5. Điểm mới của đề tài
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Tủ ấm vi sinh (Heraeus-Đức), tủ sấy (Heraeus-Đức), nồi hấp (TOMY- Nhật), máy lắc ổn nhiệt (BR300LF-Nhật), pipette (lapsystem-Phần Lan), máy đo pH (MP200R-Thụy Sĩ), rƣợu kế, nhiệt kế, máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh), Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)….
2.1.4. Hóa chất và các loại môi trường
Hóa chất:
Nguồn cacbon: glucose (C6H12O6), saccharose (C12H22O11), acid acetic. Nguồn nitơ: pepton, (NH4)2SO4.
Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4, NaCl, CaCO3. Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol.
H2SO4 60%, FeCl3.
Nƣớc chè Ngọc Thanh.
Các loại môi trƣờng:
Các thành phần của môi trƣờng đƣợc hòa tan trong 1000ml nƣớc cất. Môi trƣờng phân lập và nhân giống của vi khuẩn đƣợc bổ sung acid acetic, rƣợu etylic 2% sau khi thanh trùng.
Bảng 2.1. Các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu STT Thành phần Môi trƣờng lên men (chè đƣờng) (g/l) Môi trƣờng phân lập và giữ giống (g/l) Môi trƣờng nhân giống (g/l) Vi khuẩn Nấm men Vi khuẩn Nấm men 1 1 Lá chè 150 2 2 MgSO4.7H2O 2 2 2 2 3 3 KH2PO4 2 3 2 3 4 4 (NH4)2SO4 3 2 3 2 5 5 Pepton 4 10 4 10 6 6 saccarozo 100 7 7 Glucose 20 50 20 50 8 8 Agar 20 15 -20 9 9 CaCO3 10 2.1.5. Phạm vi nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh.
2.1.6. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Thời gian: tháng 6 năm 2014 đến tháng 3 năm 2015.
Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp phân lập
Phân lập theo phƣơng pháp Vinogradski và Beijerinck, phân lập sau khi đã làm giàu.
Nguồn nguyên liệu: Mẫu màng lên men tự nhiên và dịch trà lên men
Tiến hành phân lập: Vớt mẫu màng, cắt nhỏ, cho vào ống nghiệm
chứa nƣớc cất thanh trùng. Lắc đều bằng máy vonotex trong 5 phút thu đƣợc dịch huyền phù vi sinh vật. Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau từ 10-1
đến 10-10. Dùng pipetman hút 50μl mẫu ở các độ pha loãng 10-3
đến 10-10
nhỏ lên mặt môi trƣờng thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que chang chang đều. Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30o
C trong 5 – 7 ngày. Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trƣng ra khỏi môi trƣờng phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 4o
C.
2.2.1.2. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram, nhuộm đơn.
Nhuộm Gram: là phƣơng pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại
thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhắm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protein đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt.
Để tiến hành phƣơng pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua sơ tuyển làm tiêu bản. Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu đƣợc giúp ta phân biệt đƣợc vi khuẩn Gr-
hay Gr+.
Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nhuộm Gram là: nhuộm màu cơ bản bằng thuốc nhuộm tím (gential violet…), tất cả các vi khuẩn đều bắt màu tím; nhuộm tăng cƣờng bằng dung dich Lugo, thuốc nhuộm này kết hợp với thuốc nhuộm Gential violet thành phức hợp bền màu hơn ở các vi khuẩn G+; tẩy màu, dùng chất tẩy màu (cồn 90%), ở thành tế bào G- thì liên kết giữa tổ hợp thuốc nhuộm này lỏng lẻo hơn ở vi khuẩn G+
nên dễ bị rửa trôi; nhuộm phân biệt bằng thuốc nhuộm khác.
Nếu sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr-, bắt màu tím là vi khuẩn Gr+. Vi khuẩn Gr-
bị rửa trôi bởi cồn. Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr-
mới bắt màu hồng của Fucshin [5].
Nhuộm đơn: Nhuộm đơn là phƣơng pháp nhuộm sử dụng một loại
thuốc nhuộm. Tiến hành làm vết bôi vi sinh vật, sau đó nhỏ một, hai giọt xanh metylen hay fuchsin (1:100)…. Để hai phút, thấm khô tiêu bản, soi kính.
Soi tiêu bản dƣới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH- 2 (độ phóng đại 1000 lần).
2.2.1.3. Phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch đĩa.
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi sinh vật, pha loãng theo phƣơng pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trƣờng thạch đĩa. Nuôi ở 300C sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trƣờng đĩa petri, từ đó xác định số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức [5].
1000 1
. .
100 10 n
N A
Trong đó: N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu.
A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri. 10-n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy.
2.2.1.4. Bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trƣờng giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 300C. Sau đó giữ trong tủ lạnh 40C dùng cho nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [3].
2.2.1.5. Phương pháp hoạt hóa giống
Giống từ ống nghiệm đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, trƣớc khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lƣợng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phƣơng pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trƣờng tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210
đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [4], [11].
2.2.1.6. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
Hàm lƣợng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt. Phƣơng pháp: dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trƣờng, có cùng một lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại.
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH có phenolphtalain 0,1% làm chỉ thị
Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men, thêm vào đó 1 – 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Sau đó tính số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men theo công thức [10]:
( )
Trong đó: X : Số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men
V : Số ml NaOH 0,1N d ng để chuẩn độ 10 ml dung dịch lên men
K : ượng acid tổng số tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N (K 0,006)
10 : Số ml dịch lên men đem chuẩn độ V : số ml dịch quả đã lấy để phân tích
2.2.2.2. Đo hàm lượng chất khô bằng khúc xạ kế
Dùng nƣớc cất rửa sạch mặt kính bên trong khúc xạ kế và dùng giấy thấm lau khô thiết bị. Dùng ống nhỏ giọt lấy mẫu nhỏ lên mặt kính của khúc xạ kế và đậy nắp lại. Đƣa khúc xạ kế hƣớng ra ánh sáng và nhìn vào ống kính ta thấy hai vùng hồng và trắng. Vạch ngăn cách giữa hai vùng chỉ vào giá trị
nào thì giá trị đó chính là nồng độ chất khô của dung dịch. Nếu khi nhìn vào chỉ có vùng sáng thì nồng độ chất khô của dịch có giá trị lớn hơn khoảng giá trị đo có của khúc xạ kế. Ngƣợc lại, nếu khi nhìn vào chỉ có vùng tối thì nồng độ chất khô của dịch có giá trị nhỏ hơn khoảng giá trị đo của khúc xạ kế.
2.2.2.3. Phát hiện hoạt tính catalaza
Các vi sinh vật có enzim chứa flavoprotein khử O2 tạo ra H2O2 hoặc O2-
đây là những chất oxi hóa cực mạnh, phá hủy nhanh chóng cấu trúc của tế bào. Nhiều loài vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzim chuyển hóa các chất trên. Các enzim này có thể là superoxidismutaza (SOD), catalaza hoặc peroxidaza nhƣ phƣơng trình sau đây [5]:
2O2 + 2H2 → O2 +2H2O (SOD) 2H2O2 → H2O + O2 (Catalaza)
2YH + H2O2 → H2O + 2Y (peroxydaza)
2.2.2.4. Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic
Sử dụng môi trƣờng sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn [6].
Thành phần (g/l): Cao nấm men: 10g Canxi acetat : 10g Thạch : 20g Nƣớc máy : 1000ml pH : 7,0-7,2
Quan sát hiện tƣợng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dƣơng tính, ngƣợc lại là âm tính.
2.2.2.5. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300
C trong vòng 3 - 4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá thành màu xanh lam [6].
2.2.3. Phương pháp cảm quan
Phân tích cảm quan thực phẩm là kỹ thuật sử dụng cơ quan cảm giác của con ngƣời để tìm hiểu mô tả và định lƣợng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm nhƣ: màu sắc, mùi vị... Cảm quan của kombucha đƣợc đánh giá trên một số chỉ tiêu theo TCVN 3215 – 79 [12]:Số điểm chƣa có trọng lƣợng là số điểm cho tƣơng ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu chất lƣợng và đƣợc quy định trong bảng 2.2 (trang 24), hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu đƣợc quy định trong bảng 2.3 (trang 25), đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm
Số thứ tự Mức chất lƣợng Số điểm chung
Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chƣa có trọng lƣợng của hội đồng cảm
quan 1 Loại tốt 18,6 – 20,0 Mùi : 4,8 Vị : 4,8 2 Loại khá 15,2 – 18,5 Mùi : 3,8 Vị : 3,8 3 Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8
4 Loại kém 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8
5 Loại rất
kém 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,0
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha Tên chỉ tiêu Điểm chƣa có trọng lƣợng Yêu cầu Độ trong và màu sắc
5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm
4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu đặc trƣng cho sản phẩm.
3 Chất lỏng trong, có tƣơng đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trƣng của sản phẩm. 2
Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng, màu khác nhiều so với màu đặc trƣng của sản phẩm.
1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc trƣng cho sản phẩm. 0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng
Mùi
5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm. 4 Chƣa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trƣng cho sản phẩm
nhƣng hơi khó nhận thấy.
3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trƣng cho sản phẩm 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trƣng cho sản phẩm 1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trƣng cho sản phẩm 0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Vị
5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm
4 Chƣa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trƣng cho sản phẩm bình thƣờng.
3 Chƣa hòa hợp, hơi gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trƣng cho sản phẩm.
2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trƣng cho sản phẩm 0 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hỏng
Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 2 3 Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2,0 Tổng cộng 4,0
2.2.4. Phương pháp phân tích thống kê
Xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp trong cuốn “Thống kê và ứng dụng” nhƣ:
* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
thí nghiệm. 1 1 n i i X X n Trong đó X: trung bình tổng thể
Xi: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n n: số lần thí nghiệm
* Trung bình bình phƣơng các sai lệch
1 ) ( 1 2 n X X n i i Trong đó: δ : độ lệch chuẩn
Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n X: trung bình tổng thể
* Sai số đại diện của trung bình cộng m n
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:
X x
Cv 100
Trong đó Cv: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể δ: độ lệch chuẩn
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh
3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic
3.1.1.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter
Nguyên liệu: Nguyên liệu đƣợc sử dụng để phân lập là lá chè tƣơi tại
xã Ngọc Thanh, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc. Quy trình phân lập gồm các 7 bƣớc:
Bƣớc 1: Làm giàu mẫu nguyên liệu
Bƣớc 2: Phân lập, thu các chủng vi khuẩn Bƣớc 3: Tuyển chọn các chủng Gram âm
Bƣớc 4: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid
Bƣớc 5: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid acetic Bƣớc 6: Thử hoạt tính catalaza
Bƣớc 7: Xác định khả năng hình thành màng cellulose
Trong quy trình trên, bƣớc 1 làm giàu nguồn nguyên liệu nhằm bẫy vi khuẩn Acetobacter và nấm men từ tự nhiên đến khƣ trú. Bƣớc 2, 3, 4, 5 là phân lập thu thập các chủng vi khuẩn thuộc giống Acetobacter và bƣớc 6, 7 là nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng thu đƣợc.
Bƣớc 1: Thu mẫu lá chè tƣơi tại Xã Ngọc Thanh, Thị xã Phúc Yên, tỉnh
Vĩnh Phúc, loại bỏ lá úa, bỏ cọng. Sau đó, lá chè đƣợc rửa sạch, để ráo và chiết xuất chất tan ở nhiệt độ 95 – 100oC, trong thời gian 20 phút. Để nguội khoảng 20 – 30oC bổ sung đƣờng saccharose 100g, acid acetic 10ml vào 1000ml dịch nƣớc chè đã loại bỏ bã. Phủ lên trên miệng hũ một lớp vải mỏng
và cất giử ở nơi không có côn trùng, bào tử nấm mốc. Sau 7 – 10 ngày lên men tự nhiên tiến hành phân lập vi khuẩn, nấm men.
Hình 3.1. Lá chè thu mẫu Hình 3.2. Dịch kombucha lên men tự nhiên từ chè Ngọc Thanh Bƣớc 2: Phân lập thu các chủng vi khuẩn có khả năng lên men
kombucha. Tiến hành phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phƣơng pháp
Vinogradski và Beijerinck. Dựa vào đặc điểm màu sắc, kích thƣớc khuẩn lạc đã phân lập đƣợc 12 mẫu vi khuẩn khác nhau, tạm gọi mỗi mẫu là một chủng vi khuẩn. Đặc điểm khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng phân lập đƣợc
STT Tên chủng
Kích thƣớc
khuẩn lạc (mm) Đặc điểm khuẩn lạc Hình ảnh
1 A1 1,5 - 3 Khuẩn lạc màu trắng trong, bóng, nhầy, hình cầu,rìa ngoài bằng phẳng. 2 A2 2,5 - 3 Khuẩn lạc màu trắng trong, hình cầu, bề mặt khuẩn lạc có nhân hơi nhô lên ở
giữa.
3 A3 1 - 2
Khuẩn lạc màu trắng đục, hình cầu, bề mặt khuẩn lạc có nhân nhô lên ở giữa
4 A4 2 - 3 Khuẩn lạc màu trắng đục, mép khuẩn lạc hình răng cƣa. 5 A5 1 – 2,5 Khuẩn lạc màu trắng trong bóng, nhầy nhớt, bề mặt khuẩn lạc không nhô cao, mép khuẩn lạc bằng
6 A6 1 - 2
Khuẩn lạc màu trắng ngà, có nhân lồi cao
ở giữa, bờ ngoài khuẩn lạc tròn đều. 7 A7 1,5 - 2 Khuẩn lạc màu đỏ, hình cầu. 8 A8 0,5 - 1 Khuẩn lạc màu vàng nhạt, hình cầu. 9 A9 2,5 - 3 Khuẩn lạc có màu trắng trong, bóng, nhầy nhớt, hình cầu, có nhân trắng đục ở giữa.
Bƣớc 3: Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn thu đƣợc. Thấy 12 chủng vi
khuẩn này bắt màu hồng của thuốc nhuộm, chúng là các vi khuẩn Gram âm.