. 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3 1.1.1. Quá trình lên men kombucha ........................................................................ 4 1.2.2. Thành phần và công dụng của kombucha ..................................................... 5 1.2.1. Chè Ngọc Thanh, Phúc Yên, Vĩnh Phúc ....................................................... 6 1.2.1.1. Đặc điểm sinh thái, sinh sản của cây chè................................................ 6 1.2.1.2. Thành phần hóa học của lá trà ............................................................... 7 1.2.2. Hệ vi sinh vật ............................................................................................... 8 1.2.2.1. Giống vi khuẩn Acetobacter .................................................................. 9 1.2.2.2. Giống vi khuẩn lên men lactic ........................................................... 10 1.2.2.3. Nấm men ............................................................................................ 11 1.3.1. Trên thế giới............................................................................................... 12 1.3.2. Ở Việt Nam ................................................................................................ 14 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 17 2.1.1. Mẫu thực vât .............................................................................................. 17 2.1.2. Mẫu vi sinh vật........................................................................................... 17 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 17 2.1.4. Hóa chất và các loại môi trƣờng ................................................................. 17 2.1.5. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................... 18 2.1.6. Thời gian, địa điểm nghiên cứu .................................................................. 18 2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh ................................................................................... 18 2.2.1.1. Phƣơng pháp phân lập ......................................................................... 18 2.2.1.2. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram, nhuộm đơn. ....... 19 2.2.1.3. Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào sống trên thạch đĩa. ........................ 20 2.2.1.4. Bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng............................................ 20 2.2.1.5. Phƣơng pháp hoạt hóa giống................................................................ 20 2.2.1.6. Phƣơng pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men ......................... 21 2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh ................................................................................ 21 2.2.2.1. Phƣơng pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH có phenolphtalain 0,1% làm chỉ thị ....................................................... 21 2.2.2.2. Đo hàm lƣợng chất khô bằng khúc xạ kế ............................................. 21 2.2.2.3. Phát hiện hoạt tính catalaza.................................................................. 22 2.2.2.4. Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic ................................................ 22 2.2.2.5. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose ................................................. 22 2.2.3. Phƣơng pháp cảm quan .............................................................................. 23 2.2.4. Phƣơng pháp phân tích thống kê................................................................. 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................................... 26 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh ....................................................................................................... 26 3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic ............. 26 3.1.1.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter............................................................. 26 3.1.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha tốt .......... 34 3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men ......................................................... 35 3.1.2.1. Phân lập các chủng nấm men ............................................................... 35 3.1.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha tốt ......... 36 3.2. Động thái sinh trƣởng chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 ..................... 39 3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến lên men kombucha.......................... 40 3.3.1. Nhiệt độ lên men ........................................................................................ 40 3.3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng tới quá trình lên men kombucha ............ 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 45 1. Kết luận .................................................................................................................. 45 2. Kiến nghị ................................................................................................................ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 46 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của lá trà ............................................................................. 8 Bảng 2.1. Công thức của các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu ...... 18 Bảng 2.2. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha ................. 24 Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu................................................. 25 Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ........................ 23 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng phân lập đƣợc .......... 28 Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính 9 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ dịch trà Kombucha từ chè Ngọc Thanh ....................................... 34 Bảng 3.3. Bảng hàm lƣợng acid tổng số và chất lƣợng cảm quan sản phẩm của 9 chủng vi khuẩn ........................................................ 35 Bảng 3.4. Kết quả phân lập các chủng nấm men ........................................... 36 Bảng 3.5. Hoạt lực lên men của các chủng nấm men .................................... 37 Bảng 3.6. Quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 ........................................................................................ 39 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sản phẩm trà Kombucha ................................................................. 3 Hình 1.2. Lá chè tƣơi...................................................................................... 7 Hình 3.1. Lá chè thu mẫu ............................................................................. 27 Hình 3.2. Dịch kombucha lên men tự nhiên từ chè Ngọc Thanh ................... 27 Hình 3.3. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A7 (x1000) ................................ 29 Hình 3.4. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A5 (x1000 ) ................................ 29 Hình 3.5. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A1 (x1000) ................................ 30 Hình 3.6. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A4 (x1000) ................................ 30 Hình 3.7. Khả năng oxy hóa acetate của chủng vi khuẩn A1 ........................ 30 Hình 3.8. Định tính acid acetic ..................................................................... 31 Hình 3.9. Thử hoạt tính catalaza ................................................................... 32 Hình 3.10. Mẫu màng thử hoạt tính phát hiện khả năng tổng hợp cellulose .. 33 Hình 3.11. Hình thái tế bào học chủng nấm men M1 (x1000) ....................... 37 Hình 3.12. Hình thái tế bào học chủng nấm men M2 ( x1000) ...................... 37 Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn chiều cao cột kết lắng của các chủng nấm men........................................................................................... 38 Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 .......................................................... 39 Hình 3.15. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót ở các nhiệt độ lên men .................................................................................. 40 Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ở các nhiệt độ lên men ......................................................................... 41 Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 9 ngày lên men ở các nhiệt độ khác nhau ....................................... 41 Hình 3.18. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót phụ thuộc vào hàm lƣợng đƣờng ................................................................. 42 Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số phụ thuộc vào hàm lƣợng đƣờng ....................................................... 43 Hình 3.20. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau....................................................... 43 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 1. ATP Adenozin triphotphat 2. STT Số thứ tự 3. SCOBY Symbiotic colony of Bacteria and Yeast 4. NADP Nicotiamide adenine 5. Nxb Nhà xuất bản 6. TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Cùng với xu hƣớng phát triển mới, khi vấn đề sức khỏe con ngƣời đƣợc đặt lên hàng đầu, thì các loại thực phẩm gần gũi với thiên nhiên ngày càng đƣợc ƣa chuộng. Trong đó dòng sản phẩm lên men đang dần chiếm ƣu thế. Đối với ngƣời Việt Nam, trà đã trở nên khá quen thuộc và gần gũi. Đã có nhiều loại thức uống đƣợc chế biến từ trà nhƣng sản phẩm trà lên men thì hầu nhƣ còn mới với ngƣời Việt Nam. Trà lên men Kombucha là loại đồ uống thông dụng và phổ biến ở các nƣớc Đông Âu, nó đƣợc biết đến là một loại đồ uống có lợi cho sức khỏe. Kombucha là một cấu trúc có dạng nhƣ thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn. Trên thế giới, kombucha đƣợc sản xuất trên quy mô công nghiệp và đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu liên quan. Ở Việt Nam đã có bán các loại kombucha dƣới dạng đóng chai, đồ hộp, nƣớc giải khát nhập khẩu từ nƣớc ngoài.... Lên men kombucha tại các hộ gia đình mới chỉ manh nha xuất hiện với các nguồn nguyên liệu khác nhau nhƣ trà đƣờng, lipton, trà xanh.... Chất lƣợng và thành phần kombucha phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó việc lựa chọn chủng giống là yếu tố đầu tiên và có vai trò quan trọng cho quá trình sản xuất kombucha. Ở Việt Nam, các nghiên cứu khoa học về lên men kombucha vẫn còn rất hạn chế, đặc biệt là về các vi sinh vật lên men kombucha trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh”. 1 2. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh thơm ngon, bổ dƣỡng. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh 3.2. Động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến lên men kombucha 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Tìm ra một số chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha thơm ngon, bổ dƣỡng trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng Ngọc Thanh. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng lá chè xanh khu vực xã Ngọc Thanh, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc lên men kombucha phục vụ cho đời sống nhân dân, góp phần nâng cao giá trị cây chè. Tạo ra sản phẩm mới góp phần làm đa dạng các sản phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngƣời tiêu dùng. Tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu rẻ tiền, lên men tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng, có lợi cho sức khỏe con ngƣời. 5. Điểm mới của đề tài Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 có thể dùng cho lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh tốt. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ và hàm lƣợng đƣờng bổ sung cho dung dịch nƣớc chè Ngọc Thanh lên men kombucha. 2 NỘI DUNG CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về sản phẩm kombucha Trà “thủy sâm” kombucha là một loại nƣớc uống có lợi cho sức khỏe. Đây là một cấu trúc có dạng nhƣ thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn [15]. Nấm kombucha là một khối vi sinh vật đƣợc phân loại theo tên khoa học là “Zoogleal mat” liên kết với nhau thành màng phủ kín trên bề mặt nƣớc trà đƣờng. Trong quá trình lên men, màng nấm kombucha lớn dần tạo thành khối dày giống nhƣ một cái bánh, thƣờng đƣợc gọi là “nấm”, “cái dấm” hoặc bằng các từ viết tắt SCOBY (Symbiotic colony of Bacteria and Yeast: khối cộng sinh của vi khuẩn và nấm men). Các vi khuẩn và nấm men trong nấm kombucha làm chuyển hóa đƣờng trong dung dịch nƣớc trà đƣờng thành rƣợu và axit hữu cơ, và có thể một số chất tan từ trà cũng đƣợc chuyển hóa trong quá trình lên men, tạo thành một loại nƣớc giải khát có độ cồn thấp, vị chua ngọt, chát nhẹ. Các vi sinh vật biến đổi đƣờng thành gluconic acid, đồng thời sản xuất ra một lƣợng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành acetic acid. Thành phần trà sau cùng chứa: acid folic, gluconic, cacbonic, glucuronic, malonic... và lƣợng lớn vitamin B. Hình 1.1. Sản phẩm trà Kombucha 3 1.1.1. Quá trình lên men kombucha Quá trình lên men kombucha gồm hai quá trình xảy ra đồng thời là lên men rƣợu và lên men acetic với sự tham gia của nấm men và vi khuẩn acetic [9]. Nấm men có khả năng chuyển hóa đƣờng thành etanol và CO 2 trong điều kiện yếm khí. Đầu tiên, đƣờng cùng các chất dinh dƣỡng khác của môi trƣờng lên men đƣợc hấp phụ trên bề mặt của tế bào nấm men, khuếch tán qua màng bán thấm vào trong tế bào. Đƣờng bị chuyển hóa qua một chuỗi phản ứng theo con đƣờng đƣờng phân để tạo pyruvate, pyruvate bị decarboxyl dƣới tác dụng xúc tác của enzim pyruvate decarboxylase tạo thành acetaldehyde giải phóng CO2, acetaldehyde nhận H+ từ NADH tạo ethanol. Trong quá trình lên men ethanol, nhiều axit hữu cơ đƣợc tạo thành. Một số axit hữu cơ đƣợc sinh tổng hợp từ chu trình krebs nếu nhƣ quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các axit hữu cơ chiếm hàm lƣợng cao nhất trong dịch lên men là: axit citric, axit malic, axit acetic, axit lactic..... Quá trình chuyển hóa ethanol thành axit acetic trong điều kiện hiếu khí dƣới tác dụng của enzim oxy hóa của vi khuẩn gọi là lên men acetic. Lên men acetic là quá trình oxy hóa tuần tự ethanol chuyển thành acetaldehyde dƣới tác dụng của enzim alcohol dehydrogenase, rồi acetaldehyde đƣợc chuyển hóa thành hydrate acetaldehyde và sau cùng hydrate acetaldehyde bị oxy hóa thành axit acetic. Lên men lactic đƣợc thực hiện bởi hệ enzim của các vi khuẩn họ Lactobacteriaceae (vi khuẩn này là vi khuẩn yếm khí hoặc vi khuẩn hiếu khí). Phụ thuộc vào hệ enzim của từng nòi vi khuẩn trong môi trƣờng lên men hoặc chỉ có axit lactic (lên men đồng hình) hoặc ngoài axit lactic còn có các sản phẩm khác và CO2 (lên men dị hình). 4 1.2.2. Thành phần và công dụng của kombucha Trà kombucha chứa nhiều loài vi sinh vật khác nhau cùng với các axit hữu cơ thông thƣờng, enzim có lợi, amino axit và polyphenol. Phụ thuộc vào các vi sinh vật, trà kombucha có thể chứa các thành phần nhƣ: acid acetic, acid butyric, acid gluconic, acid glucuronic, acid lactic, acid malic, acid oxalic,... nhiều enzyme có lợi và vitamin nhóm B ( B1, B2, B3, B6, B12). Trong quá trình lên men yếm khí, trà kombucha chứa một lƣợng cồn khác nhau từ 0,5 – 1,5% phụ thuộc vào thời gian lên men yếm khí và vi sinh vật. Trà kombucha giúp tăng sức chịu đựng dẻo dai của cơ thể, làm giảm đau cơ, triệu chứng mệt mỏi. Nhờ sản sinh axit lactic, giúp tăng lƣợng vi khuẩn có lợi cho đƣờng ruột, tăng nhanh quá trình lên men trong ruột, ngừa táo bón, nhiễm trùng đƣờng ruột, kiết lị, rối loạn tiêu hóa....Trà kombucha tăng tính đàn hồi cho da, làm màu da tƣơi sáng hơn. Acid glycuronic kết hợp với các độc tố trong gan làm chúng dễ tan trong nƣớc, sau đó bài tiết qua nƣớc tiểu giúp giải độc cơ thể. Ngoài ra, kombucha còn có tác dụng kháng sinh, chống trầm cảm, chữa thiếu ngủ, giúp gia tăng thị lực....[47]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, sản phẩm trà kombucha có lợi cho sức khỏe hơn so với những sản phẩm lên men từ sữa và có khả năng nhƣ một chất kháng sinh, kháng virut, kháng nấm. Ngoài ra, còn giúp giảm stress và phục hồi chức năng gan. Nhiều báo cáo cho biết uống trà kombucha làm giảm cao huyết áp, chống lại bệnh viêm khớp, xơ cứng động mạch, bệnh hen suyễn, bệnh viêm phế quản, tăng hệ miễn dịch cho cơ thể và chữa bệnh ung thƣ…. Sử dụng kombucha có lợi cho dạ dày, ruột và các hoạt động của hệ nội tiết, giúp bài tiết độc tố, ngăn ngừa xơ cứng động mạch, giảm căng thẳng và các vấn đề về lão hóa. Nó cũng có thể có tác dụng nhƣ thuốc nhuận tràng, làm giảm nguy cơ mắc các bệnh thấp khớp, bệnh gút, bệnh trĩ [15]. Trong những 5 nghiên cứu gần đây còn chỉ ra rằng kombucha có khả năng liên kết với các gốc tự do và chống oxy hóa [24]. Trà thủy sâm kombucha là loại nƣớc uống có lịch sử lâu đời ở nhiều nƣớc và thấy có lợi cho sức khỏe. Tuy nhiên chƣa thấy tài liệu khoa học chính thức nào công bố về hiệu quả chữa bệnh. Sử dụng kombucha không có phản ứng phụ và nên uống sau mỗi bữa ăn, mỗi lần 100ml, ngày 2 lần. 1.2. Tổng quan về nguyên liệu, đối tƣợng nghiên cứu 1.2.1. Chè Ngọc Thanh, Phúc Yên, Vĩnh Phúc Cây chè Camellia sinensis (L.) có nguồn gốc ở khu vực gió mùa Đông Nam Á và có lịch sử phát triển cách đây gần 5000 năm. Việt Nam là nƣớc có điều kiện khí hậu, địa lí, đất đai phù hợp cho sự sinh trƣởng, phát triển của cây chè. Từ lâu, cây chè và các sản phẩm từ chè đã rất gần gũi, phổ biến trong đời sống của ngƣời dân Việt Nam. Ngọc Thanh là xã miền núi duy nhất của thị xã Phúc Yên tỉnh Vĩnh Phúc. Với địa hình trung du miền núi Bắc bộ, Ngọc Thanh tập chung vào gieo trồng các loại cây có hiệu quả kinh tế cao. Trong đó, cây chè là một trong những cây đƣợc chú trọng. Toàn xã có 470 mẫu chè, cho 500 tấn chè mỗi năm. 1.2.1.1. Đặc điểm sinh thái, sinh sản của cây chè Thời vụ Vụ Xuân (tháng 3-4): Hái chừa 2 lá và lá cá, tạo tán bằng những búp cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá. Vụ Hè Thu (tháng 5 - 10): Hái chừa 1 lá và lá cá, tạo tán bằng những búp cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá. Vụ Thu Đông (Tháng 11): hái chừa lá cá , tháng 12 hái cả lá cá. Với các giống chè có dạng thân bụi, sinh trƣởng đỉnh đều có thể hái kéo hay hái bằng máy để nâng cao năng suất lao động. 6 Chu kỳ phát triển Chu kỳ của một cây chè bao gồm ba giai đoạn. Giai đoạn đầu tiên là giai đoạn cây non hay giai đoạn thiết kế cơ bản. Các bụi chè phải trồng 3-4 năm kể từ khi gieo trồng mới phát triển thành cây trƣởng thành. Sau đó là giai đoạn cây lớn và giai đoạn cuối là giai đoạn chè già cỗi. Giai đoạn chè lớn kéo dài 20 – 30 năm, tuỳ giống, điều kiện đất đai, dinh dƣỡng và khai thác. Chăm sóc kém và khai thác nhiều sẽ làm cho cây chè bị suy thoái, già trƣớc tuổi. Đây là giai đoạn chè cho năng suất cao nhất. Sau đó là giai đoạn chè già cỗi, cây chè suy yếu dần, lá nhỏ, búp ít, chóng mù xoè, hoa quả nhiều, cành tăm hƣơng nhiều, chồi gốc mọc nhiều. Hình 1.2. Lá chè tƣơi 1.2.1.2. Thành phần hóa học của lá trà Trong lá chè tƣơi có chứa nhiều thành phần hóa học nhƣ: tinh dầu, các dẫn xuất polyphenolic (flavonoid, catechol, tannin), alkaloid là cafein, theophyllin, theobromin, xanthin, và các vitamin C, B1, B2, B3. Các thành phần trong nƣớc chè xanh có tác dụng lớn đối với sức khỏe. Chất catechin có tác dụng giảm nguy cơ gây ung thƣ, giảm kích thƣớc khối u, chống phóng xạ, giảm lƣợng đƣờng máu, giảm cholesterol, diệt khuẩn, diệt virut cúm.... Chè xanh chứa chất cafein có tác dụng chống buồn ngủ, giảm mệt mỏi và lợi tiểu. Vitamin C làm tăng sức đề kháng, vitamin nhóm B giúp 7 cho quá trình trao đổi cacbon hydrat. Flavonoid có tác dụng giảm huyết áp, tăng độ bền vững thành mạch....[45]. Bảng 1.1. Thành phần hóa học của lá trà [9] Thành phần Hàm lƣợng (% chất khô) Nƣớc 75 - 80 Tổng polyphenol 25 - 30 Flavanols (-) Epigallocatechin gallate (EGCG) 8 - 12 (-) Epicatechin gallate (ECG) 3-6 (-) Epigallo catechhin (EGC) 3-6 (-) Epicatechin 1–3 (+) Catechin (C) 1-2 (+) Gallocatechin (GC) 3–4 Caffeine 3–4 Axit hữu cơ ( ctric, malic, oxalic,...) 0,5 – 0,6 Đƣờng ( glucose, 4–5 fructose,saccharose..) Xơ ( cellulose, hemicellulose, lignin) 4-7 1.2.2. Hệ vi sinh vật Kombucha đƣợc tạo thành do sự cộng sinh của các loài vi khuẩn thuộc giống Acetobacter và các loài nấm men khác nhau. Do sự công sinh giữa Acetobacter xylium, A. xylinoides, A. aceti ,A. pasteurianus, gluconicum [2], [40], và nấm men nhƣ Schizosaccharomyces pombe, Kloeckera apiculata, Saccharomycodes ludwigii, Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomycea bailii, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces lambicus, Brettanomyces custersii và Pichiaspecies [2]. 8 1.2.2.1. Giống vi khuẩn Acetobacter Vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Acetobacteriaceae, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập đƣợc các vi khuẩn này từ không khí, đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm, đặc biệt là các loại thực phẩm, hoa trái, nƣớc trái cây và các sản phẩm lên men tự nhiên chứa ethanol nhƣ rƣợu, bia, giấm tự nhiên… Các phƣơng pháp truyền thống trong phân loại và định danh họ Acetobacteriaceae chủ yếu dựa vào các đặc điểm kiểu hình bao gồm các đặc điểm hình thái, sinh lý, dinh dƣỡng và đặc điểm sinh thái. Đặc điểm hình thái Các đặc điểm hình thái thƣờng đƣợc khảo sát gồm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, trạng thái nhuộm Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thƣớc tế bào. Ngoài ra, số lƣợng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong định danh vi khuẩn acetic. Đặc điểm sinh thái Giống vi khuẩn Acetobacter phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập đƣợc các vi khuẩn này từ không khí, đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm, dấm, rƣợu, bia, hoa quả …. Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã đƣợc phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế. Đặc điểm phân bố của vi khuẩn acetic thƣờng gắn liền với các nguồn dinh dƣỡng chứa đƣờng hay alcohol nhƣ các loại hoa, quả, bia, rƣợu và các nơi sản xuất giấm. Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp, đặc điểm sinh thái đƣợc đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài. Cụ thể nhƣ Acidomonas chỉ có thể phân lập đƣợc trong bùn hoạt tính có methanol; Granulibacter đƣợc tìm thấy trong cơ thể ngƣời bị u hạch. 9 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Vi khuẩn Acetobacter có thể di động (có tiêm mao đơn hoặc chu mao) hoặc không di động (không có tiêm mao), không sinh nha bào tử, hiếu khí bắt buộc, chịu đƣợc độ axit cao. Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hóa nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhƣng không sử dụng đƣợc tinh bột. Có khả năng tạo váng trên môi trƣờng lỏng. Acetobacter có khả năng đồng hóa muối (NH4)+ và phân giải pepton. Một số loài đòi hỏi một số axit amin nhất định nhƣ axit pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S,…. ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó bia, nƣớc mạch nha, nƣớc trái cây….là nguồn dinh dƣỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter [9]. Ngoài khả năng oxy hóa ethanol thành axit acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp đƣợc vitamin B1, vitamin B2, oxy hóa a.sorbic thành đƣờng sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C)….[9]. Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid đƣợc phân biệt bởi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa nhƣ: Oxy hóa acetate tạo CO 2 và H2O; phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau; phát triển sinh khối trong các môi trƣờng chứa D - glucose 30%; acetic acid 0,35% ...[6]; phản ứng catalase dƣơng tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men; không tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer; chuyển hóa glucose thành gluconic; không sinh sắc tố nâu, tổng hợp cellulose; chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton. 1.2.2.2. Giống vi khuẩn lên men lactic Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium. Đây là những trực khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện. Chúng có khả năng lên men nhiều loại đƣờng đơn và đƣờng đôi nhƣng không 10 có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dƣỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C. Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [6]. 1.2.2.3. Nấm men Hình thái và cấu tạo tế bào Tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ… kích thƣớc rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thƣớc trung bình: Chiều dài: 9 – 10μm, chiều rộng: 2 – 7μm. Hình dạng và kích thƣớc tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Sự sinh sản của nấm men Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sản bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao; tiếp hợp dị giao; sinh sản đơn tính). Phân loại nấm men Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi imporfecti). Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; Giống Endomyces; Giống Schizosaccharomyces. Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti): Crytococus (toscula, tornlopsis); Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã đƣợc xếp vào lớp nấm mốc); Rhodotorula [7]. 11 Phần lớn các loài nấm men thuộc về ngành nấm túi (Ascomycota), một số ít loài thuộc ngành nấm đảm (Basidimycota). Saccharomyces là một chi nấm men đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm. Trên 1000 loài nấm men đã đƣợc miêu tả, loài nấm men đƣợc con ngƣời sử dụng nhiều nhất là Saccharomyces cerevisiae trong sản xuất rƣợu vang, bánh mì, bia… từ hàng nghìn năm trƣớc. Saccharomyces cerevisiae phổ biến trong quá trình lên men nƣớc quả, chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nƣớc quả khi lên men. Nguồn dinh dƣỡng cacbon của loại này là đƣờng, acid hữu cơ và những tác nhân sinh trƣởng là acid pantotinic, biotin, thiamin, piridoxin… Trong sản xuất kombucha, nấm men Saccharomyces sẽ biến đổi đƣờng thành rƣợu và vi khuẩn Acetobacter sẽ tiếp tục chuyển hóa rƣợu thành acid. Nấm men và vi khuẩn tiếp tục cộng sinh tạo nên sinh khối SCOBY. Trong thời gian lên men, SCOBY sẽ tăng sinh khối cùng với sự hoạt động của nấm men và vi khuẩn. Quá trình này tạo cho sản phẩm có mùi vị đặc trƣng [9]. 1.3. Tình hình nghiên cứu về kombucha trên thế giới và ở Việt Nam 1.3.1. Trên thế giới Từ 1928, Hermann đã ghi nhận việc định danh 2 chủng nấm men Bacterium xylinum và B. xylinoides và một vi khuẩn B. gluconicum (đƣợc đặt tên do có khả năng chế tạo gluconic acid). Các nhà nghiên cứu sau đó đã xác định Kombucha là một sự hợp tác cộng sinh giữa Bacterium xylinum với những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces, tạo thành một khối nhƣ tổ chim. Những chủng vi khuẩn và nấm men đƣợc tìm thấy trong kombucha nhƣ: Acetobacter ketogenum, Pichia fermentans, Saccharomyces apiculatus, S. ludwigii, B. xylinoides, Schizosaccharomyces pombe và Acetobacter ketogenum (theo List, P.H & L. Horhammer. 1973 Hagers Hand buck der Pharmazcutischen Praxis. New York: Sprin ger – verlag) [44]. 12 Năm 1965, Hesseltine đã phân lập đƣợc chủng vi khuẩn sp Acetobacter. (NRRL B-2357) và 2 loại men (NRRL YB-4810, NRRL YB4882) từ mẫu Kombucha có nguồn gốc từ Thụy Sĩ và sử dụng các vi sinh vật này để sản xuất trà Kombucha [22]. Hầu hết các vi khuẩn lên men kombucha thuộc chi Acetobacter và Gluconobacter. Đa số là các vi khuẩn Acetobacter xylinum (Danielova 1954; Konovalov và Semenova 1955; Sievers và những ngƣời khác 1995; Roussin 1996) [14], [25], [36], [38]. Chúng tạo ra một màng nổi cellulosic trên bề mặt dịch lên men (Markov và et al 2001) [29]. Năm 1995, Sievers và cộng sự đã công bố các chủng vi sinh vật trong lớp cellulose là cộng sinh của A. xylinum và một sp Zygosaccharomyces [38]. Đa số các vi khuẩn acid acetic đƣợc tìm thấy trong các loại nấm trà là A. xylium, A. pasteurianus, A. aceti, và Gluconobacter oxydans (Liu và cộng sự 1996) [28]. Trong đó, Gluconacetobacter sp. A4 (G. sp. A4), có khả năng tạo ra D-saccharic axit1,4-lactone (DSL) mạnh, là loài vi khuẩn đƣợc phân lập chủ yếu từ Kombucha trong báo cáo của Yang và cộng sự (2010) [42]. Dutta và Gachhui (2006, 2007) đã phân lập đƣợc vi khuẩn cố định đạm Acetobacter nitrogenifigens sp, chủng có khả năng sản xuất cellulose mạnh là Gluconacetobacter kombuchae sp. từ trà kombucha [16], [17]. Năm 2014, một cuộc điều tra của Marsh và cộng sự chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn chiếm ƣu thế trong 5 mẫu Kombucha (hai mẫu từ Canada, một mẫu từ Ireland, một mẫu từ Mỹ và một mẫu từ Anh) là Gluconacetobacter (trên 85% trong hầu hết các mẫu) và Lactobacillus (lên đến 30%) loài. Acetobacter chỉ chiếm số lƣợng rất nhỏ (dƣới 2%) [30]. Ngoài vi khuẩn acid acetic có nhiều loài nấm men trong Kombucha. Một loạt các nấm men đã đƣợc báo cáo bao gồm các loài thuộc chi Saccharomyces, Saccharomycodes, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, 13 Brettanomyces/Dekkera, Candida, Torulospora, Koleckera, Pichia, Mycotorula, và Mycoderma. Các loài nấm men Saccharomyces đã đƣợc xác định là Saccharomyces sp. (Konovalov và cộng sự 1959; Kozaki và cộng sự 1972) [25], [26] và Saccharomyces cerevisiae (Herrera và Calderon-Villagómez 1989; Liu và cộng sự 1996; Markov và cộng sự 2001; Safak và cộng sự 2002) [21], [28], [29], [37], Saccharomyces bisporus (Markov và cộng sự 2001) [29], Saccharomycoides ludwigii (Reiss 1987 [34]; Markov và cộng sự 2001 [29]; Ramadani và Abulreesh 2010 [33]), Schizosaccharomyces pombe (Reiss 1987 [34]; Teoh và cộng sự 2004 [41]), Zygosaccharomyces sp. (Sievers và cộng sự 1995 [38]; Markov và cộng sự 2001 [29]; Marsh và cộng sự 2014 [30]), Zygosaccharomyces rouxii (Herrera và Calderon-Villagómez 1989), và Zygosaccharomyces bailii (Herrera và Calderon-Villagómez 1989; Liu và cộng sự 1996; Jayabalan và cộng sự 2008) [21], [28], [23]. Một cuộc kiểm tra 2 sản phẩm Kombucha thƣơng mại và 32 sản phẩm tự lên men từ các hộ gia đình ở Đức (Mayser và cộng sự, 1995 [31]) thấy rằng các loài nấm men chủ yếu là Brettanomyces, Zygosaccharomyces, và Saccharomyces spp. Roussin (1996) [36] xác định Zygosaccharomyces và S. cerevisiae là các loại nấm men điển hình trong Kombucha Bắc Mỹ. Kurtzman và cộng sự (2001) [27] đã phân lập đƣợc chủng nấm men ascosporogenous, Zygosaccharomyces kombuchaensis sp. n. (Loại chủng NRRL YB-4811, CBS 8849), từ Kombucha. Năm 2010, Ramadani và Abulreesh đã phân lập và xác định đƣợc 4 loại men: Candida guilliermondi, Candida colleculosa, Candida kefyr, và Candida krusei từ mẫu Kombucha địa phƣơng ở Saudi Arabia [33]. 1.3.2. Ở Việt Nam Hiện nay, các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam còn khá mới mẻ, các công trình nghiên cứu về kombucha có rất ít, đặc biệt là các nghiên cứu về 14 hệ vi sinh vật lên men kombucha. Đa phần các nghiên cứu tập chung vào thành phần và công dụng của kombucha. Theo tác giả Lê Kim Phụng, lợi ích từ trà thủy sâm rất nhiều. Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm (nấm men) phát triển dƣới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng. Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trƣờng nƣớc chè (trà) pha đƣờng. Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ [43]. Tuy nhiên theo tác giả Hà Văn Hùng, Phó Viện trƣởng Viện Y dƣợc học dân tộc thành phố Hồ Chí Minh thì cho đến nay Viện cũng chƣa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó [46]. Năm 2010, tác giả Thạc sĩ Trần Thị Ngọc Mai, trƣờng đại học Kỹ thuật Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh thực hiện đề tài “ Nghiên cứu sản xuất kombucha”. Trong nghiên cứu tác giả đã khảo sát điều kiện cộng sinh giữa vi khuẩn và nấm men, các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly trà trong nƣớc, quá trình thuần hóa hệ cộng sinh vi khuẩn, nấm men và các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men kombucha [9]. Năm 2013, tác giả Ngô Xuân Cƣờng, Nguyễn Thị Bích Ngọc thực hiện đề tài “Nghiên cứu phƣơng pháp lên men nƣớc giải khát từ chè xanh”. Trong đề tài, tác giả so sánh phép đo nồng độ của chất tan trong một dung dịch chứa các chất tan của chè và đƣờng saccharose cho thấy rằng phƣơng pháp làm bay hơi nƣớc sau đó cân cho kết quả chính xác hơn so với đo bằng khúc xạ kế. Cấy thử nghiệm một chủng vi khuẩn Komagatabacter kết hợp với 3 chủng nấm men Zygosaccharomyces fermentati, Hanseniaspora pseudoguilliermondii, Dekkera bruxellensis vào dung dịch chè và đƣờng saccharose, lên men ở nhiệt độ 25 – 27oC, thời gian lên men 3-6 ngày, thu đƣợc dung dịch có độ chua – ngọt tƣơng tự kombucha [1]. Các công trình nghiên cứu về hệ vi sinh vật kombucha còn khá ít. Năm 2012, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cộng sự, Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả 15 tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột”. Trong đề tài, hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, đồng thời khảo sát tác dụng của kombucha trên một số chỉ tiêu sinh lý của chuột nhƣ: cân nặng, tổng lƣợng hồng cầu, tổng lƣợng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí nghiệm qua mô hình bơi kiệt sức. Kết luận: sản phẩm trà kombucha có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe, không gây ảnh hƣởng xấu tới các chỉ tiêu sinh lý của chuột [46]. Năm 2013, tác giả Lê Thị Huệ, đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên” đã phân lập đƣợc 20 mẫu vi khuẩn, tuyển chọn sơ bộ 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter, định loại gồm 3 chủng: A. xylinus, A. aceti, A. pasteurianus [6]. Cùng năm 2013, tác giả Lâm Thị Hồng Liên, đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang” đã phân lập đƣợc 25 mẫu nấm men, sơ bộ định loại 5 chủng nấm men Saccharomyces M1; Saccharomyces M2; Schizosaccharomyces M3; Schizosaccharomyces M4; Saccharomyces M5. Tuyển chọn 2 chủng nấm men M1 và M2 phù hợp cho quá trình lên men kombucha [7]. Năm 2014, tác giả Phạm Hồng Quang và cộng sự đã thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn nấm men và vi khuẩn acid acetic thử nghiệm lên men trà thủy sâm (kombucha)”. Nghiên cứu này đã phân lập đƣợc 23 dòng nấm men và 33 dòng vi khuẩn acid acetic, trong đó dòng nấm men và vi khuẩn lên men tốt nhất đƣợc xác định thuộc loài Saccharomyces cerevisiae và Acetobacter aceti với điều kiện lên men pH ban đầu 5,5, ủ ở nhiệt độ 30 oC, chủng giống với mật độ 105 tế bào/ml, nồng độ đƣờng 15 oBx trong thời gian 7 – 9 ngày [8]. Nhƣ vậy, các nghiên cứu về hệ sinh vật lên men kombucha ở Việt Nam còn khá ít. Các nghiên cứu chủ yếu ở quy mô nhỏ. 16 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thực vât Cây chè Camellia sinensis (L.) Bộ phận sử dụng: lá chè Nơi thu mẫu: xã Ngọc Thanh, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc. 2.1.2. Mẫu vi sinh vật Các chủng vi khuẩn, nấm men phân lập đƣợc từ nƣớc chè đƣờng. 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị Tủ ấm vi sinh (Heraeus-Đức), tủ sấy (Heraeus-Đức), nồi hấp (TOMYNhật), máy lắc ổn nhiệt (BR300LF-Nhật), pipette (lapsystem-Phần Lan), máy đo pH (MP200R-Thụy Sĩ), rƣợu kế, nhiệt kế, máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh), Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)…. 2.1.4. Hóa chất và các loại môi trường Hóa chất: Nguồn cacbon: glucose (C6H12O6), saccharose (C12H22O11), acid acetic. Nguồn nitơ: pepton, (NH4)2SO4. Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4, NaCl, CaCO3. Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol. H2SO4 60%, FeCl3. Nƣớc chè Ngọc Thanh. Các loại môi trƣờng: Các thành phần của môi trƣờng đƣợc hòa tan trong 1000ml nƣớc cất. Môi trƣờng phân lập và nhân giống của vi khuẩn đƣợc bổ sung acid acetic, rƣợu etylic 2% sau khi thanh trùng. 17 Bảng 2.1. Các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu Môi trƣờng Thành phần STT lên men (chè đƣờng) (g/l) Môi trƣờng phân lập và giữ giống (g/l) Môi trƣờng nhân giống (g/l) Vi Nấm Vi Nấm khuẩn men khuẩn men 1 1 Lá chè 150 2 2 MgSO4.7H2O 2 2 2 2 3 3 KH2PO4 2 3 2 3 4 4 (NH4)2SO4 3 2 3 2 5 5 Pepton 4 10 4 10 6 6 saccarozo 7 7 Glucose 20 50 20 50 8 8 Agar 20 15 -20 9 9 CaCO3 10 100 2.1.5. Phạm vi nghiên cứu Các chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh. 2.1.6. Thời gian, địa điểm nghiên cứu Thời gian: tháng 6 năm 2014 đến tháng 3 năm 2015. Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh 2.2.1.1. Phương pháp phân lập Phân lập theo phƣơng pháp Vinogradski và Beijerinck, phân lập sau khi đã làm giàu. Nguồn nguyên liệu: Mẫu màng lên men tự nhiên và dịch trà lên men tự nhiên. 18 Tiến hành phân lập: Vớt mẫu màng, cắt nhỏ, cho vào ống nghiệm chứa nƣớc cất thanh trùng. Lắc đều bằng máy vonotex trong 5 phút thu đƣợc dịch huyền phù vi sinh vật. Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-10. Dùng pipetman hút 50μl mẫu ở các độ pha loãng 10 -3 đến 10-10 nhỏ lên mặt môi trƣờng thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que chang chang đều. Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong 5 – 7 ngày. Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trƣng ra khỏi môi trƣờng phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 4 oC. 2.2.1.2. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram, nhuộm đơn. Nhuộm Gram: là phƣơng pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhắm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protein đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt. Để tiến hành phƣơng pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua sơ tuyển làm tiêu bản. Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu đƣợc giúp ta phân biệt đƣợc vi khuẩn Gr- hay Gr+. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nhuộm Gram là: nhuộm màu cơ bản bằng thuốc nhuộm tím (gential violet…), tất cả các vi khuẩn đều bắt màu tím; nhuộm tăng cƣờng bằng dung dich Lugo, thuốc nhuộm này kết hợp với thuốc nhuộm Gential violet thành phức hợp bền màu hơn ở các vi khuẩn G +; tẩy màu, dùng chất tẩy màu (cồn 90%), ở thành tế bào G - thì liên kết giữa tổ hợp thuốc nhuộm này lỏng lẻo hơn ở vi khuẩn G+ nên dễ bị rửa trôi; nhuộm phân biệt bằng thuốc nhuộm khác. Nếu sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr -, bắt màu tím là vi khuẩn Gr+. Vi khuẩn Gr- không có khả năng giữ màu này nên dễ 19 bị rửa trôi bởi cồn. Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr - mới bắt màu hồng của Fucshin [5]. Nhuộm đơn: Nhuộm đơn là phƣơng pháp nhuộm sử dụng một loại thuốc nhuộm. Tiến hành làm vết bôi vi sinh vật, sau đó nhỏ một, hai giọt xanh metylen hay fuchsin (1:100)…. Để hai phút, thấm khô tiêu bản, soi kính. Soi tiêu bản dƣới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH2 (độ phóng đại 1000 lần). 2.2.1.3. Phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch đĩa. Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi sinh vật, pha loãng theo phƣơng pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trƣờng thạch đĩa. Nuôi ở 300C sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trƣờng đĩa petri, từ đó xác định số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức [5]. N A. Trong đó: 1000 1 . 100 10 n N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu. A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri. 10-n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy. 2.2.1.4. Bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trƣờng giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 300C. Sau đó giữ trong tủ lạnh 40C dùng cho nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [3]. 2.2.1.5. Phương pháp hoạt hóa giống Giống từ ống nghiệm đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, trƣớc khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lƣợng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phƣơng pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trƣờng tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau 20 đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [4], [11]. 2.2.1.6. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men Hàm lƣợng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt. Phƣơng pháp: dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trƣờng, có cùng một lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại. 2.2.2. Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH có phenolphtalain 0,1% làm chỉ thị Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men, thêm vào đó 1 – 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Sau đó tính số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men theo công thức [10]: ( Trong đó: ) X : Số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men V : Số ml NaOH 0,1N d ng để chuẩn độ 10 ml dung dịch lên men K : ượng acid tổng số tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N (K 0,006) 10 : Số ml dịch lên men đem chuẩn độ V : số ml dịch quả đã lấy để phân tích 2.2.2.2. Đo hàm lượng chất khô bằng khúc xạ kế Dùng nƣớc cất rửa sạch mặt kính bên trong khúc xạ kế và dùng giấy thấm lau khô thiết bị. Dùng ống nhỏ giọt lấy mẫu nhỏ lên mặt kính của khúc xạ kế và đậy nắp lại. Đƣa khúc xạ kế hƣớng ra ánh sáng và nhìn vào ống kính ta thấy hai vùng hồng và trắng. Vạch ngăn cách giữa hai vùng chỉ vào giá trị 21 nào thì giá trị đó chính là nồng độ chất khô của dung dịch. Nếu khi nhìn vào chỉ có vùng sáng thì nồng độ chất khô của dịch có giá trị lớn hơn khoảng giá trị đo có của khúc xạ kế. Ngƣợc lại, nếu khi nhìn vào chỉ có vùng tối thì nồng độ chất khô của dịch có giá trị nhỏ hơn khoảng giá trị đo của khúc xạ kế. 2.2.2.3. Phát hiện hoạt tính catalaza Các vi sinh vật có enzim chứa flavoprotein khử O 2 tạo ra H2O2 hoặc O2đây là những chất oxi hóa cực mạnh, phá hủy nhanh chóng cấu trúc của tế bào. Nhiều loài vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzim chuyển hóa các chất trên. Các enzim này có thể là superoxidismutaza (SOD), catalaza hoặc peroxidaza nhƣ phƣơng trình sau đây [5]: 2O2 + 2H2 → O2 + 2H2O (SOD) 2H2O2 → H2O + O2 (Catalaza) 2YH + H2O2 → H2O + 2Y (peroxydaza) 2.2.2.4. Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic Sử dụng môi trƣờng sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn [6]. Thành phần (g/l): Cao nấm men: 10g Thạch : 20g pH : 7,0-7,2 Canxi acetat : 10g Nƣớc máy : 1000ml Quan sát hiện tƣợng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dƣơng tính, ngƣợc lại là âm tính. 2.2.2.5. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300C trong vòng 3 - 4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá thành màu xanh lam [6]. 22 2.2.3. Phương pháp cảm quan Phân tích cảm quan thực phẩm là kỹ thuật sử dụng cơ quan cảm giác của con ngƣời để tìm hiểu mô tả và định lƣợng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm nhƣ: màu sắc, mùi vị... Cảm quan của kombucha đƣợc đánh giá trên một số chỉ tiêu theo TCVN 3215 – 79 [12]: Số điểm chƣa có trọng lƣợng là số điểm cho tƣơng ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu chất lƣợng và đƣợc quy định trong bảng 2.2 (trang 24), hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu đƣợc quy định trong bảng 2.3 (trang 25), đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ở bảng 2.4. Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm Số thứ tự 1 2 3 4 5 6 Mức chất Số điểm lƣợng chung Loại tốt 18,6 – 20,0 Loại khá Loại trung bình Loại kém Loại rất kém Loại hỏng Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chƣa có trọng lƣợng của hội đồng cảm quan Mùi : 4,8 Vị : 4,8 Mùi : 3,8 15,2 – 18,5 Vị : 3,8 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,0 0 – 3,9 Mỗi chỉ tiêu nhỏ hơn 1,0 23 Bảng 2.2. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha Tên chỉ tiêu Độ trong và màu sắc Mùi Điểm chƣa có trọng lƣợng Yêu cầu 5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm 4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu đặc trƣng cho sản phẩm. 3 Chất lỏng trong, có tƣơng đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trƣng của sản phẩm. 2 Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng, màu khác nhiều so với màu đặc trƣng của sản phẩm. 1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc trƣng cho sản phẩm. 0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng 5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm. 4 Chƣa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trƣng cho sản phẩm nhƣng hơi khó nhận thấy. 3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trƣng cho sản phẩm 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trƣng cho sản phẩm 1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trƣng cho sản phẩm 0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng. 5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm 4 Chƣa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trƣng cho sản phẩm bình thƣờng. 3 Chƣa hòa hợp, hơi gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trƣng cho sản phẩm. 2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trƣng cho sản phẩm 0 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hỏng Vị 24 Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 Độ trong và màu sắc 0,8 2 Mùi 1,2 3 Vị 2,0 Tổng cộng 4,0 2.2.4. Phương pháp phân tích thống kê Xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp trong cuốn “Thống kê và ứng dụng” nhƣ: * Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm. X 1 n Xi n i 1 Trong đó X: trung bình tổng thể Xi: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n n: số lần thí nghiệm n * Trung bình bình phƣơng các sai lệch (X i 1 i X )2 n 1 Trong đó: δ : độ lệch chuẩn Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n X: trung bình tổng thể * Sai số đại diện của trung bình cộng * Hệ số biến thiên trung bình cộng: m Cv n x100 X Trong đó Cv: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể δ: độ lệch chuẩn X: trung bình tổng thể 25 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh 3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic 3.1.1.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter Nguyên liệu: Nguyên liệu đƣợc sử dụng để phân lập là lá chè tƣơi tại xã Ngọc Thanh, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc. Quy trình phân lập gồm các 7 bƣớc: Bƣớc 1: Làm giàu mẫu nguyên liệu Bƣớc 2: Phân lập, thu các chủng vi khuẩn Bƣớc 3: Tuyển chọn các chủng Gram âm Bƣớc 4: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid Bƣớc 5: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid acetic Bƣớc 6: Thử hoạt tính catalaza Bƣớc 7: Xác định khả năng hình thành màng cellulose Trong quy trình trên, bƣớc 1 làm giàu nguồn nguyên liệu nhằm bẫy vi khuẩn Acetobacter và nấm men từ tự nhiên đến khƣ trú. Bƣớc 2, 3, 4, 5 là phân lập thu thập các chủng vi khuẩn thuộc giống Acetobacter và bƣớc 6, 7 là nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng thu đƣợc. Bƣớc 1: Thu mẫu lá chè tƣơi tại Xã Ngọc Thanh, Thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc, loại bỏ lá úa, bỏ cọng. Sau đó, lá chè đƣợc rửa sạch, để ráo và chiết xuất chất tan ở nhiệt độ 95 – 100oC, trong thời gian 20 phút. Để nguội khoảng 20 – 30oC bổ sung đƣờng saccharose 100g, acid acetic 10ml vào 1000ml dịch nƣớc chè đã loại bỏ bã. Phủ lên trên miệng hũ một lớp vải mỏng 26 và cất giử ở nơi không có côn trùng, bào tử nấm mốc. Sau 7 – 10 ngày lên men tự nhiên tiến hành phân lập vi khuẩn, nấm men. Hình 3.1. Lá chè thu mẫu Hình 3.2. Dịch kombucha lên men tự nhiên từ chè Ngọc Thanh Bƣớc 2: Phân lập thu các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha. Tiến hành phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phƣơng pháp Vinogradski và Beijerinck. Dựa vào đặc điểm màu sắc, kích thƣớc khuẩn lạc đã phân lập đƣợc 12 mẫu vi khuẩn khác nhau, tạm gọi mỗi mẫu là một chủng vi khuẩn. Đặc điểm khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn đƣợc thể hiện ở bảng 3.1. 27 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng phân lập đƣợc STT Tên Kích thƣớc chủng khuẩn lạc (mm) Đặc điểm khuẩn lạc Khuẩn lạc màu trắng 1 A1 1,5 - 3 trong, bóng, nhầy, hình cầu,rìa ngoài bằng phẳng. Khuẩn lạc màu trắng trong, hình cầu, bề 2 A2 2,5 - 3 mặt khuẩn lạc có nhân hơi nhô lên ở giữa. Khuẩn lạc màu trắng 3 A3 1-2 đục, hình cầu, bề mặt khuẩn lạc có nhân nhô lên ở giữa Khuẩn lạc màu trắng 4 A4 2-3 đục, mép khuẩn lạc hình răng cƣa. Khuẩn lạc màu trắng trong bóng, nhầy 5 A5 1 – 2,5 nhớt, bề mặt khuẩn lạc không nhô cao, mép khuẩn lạc bằng phẳng. 28 Hình ảnh Khuẩn lạc màu trắng 6 A6 ngà, có nhân lồi cao 1-2 ở giữa, bờ ngoài khuẩn lạc tròn đều. 7 A7 1,5 - 2 8 A8 0,5 - 1 Khuẩn lạc màu đỏ, hình cầu. Khuẩn lạc màu vàng nhạt, hình cầu. Khuẩn lạc có màu trắng trong, bóng, 9 A9 2,5 - 3 nhầy nhớt, hình cầu, có nhân trắng đục ở giữa. Bƣớc 3: Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn thu đƣợc. Thấy 12 chủng vi khuẩn này bắt màu hồng của thuốc nhuộm, chúng là các vi khuẩn Gram âm. Hình 3.3. Hình thái tế bào Hình 3.4. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A7 (x1000) chủng vi khuẩn A5 (x1000) 29 Hình 3.5. Hình thái tế bào Hình 3.6. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A1 (x1000) chủng vi khuẩn A4 (x1000) Bƣớc 4: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid. Các chủng Acetobacter có khả năng sinh acid acetic, acid này phân giải CaCO 3 trong môi trƣờng do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Cấy các chủng này trên môi trƣờng có bổ sung CaCO3 5g/l, sau 5 – 7 ngày chọn những chủng có khả năng hình thành vong phân giải calcium xung quanh khuẩn lạc. Hình 3.7. Khả năng oxy hóa acetate của chủng vi khuẩn A1 Sau bƣớc này chúng tôi thu đƣợc 9 chủng A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 sinh acid nhƣng chƣa khẳng định đƣợc acid đó là acid acetic. Vì 30 vậy, chúng tôi tiến hành định tính acid acetic trong mẫu dịch lên men của từng chủng vi khuẩn. Bƣớc 5: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid acetic. Tiến hành thí nghiệm lên men từng chủng vi khuẩn thu đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng đƣợc pha theo tỉ lệ lá chè là 150g/l và đƣờng là 100g/l. Sau 7 ngày lên men tiến hành định tính acid acetic. Kết quả mẫu dịch lên men của 9 chủng vi khuẩn A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 có phản ứng dƣơng tính. 1 2 3 a. Dịch trà kombucha b. Đun sôi dịch kombucha c.Phản ứng tạo acetatate (bổ sung FeCl3) sắt màu đỏ thẫm 1 4 2 d. Mẫu đối chứng (acid acetic) Hình 3.8. Định tính acid acetic 31 3 Kết quả tuyển chọn bƣớc 4 và bƣớc 5 cho thấy, có 9 chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid actic và có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cacbon. Theo Bergey (1992), chi Acetobacter có khả năng oxy hóa acetate. Vì thế trong môi trƣờng có chứa calcium acetate, các chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cacbon hay nói cách khác chúng có khả năng oxy hóa acid acetic thành CO 2 và H2O; giải phóng ATP cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào đồng thời giải phóng Ca2+ tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Vì vậy, 9 chủng vi khuẩn này thuộc chi Acetobacter họ Acetobacteraceae [11]. Bƣớc 6: Thử hoạt tính catalaza. Nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn, thấy có 9 chủng vi khuẩn A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 có hiện tƣợng sủi bọt. Điều này chứng tỏ oxy đƣợc giải phóng ra hay 9 chủng vi khuẩn đều có phản ứng catalase dƣơng tính. Hình 3.9. Thử hoạt tính catalaza 32 Bƣớc 7: Xác định khả năng hình thành màng cellulose. Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng của 9 mẫu vi khuẩn, kết quả có 5 mẫu màng của 9 chủng vi khuẩn xuất hiện màu xanh lam. Vậy màng của 5 chủng vi khuẩn A1, A3, A4, A6, A8, A9 có bản chất là cellulose nên màng bắt màu xanh với iot. Hình 3.10. Mẫu màng thử hoạt tính phát hiện khả năng tổng hợp cellulose 33 Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính 9 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ dịch trà Kobumcha từ chè Ngọc Thanh Tên chủng STT A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + - + - + + Đặc điểm 1 2 3 4 5 Bắt màu hồng khi nhuộm Gram Tạo acid acetic Khả năng oxi hóa axit acetic Hoạt tính catalaza Khả năng tổng hợp cellulose Ghi chú: + Kết quả dương tính - Kết quả âm tính Như vậy, đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn và sơ bộ tuyển chọn được 9 chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter trong họ Acetobacteraceae. 3.1.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha tốt Tiến hành thí nghiệm lên men từng chủng vi khuẩn thu đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng đƣợc pha theo tỉ lệ lá chè là 150g/l và đƣờng là 100g/l. Sau 7 ngày lên men tiến hành xác định hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo ra bằng chuẩn độ với NaOH có phenolphtalain 0,1% làm chỉ thị và đánh giá cảm quan màng của 9 chủng vi khuẩn. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3. 34 Bảng 3.3. Bảng hàm lƣợng acid tổng số và chất lƣợng cảm quan sản phẩm của 9 chủng vi khuẩn STT Hàm lƣợng acid tổng số Chất lƣợng cảm quan (g/l) sản phẩm Chủng M1 M2 M1 M2 1 A1 2,78 2,48 18 17 2 A2 1,62 2,34 16 16,5 3 A3 1,66 1,9 15,5 16 4 A4 1,58 1,94 15,5 15,5 5 A5 2,58 1,52 17 15 6 A6 1,2 1,64 15 15 7 A7 1,66 1,22 16 15 8 A8 1,6 1,66 16,5 16 9 A9 2,3 1,8 17 16 Căn cứ vào khả năng sinh acid và chất lƣợng cảm quan sản phẩm đƣợc lên men từ 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter, chúng tôi thấy chủng vi khuẩn A1 có khả năng sinh acid cao và cho sản phẩm có chất lƣợng cảm quan khá. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chủng A1 làm đối tƣợng cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men 3.1.2.1. Phân lập các chủng nấm men Từ dịch trà kombucha đƣợc lên men tự nhiên, chúng tôi tiến hành phân lập nấm men trên môi trƣờng Haxen. Dựa vào hình thái, màu sắc và kích thƣớc khuẩn lạc, thu đƣợc 2 chủng nấm men. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4. 35 Bảng 3.4. Kết quả phân lập các chủng nấm men Kích thƣớc STT Tên chủng khuẩn lạc (mm) Đặc điểm khuẩn lạc Hình ảnh Khuẩn lạc 1 M1 1-2 màu trắng ngà, tròn, bề mặt lồi. Khuẩn lạc 2 M2 1,5 – 3,5 màu trắng đục, tròn, bề mặt lồi. Các chủng nấm men đều có khuẩn lạc tròn, bề mặt lồi, bóng, đƣờng kích khuẩn lạc từ 1 – 3,5 mm. 3.1.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha tốt Bƣớc 1: Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi quang học Tiến hành nhuộm đơn 2 mẫu nấm men phân lập đƣợc. Kết quả quan sát thấy, tế bào nấm men có hính ovan hoặc hình trứng, sinh trƣởng theo kiểu nảy chồi. 36 Hình 3.11. Hình thái tế bào học Hình 3.12. Hình thái tế bào học chủng nấm men M1 (x1000) chủng nấm men M2 (x1000) Bƣớc 2: Đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men Nuôi lắc chủng nấm men trong môi trƣờng nhân giống trong vòng 24h. Tiến hành lên men từng chủng nấm men trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng (trích li từ 150g/l lá chè, bổ sung 100g/l đƣờng sacharose), bổ sung 10% dịch giống nấm men và 10% dịch giống vi khuẩn ở nhiệt độ 25 – 30oC. Sau 3 ngày lên men, đem cân trọng lƣợng bình ban đầu sau đó mở nắp bình lên men, tiếp tục đem cân trọng lƣợng bình thấy trọng lƣợng bình giảm đi. Đó chính là lƣợng CO2 sinh ra trong quá trình lên men. Lƣợng CO2 sinh ra càng nhiều thì trọng lƣợng bình càng giảm, chứng tỏ hoạt lực lên men càng cao. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Hoạt lực lên men của các chủng nấm men Chủng nấm men M1 M2 Lƣợng CO2 thoát ra (g) 0,87 0,8 Qua bảng trên, ta thấy chủng nấm men M1 có hoạt lực lên men cao hơn chủng nấm men M2. 37 Bƣớc 3: Khả năng kết lắng Hòa sinh khối nấm men thu đƣợc vào dịch đệm acetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3 – 5 phút và để lắng 20 phút. Kết quả thể hiện ở hình 3.13. 17 16.5 M1 16 M2 15.5 15 14.5 14 Chiều cao cột sinh khối (mm) Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn chiều cao cột kết lắng của các chủng nấm men Biểu đồ trên cho thấy chủng nấm men M1 có khả năng kết lắng cao hơn chủng nấm men M2. Qua kết quả bƣớc 2 và bƣớc 3, chúng tôi nhận thấy chủng nấm men M1 có hoạt lực lên men và khả năng kết lắng cao hơn chủng nấm men M2. Vì vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn chủng nấm men M2 cho các nghiên cứu tiếp theo. Như vậy, từ dịch chè đường Ngọc Thanh lên men tự nhiên, chúng tôi đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn trong đó có 9 chủng vi khuẩn Acetobacter. Tuyển chọn được 1 chủng vi khuẩn A1 có khả năng sinh acid cao và cho sản phẩm kombucha có chất lượng cảm quan khá. Đã phân lập được 2 chủng nấm men, và tuyển chọn được 1 chủng nấm men M1 có hoạt lực lên men và khả năng kết lắng tốt. 38 3.2. Động thái sinh trƣởng chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 Để nghiên cứu động thái sinh trƣởng các chủng vi khuẩn A1 và nấm men M1, chúng tôi tiến hành cấy chủng trên môi trƣờng nhân giống đặc trƣng, với số lƣợng vi khuẩn ban đầu là 2x106 tế bào/ml và nấm men là 3,5x106 tế bào/ml. Nuôi trên máy lắc 150 vòng/phút ở 35 oC. Sau 12h kiểm tra số lƣợng tế bào 1 lần. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 Chủng vi khuẩn A1 Thời gian Chủng nấm men M1 Số lƣợng tế bào (x106) δ Số lƣợng tế bào (x106) δ 0 2,00 ± 0,006 0,01 3,50 ± 0,006 0,01 12 10,67 ± 1,01 1,80 23,00 ± 0.69 1,20 24 39,67 ± 1,50 2,60 33,67 ± 0,69 1,20 36 68,67 ± 1,35 2,33 115,00 ± 1,3 2,30 48 119,00 ± 1,35 2,33 103,00 ± 2,22 3,80 60 130,00 ± 1,20 2,00 71,67 ± 0,84 1,50 72 138,67 ± 1,17 2,00 54,67 ± 0,84 1,50 84 110,67 ± 2.22 3,80 96 78,33 ± 1,58 2,70 Số lƣợng tế bào (x106) (h) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Vi Khuẩn Nấm men 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Thời gian (h) Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 39 Qua quá trình nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men M1 và chủng vi khuẩn A1 chúng tôi nhận thấy sự phát triển này tuân theo quy luật 4 pha bao gồm pha tiềm phát, pha log, pha cân bằng và pha suy vong. Đối với chủng nấm men M1 ở giờ 36 số lƣợng tế bào là cực đại và sau đó giảm dần; đối với chủng vi khuẩn A1 số lƣợng tế bào cực đại ở giờ 72 và sau đó giảm dần. Vậy khi chuyển sang môi trường lên men, đối với chủng nấm men M1 chúng tôi lấy ở thời điểm 36 giờ và chủng vi khuẩn A1 lấy ở thời điểm 72 giờ. 3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến lên men kombucha 3.3.1. Nhiệt độ lên men Tiến hành lên men kombucha ở 25 oC, 30oC, 35oC trong vòng 9 ngày [16], theo dõi sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số, hàm lƣợng đƣờng sót và đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm của dịch lên men. Kết quả thể hiện ở Hàm lƣợng đƣờng sót (Brix) hình 3.15, 3.16 và hình 3.17. 10 8 6 25 4 30 2 35 0 0 3 5 7 Thời gian (ngày) 9 Hình 3.15. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót ở các nhiệt độ lên men Qua biểu đồ trên, thấy hàm lƣợng đƣờng giảm theo thời gian lên men, sai khác ở các ngƣỡng nhiệt không lớn. Hàm lƣợng đƣờng sót ở 30 oC là thấp nhất. 40 Hàm lƣợng acid tổng số (g/l) 6 4 25 2 30 0 35 3 5 7 Thời gian (ngày) 9 Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ở các nhiệt độ lên men Qua biểu đồ trên, thấy hàm lƣợng acid tổng số tăng theo thời gian lên men và nhiệt độ lên men. Ở nhiệt độ 25o C hàm lƣợng acid tổng số tạo ra là thấp nhất. Ở nhiệt độ 30oC hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo ra là cao nhất. Điểm 17 16.5 Tổng điểm 16 15.5 25 30 35 Nhiệt độ Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 9 ngày lên men ở các nhiệt độ khác nhau Qua biểu đồ hình 3.15, 3.16, ta thấy ở ngƣỡng nhiệt độ 30 oC quá trình lên mem cho hàm lƣợng acid tổng số cao nhất và hàm lƣợng đƣờng sót là thấp nhất, đây là nhiệt độ cực thuận cho quá trình lên men. Ở nhiệt độ này cũng cho sản phẩm có chất lƣợng cảm quan khá hơn ở 25oC và 35oC (hình 3.17). Ở nhiệt độ 35oC ức chế quá trình sinh trƣởng lên men và tạo màng vì ở nhiệt độ 41 cao sẽ làm bay hơi acid acetic tạo thành trong môi trƣờng làm tăng làm tăng pH dịch lên men, gây ảnh hƣởng tới quá trình lên men. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Ghosh và cộng sự (2012): Nhiệt độ thuận lợi cho vi khuẩn Acetobacter sản xuất acid là 30oC [19]. Vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn lên men kombucha ở nhiệt độ 30 oC. 3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men kombucha Hầu hết tất cả các vi sinh vật cần nguồn cacbon cho sự trao đổi chất để sinh trƣởng và phát triển. Ngoài ra, cacbon còn là thành phần cơ bản của tất cả các chất cấu tạo nên nguyên sinh chất. Reiss (1994) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của các loại đƣờng nhƣ sucrose, lactose, glucose và fructose ở các nồng độ khác nhau (50 – 150g/l) đến sự trao đổi chất của nấm trà và sự hình thành ethanol và acid lactic [35]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành lên men kombucha ở các hàm lƣợng đƣờng 80g/l, 90g/l, 100g/l, 110g/l, 120g/l [20], theo dõi sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót và hàm lƣợng acid tổng số ở các ngày lên men thứ 3, 5, 7, 9 và đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm sau 9 ngày lên Hàm lƣợng đƣờng sót (Brix) men. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở hình 3.18, 3.19 và hình 3.20. 12 10 8 80 6 90 4 100 2 110 0 120 0 3 5 7 Thời gian (ngày) 9 Hình 3.18. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót phụ thuộc vào hàm lƣợng đƣờng 42 Hàm lƣợng đƣờng sót giảm theo thời gian lên men, mức giảm ở các Hàm lƣợng acid tổng số (g/l) hàm lƣợng đƣờng theo thời gian khác nhau không đáng kể. 8 6 80 4 90 100 2 110 0 3 5 7 Thời gian (ngày) 9 120 Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số phụ thuộc vào hàm lƣợng đƣờng Qua biểu đồ hình 3.19, ta thấy hàm lƣợng acid tổng số tăng theo thời gian lên men, ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo ra là khác nhau. Hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo ra cao nhất ở hàm lƣợng đƣờng là 100g/l. Ở hàm lƣợng đƣờng quá cao 120g/l, việc vận chuyển các chất qua màng tế bào trở nên khó khăn dẫn đến ức chế quá trình hình Điểm thành sản phẩm (Frank, 1995) [18]. 18 17 16 15 14 13 Tổng điểm 80 g/l 90 g/l 100 g/l 110 g/l Hàm lƣợng đƣờng 120g/l Hình 3.20. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau 43 Qua biểu đồ hình 3.20, thấy ở hàm lƣợng đƣờng 100g/l cho sản phẩm kombucha có chất lƣợng cảm quan khá hơn ở các hàm lƣợng đƣờng khác. Nhƣ vậy, hàm lƣợng đƣờng ảnh hƣởng đến quá trình lên men kombucha. Ở hàm lƣợng đƣờng 100g/l, lƣợng acid tổng số tạo ra cao nhất, hàm lƣợng đƣờng sót tƣơng đối thấp, đây là hàm lƣợng đƣờng phù hợp cho quá trình lên men kombucha. Vậy, chúng tôi quyết định bổ sung đường 100g/l cho nước chè Ngọc Thanh lên men kombucha đối với chủng nghiên cứu. 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Từ dịch chè đƣờng Ngọc Thanh lên men tự nhiên, đã phân lập đƣợc 12 chủng vi khuẩn trong đó có 9 chủng vi khuẩn Acetobacter. Tuyển chọn đƣợc 1 chủng vi khuẩn A1 có khả năng sinh acid cao và cho sản phẩm kombucha có chất lƣợng cảm quan khá. Đã phân lập đƣợc 2 chủng nấm men, và tuyển chọn đƣợc 1 chủng nấm men M1 có hoạt lực lên men và khả năng kết lắng tốt. Lựa chọn chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 làm đối tƣợng cho các nghiên cứu tiếp theo. 1.2. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1. Thời gian nhân giống cho chủng nấm men M1 là 36 giờ và chủng vi khuẩn A1 lấy ở thời điểm 72 giờ. 1.3. Lựa chọn hàm lƣợng đƣờng bổ sung cho dịch nƣớc chè là 100g/l và lên men ở nhiệt độ 30oC, sản phẩm kombucha lên men trên môi trƣờng nƣớc chè Ngọc Thanh có hàm lƣợng đƣờng sót thấp, hàm lƣợng acid tổng số cao, sản phẩm có chất lƣợng cảm quan khá. 2. Kiến nghị Vì điều kiện và thời gian nghiên cứu có hạn, nhiều vấn đề chƣa thực hiện đƣợc, do đó chúng tôi đề nghị: 2.1. Tiếp tục tuyển chọn các chủng vi khuẩn, nấm men thuần khiết, có hiệu suất lên men kombucha từ nƣớc chè đƣờng cao, cho sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng. 2.2. Tiếp tục nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men kombucha, xây dựng quy trình lên men kombucha từ nƣớc chè đƣờng. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Ngô Xuân Cƣờng, Nguyễn Thị Bích Ngọc (2013). Nghiên cứu phƣơng pháp lên men nƣớc giải khát từ chè xanh. Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 57- 63. [2]. Nguyễn Lân Dũng ( 1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1-2-3, Nxb Khoa học &kĩ thuật, Hà Nội. [3]. Nguyễn Thành Đạt (1999), Cơ sở vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục. [4]. Vũ Thị Minh Đức (2001). Thực tập vi sinh vật. Nxb ĐHQG Hà Nội, tr.1 - 50. [5]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vƣơng Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Đại học Sƣ Phạm Hà Nội. [6]. Lê Thị Huệ (2013). Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên, luận văn Thạc sĩ sinh học, Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. [7]. Lâm Thị Hồng Liên (2013). Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang, luận văn Thạc sĩ sinh học, Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. [8]. Phạm Hồng Quang, Nguyễn Vân Sơn và Lê Thị Mỹ Xuyên (2014). Phân lập, tuyển chọn nấm men và vi khuẩn acid acetic thử nghiệm lên men trà thủy sâm (kombucha). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 34, 12 – 19. [9]. Trần Thị Ngọc Mai (2010). Nghiên cứu sản xuất kombucha. Hội nghị nghiên cứu khoa học cấp trường. Trƣờng Đại học Kỹ thuật công nghệ thực phẩm TP. Hồ Chí Minh.. [10]. Lê Thị Thanh Mai (2007). Các phƣơng pháp phân tích nghành công nghệ lên men. Nxb Khoa học và Kỹ thuật. 46 [11]. Trần Linh Thƣớc (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật, Nxb giáo dục, tr. 1- 29, 40- 69. [12]. Hà Duyên Tƣ (2006), Kỹ thuật phân tích đánh giá cảm quan thực phẩm, Nxb Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. [13]. Cazjia W., Young D.J.; Kawechi M., Brown. R. M. (2007), The future prospects of microbial cellulose in biomed ical applications, Biomacromolecules, Vol. 8, pp. 1-12. [14]. Danielova LT. 1954. K morfologii “čajnogo griba”. Trudy Erevanskogo Zooveterinarnogo Institute. 17, 201–217. [15]. Dufresne, C. and Farnworth, E., (2000). Tea, Kombucha, and health: a review. Food Research International, 33: 409-421. [16]. Dutta D, Gachhui R. (2006). Novel nitrogen-fixing Acetobacter nitrogenifigens sp. nov., isolated from kombucha tea. Int J Syst Evol Microbiol 56, 1899–903. [17]. Dutta D, Gachhui R. (2007). Nitrogen-fixing and cellulose-producing Gluconacetobacter kombuchae sp. nov., isolated from kombucha tea. Int J Syst Evol Microbiol, 57, 353–7. [18]. Frank, G. W. (1995). Kombucha – Healthy beverage and natural remedy from the Far East, Ninth ed. Wilhelm Ennsthaler, Austria, pp.150. [19]. Ghosh, S., R. Chakraborty, G. Chatterjee and U. Raychaudhuri (2012), Study on fermentation conditions of palm juice vinegar by response surface methodology and development of a kinetic model. Brazilian Journal of Chemical Engineering. 29(3), 416 – 472. [20]. Goh, W.N., RosmaA., Kaur, B., et al (2012). Fermentation of black tea broth (Kombucha): I. Effects of sucrose concentration and fermentation time on the yield of microbial cellulose. International Food Research Journal 19(1), 109-117. 47 [21]. Herrera T, Calderon-Villagomez A. (1989). Species of yeasts isolated in Mexico from the tea fungus. Rev Mex Micol, 5, 205–10. [22]. Hesseltine CW. (1965). A millenium of fungi Food and fermentation. Mycologia, 57,148–67. [23]. Jayabalan R, Marimuthu S, Thangaraj P, Sathishkumar M, Binupriya AR, Swaminathan K, Sei EY. (2008). Preservation of kombucha teaeffect of temperature on tea components and free radical scavenging properties. J Agri Food Chem 56, 9064–71. [24]. Jayabalan, R., Subathradevi, P., Marimuthu, S., Sathishkumar, M. and Swaminathan, K. (2008). Changes in the free- radical scavenging ability of Kombucha tea during fermentation. Food Chemistry, 109, 227-234. [25]. Konovalov IN, Litvinov MA, Zakman LM. (1959). Izmenenie prirody ifiziologiceskih giseviiLindau) osobennostej čajnogo griba (Medusomyces vzavisnosti ot uslovij kul'tivirovanija. Bot Žurnal (Moscow), 44,346–9. [26]. Kozaki M, Koizumi A, Kitahara K. (1972). Microorganisms of zoogloeal mats formed in tea decoction. J Food Hyg Soc (Jpn), 13, 89–96. [27]. Kurtzman CP, Robnett CJ, Basehoar-Powers E.(2001).Zygosaccharomyces kombuchaensis, a new ascosporogenous yeast from “kombucha tea”. FEMS Yeast Res, 1, 133–8. [28]. Liu CH, Hsu WH, Lee FL, Liao CC. (1996). The isolation and identification of microbes from a fermented tea beverage, Haipao, and their interactions during Haipao fermentation. Food Microbiol, 13, 407–15. [29]. Markov SL, Malbaša RV, Hauk MJ, Cvetković DD. (2001). Investigation of tea fungus microbe associations. Technol, 32,133–8. 48 The yeasts. Acta Period [30]. Marsh AJ, O'Sullivan O, Hill C, Ross RP, Cotter PD. (2014). Sequence-based analysis of the bacterial and fungal compositions of multiple kombucha (tea fungus) samples. Food Microbiol, 38, 171–8. [31]. Mayser P, Fromme S, Leitzmann C, Gründer K. (1995). The yeast spectrum of “tea fungus Kombucha”. Mycodes, 38, 289–95. [32]. Milanovic Spasenija, Kanuric Katarina, Vukic Vladimir, et al (2012). Physicochemical and textural properties of kombucha fermented dairy products. African Journal of Biotechnology,Vol. 11(9), 2320-2327. [33]. Ramadani AS, Abulreesh HH. (2010). Isolation and identification of yeast flora in local kombucha sample: Al nabtah. Umm Al Qura Univ J App Sci, 2, 42–51. [34]. Reiss J. (1987). Der Teepilz und seine Stoffwechselprodukte. Dtsch Lebensmittel-Rundschau, 9, 286–90. [35]. Reiss, J. (1994). Influence of different sugars on the metabolism of the tea fungus. Zeitschrift für Lebensmittel - Untersuchung und -Forschung A, 198, 258-261. [36]. Roussin MR. (1996). Analyses of kombucha ferments: Report on growers. Information Resources, LC, Salt Lake City, Utah, USA. [37]. Safak S, Mercan N, Aslim B, Beyatli Y. (2002). A study on the production of poly-beta-hydroxybutyrate by some eukaryotic microorganisms. Turk Electron J Biotechnol Special issue, 11–7. [38]. Sievers M, Lanini C, Weber A, Schuler-Schmid U, Teuber M. (1995). Microbiology and fermentation balance in a kombucha beverage obtained from a tea fungus fermentation. Syst Appl Microbiol, 18, 590–4. [39]. Soheir S. Abd El – Salam. (2012). Bacterial cellulose of Kombucha mushroom tea. New York Science Journal, 5(4), 81- 87. 49 [40]. Sreeramulu, G., Zhu, Y. & Knol, W. (2000). Kombucha Fermentation and Its Antimicrobial Activity. Journal of Agicultural and Food Chemistry, 48, 2589 – 2594. [41]. Teoh AL, Heard G, Cox J. (2004). Yeast ecology of kombucha fermentation. Int J Food Microbiol, 95,119–26. [42]. Yang Z, Zhou F, Ji B, Li B, Luo Y, Yang L, Li T. (2010). Symbiosis between microorganisms from kombucha and kefir: potential significance to the enhancement of kombucha function. Appl Biochem Biotechnol, 160, 446–55. [43]. http://cand.com.vn/News/PrintView.aspx?ID=153269. [44]. http://www.docstoc.com/docs/75114545/TR%C3%80D%C6%AF%E1%BB%A0NG-SINH-KOMBUCHA-(DOC) [45]. http://www.highlandhoney.net/2013/12/che-xanh-pha-mat-ong-co-tac-dung-gi.html [46]. http://tvdt.khoahoctre.com.vn/index.php/thƣ-viện/tìm-kiếm.html?. [47]. http://tuoitre.vn/tin/song-khoe/20101217/tra-kombucha-va-suc khoe/416138.html 50 [...]...2 Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh thơm ngon, bổ dƣỡng 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh 3.2 Động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến lên men kombucha 4 Ý nghĩa khoa học và ý... bình tổng thể 25 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh 3.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic 3.1.1.1 Phân lập vi khuẩn Acetobacter Nguyên liệu: Nguyên liệu đƣợc sử dụng để phân lập là lá chè tƣơi tại xã Ngọc Thanh, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc Quy trình phân lập gồm các 7 bƣớc:... nƣớc chè đã loại bỏ bã Phủ lên trên miệng hũ một lớp vải mỏng 26 và cất giử ở nơi không có côn trùng, bào tử nấm mốc Sau 7 – 10 ngày lên men tự nhiên tiến hành phân lập vi khuẩn, nấm men Hình 3.1 Lá chè thu mẫu Hình 3.2 Dịch kombucha lên men tự nhiên từ chè Ngọc Thanh Bƣớc 2: Phân lập thu các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha Tiến hành phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phƣơng pháp Vinogradski... rẻ tiền, lên men tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng, có lợi cho sức khỏe con ngƣời 5 Điểm mới của đề tài Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 có thể dùng cho lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh tốt Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ và hàm lƣợng đƣờng bổ sung cho dung dịch nƣớc chè Ngọc Thanh lên men kombucha 2 NỘI DUNG CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về sản phẩm kombucha. .. khoa học Tìm ra một số chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha thơm ngon, bổ dƣỡng trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng Ngọc Thanh 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng lá chè xanh khu vực xã Ngọc Thanh, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc lên men kombucha phục vụ cho đời sống nhân dân, góp phần nâng cao giá trị cây chè Tạo ra sản phẩm mới góp phần làm đa dạng các sản phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngày càng... liệu Bƣớc 2: Phân lập, thu các chủng vi khuẩn Bƣớc 3: Tuyển chọn các chủng Gram âm Bƣớc 4: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid Bƣớc 5: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid acetic Bƣớc 6: Thử hoạt tính catalaza Bƣớc 7: Xác định khả năng hình thành màng cellulose Trong quy trình trên, bƣớc 1 làm giàu nguồn nguyên liệu nhằm bẫy vi khuẩn Acetobacter và nấm men từ tự nhiên đến khƣ trú Bƣớc 2, 3,... malonic và lƣợng lớn vitamin B Hình 1.1 Sản phẩm trà Kombucha 3 1.1.1 Quá trình lên men kombucha Quá trình lên men kombucha gồm hai quá trình xảy ra đồng thời là lên men rƣợu và lên men acetic với sự tham gia của nấm men và vi khuẩn acetic [9] Nấm men có khả năng chuyển hóa đƣờng thành etanol và CO 2 trong điều kiện yếm khí Đầu tiên, đƣờng cùng các chất dinh dƣỡng khác của môi trƣờng lên men đƣợc hấp phụ... dịch có độ chua – ngọt tƣơng tự kombucha [1] Các công trình nghiên cứu về hệ vi sinh vật kombucha còn khá ít Năm 2012, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cộng sự, Đại học Mở TP Hồ Chí Minh đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả 15 tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột” Trong đề tài, hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, ... Lên men lactic đƣợc thực hiện bởi hệ enzim của các vi khuẩn họ Lactobacteriaceae (vi khuẩn này là vi khuẩn yếm khí hoặc vi khuẩn hiếu khí) Phụ thuộc vào hệ enzim của từng nòi vi khuẩn trong môi trƣờng lên men hoặc chỉ có axit lactic (lên men đồng hình) hoặc ngoài axit lactic còn có các sản phẩm khác và CO2 (lên men dị hình) 4 1.2.2 Thành phần và công dụng của kombucha Trà kombucha chứa nhiều loài vi. .. 9 CaCO3 10 100 2.1.5 Phạm vi nghiên cứu Các chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh 2.1.6 Thời gian, địa điểm nghiên cứu Thời gian: tháng 6 năm 2014 đến tháng 3 năm 2015 Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh 2.2.1.1 Phương pháp phân lập Phân lập theo phƣơng pháp Vinogradski và Beijerinck,