5. Điểm mới của đề tài
3.1.1.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter
Nguyên liệu: Nguyên liệu đƣợc sử dụng để phân lập là lá chè tƣơi tại
xã Ngọc Thanh, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc. Quy trình phân lập gồm các 7 bƣớc:
Bƣớc 1: Làm giàu mẫu nguyên liệu
Bƣớc 2: Phân lập, thu các chủng vi khuẩn Bƣớc 3: Tuyển chọn các chủng Gram âm
Bƣớc 4: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid
Bƣớc 5: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid acetic Bƣớc 6: Thử hoạt tính catalaza
Bƣớc 7: Xác định khả năng hình thành màng cellulose
Trong quy trình trên, bƣớc 1 làm giàu nguồn nguyên liệu nhằm bẫy vi khuẩn Acetobacter và nấm men từ tự nhiên đến khƣ trú. Bƣớc 2, 3, 4, 5 là phân lập thu thập các chủng vi khuẩn thuộc giống Acetobacter và bƣớc 6, 7 là nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng thu đƣợc.
Bƣớc 1: Thu mẫu lá chè tƣơi tại Xã Ngọc Thanh, Thị xã Phúc Yên, tỉnh
Vĩnh Phúc, loại bỏ lá úa, bỏ cọng. Sau đó, lá chè đƣợc rửa sạch, để ráo và chiết xuất chất tan ở nhiệt độ 95 – 100oC, trong thời gian 20 phút. Để nguội khoảng 20 – 30oC bổ sung đƣờng saccharose 100g, acid acetic 10ml vào 1000ml dịch nƣớc chè đã loại bỏ bã. Phủ lên trên miệng hũ một lớp vải mỏng
và cất giử ở nơi không có côn trùng, bào tử nấm mốc. Sau 7 – 10 ngày lên men tự nhiên tiến hành phân lập vi khuẩn, nấm men.
Hình 3.1. Lá chè thu mẫu Hình 3.2. Dịch kombucha lên men tự nhiên từ chè Ngọc Thanh Bƣớc 2: Phân lập thu các chủng vi khuẩn có khả năng lên men
kombucha. Tiến hành phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phƣơng pháp
Vinogradski và Beijerinck. Dựa vào đặc điểm màu sắc, kích thƣớc khuẩn lạc đã phân lập đƣợc 12 mẫu vi khuẩn khác nhau, tạm gọi mỗi mẫu là một chủng vi khuẩn. Đặc điểm khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng phân lập đƣợc
STT Tên chủng
Kích thƣớc
khuẩn lạc (mm) Đặc điểm khuẩn lạc Hình ảnh
1 A1 1,5 - 3 Khuẩn lạc màu trắng trong, bóng, nhầy, hình cầu,rìa ngoài bằng phẳng. 2 A2 2,5 - 3 Khuẩn lạc màu trắng trong, hình cầu, bề mặt khuẩn lạc có nhân hơi nhô lên ở
giữa.
3 A3 1 - 2
Khuẩn lạc màu trắng đục, hình cầu, bề mặt khuẩn lạc có nhân nhô lên ở giữa
4 A4 2 - 3 Khuẩn lạc màu trắng đục, mép khuẩn lạc hình răng cƣa. 5 A5 1 – 2,5 Khuẩn lạc màu trắng trong bóng, nhầy nhớt, bề mặt khuẩn lạc không nhô cao, mép khuẩn lạc bằng
6 A6 1 - 2
Khuẩn lạc màu trắng ngà, có nhân lồi cao
ở giữa, bờ ngoài khuẩn lạc tròn đều. 7 A7 1,5 - 2 Khuẩn lạc màu đỏ, hình cầu. 8 A8 0,5 - 1 Khuẩn lạc màu vàng nhạt, hình cầu. 9 A9 2,5 - 3 Khuẩn lạc có màu trắng trong, bóng, nhầy nhớt, hình cầu, có nhân trắng đục ở giữa.
Bƣớc 3: Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn thu đƣợc. Thấy 12 chủng vi
khuẩn này bắt màu hồng của thuốc nhuộm, chúng là các vi khuẩn Gram âm.
Hình 3.3. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A7 (x1000)
Hình 3.4. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A5 (x1000)
Hình 3.5. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A1 (x1000)
Hình 3.6. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A4 (x1000)
Bƣớc 4: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid. Các chủng
Acetobacter có khả năng sinh acid acetic, acid này phân giải CaCO3 trong môi trƣờng do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Cấy các chủng này trên môi trƣờng có bổ sung CaCO3 5g/l, sau 5 – 7 ngày chọn những chủng có khả năng hình thành vong phân giải calcium xung quanh khuẩn lạc.
Hình 3.7. Khả năng oxy hóa acetate của chủng vi khuẩn A1
Sau bƣớc này chúng tôi thu đƣợc 9 chủng A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 sinh acid nhƣng chƣa khẳng định đƣợc acid đó là acid acetic. Vì
vậy, chúng tôi tiến hành định tính acid acetic trong mẫu dịch lên men của từng chủng vi khuẩn.
Bƣớc 5: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid acetic. Tiến hành
thí nghiệm lên men từng chủng vi khuẩn thu đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng đƣợc pha theo tỉ lệ lá chè là 150g/l và đƣờng là 100g/l. Sau 7 ngày lên men tiến hành định tính acid acetic. Kết quả mẫu dịch lên men của 9 chủng vi khuẩn A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 có phản ứng dƣơng tính.
a. Dịch trà kombucha b. Đun sôi dịch kombucha (bổ sung FeCl3)
c.Phản ứng tạo acetatate sắt màu đỏ thẫm
d. Mẫu đối chứng (acid acetic)
Hình 3.8. Định tính acid acetic 3 4 2 1 1 2 3
Kết quả tuyển chọn bƣớc 4 và bƣớc 5 cho thấy, có 9 chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid actic và có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cacbon. Theo Bergey (1992), chi Acetobacter có khả năng oxy hóa acetate. Vì thế trong môi trƣờng có chứa calcium acetate, các chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cacbon hay nói cách khác chúng có khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; giải phóng ATP cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào đồng thời giải phóng Ca2+ tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Vì vậy, 9 chủng vi khuẩn này thuộc chi Acetobacter họ Acetobacteraceae [11].
Bƣớc 6: Thử hoạt tính catalaza. Nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn, thấy có 9 chủng vi khuẩn A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 có hiện tƣợng sủi bọt. Điều này chứng tỏ oxy đƣợc giải phóng ra hay 9 chủng vi khuẩn đều có phản ứng catalase dƣơng tính.
Bƣớc 7: Xác định khả năng hình thành màng cellulose. Nhỏ dung dịch
Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng của 9 mẫu vi khuẩn, kết quả có 5 mẫu màng của 9 chủng vi khuẩn xuất hiện màu xanh lam. Vậy màng của 5 chủng vi khuẩn A1, A3, A4, A6, A8, A9 có bản chất là cellulose nên màng bắt màu xanh với iot.
Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính 9 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ dịch trà Kobumcha từ chè Ngọc Thanh STT Tên chủng Đặc điểm A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 1 Bắt màu hồng khi nhuộm Gram + + + + + + + + +
2 Tạo acid acetic + + + + + + + + +
3 Khả năng oxi hóa
axit acetic + + + + + + + + +
4 Hoạt tính catalaza + + + + + + + + +
5 Khả năng tổng
hợp cellulose + - + + - + - + +
Ghi chú: + Kết quả dương tính - Kết quả âm tính
Như vậy, đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn và sơ bộ tuyển chọn được 9 chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter trong họ Acetobacteraceae. 3.1.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha tốt
Tiến hành thí nghiệm lên men từng chủng vi khuẩn thu đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng đƣợc pha theo tỉ lệ lá chè là 150g/l và đƣờng là 100g/l. Sau 7 ngày lên men tiến hành xác định hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo ra bằng chuẩn độ với NaOH có phenolphtalain 0,1% làm chỉ thị và đánh giá cảm quan màng của 9 chủng vi khuẩn. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Bảng hàm lƣợng acid tổng số và chất lƣợng cảm quan sản phẩm của 9 chủng vi khuẩn STT Chủng Hàm lƣợng acid tổng số (g/l) Chất lƣợng cảm quan sản phẩm M1 M2 M1 M2 1 A1 2,78 2,48 18 17 2 A2 1,62 2,34 16 16,5 3 A3 1,66 1,9 15,5 16 4 A4 1,58 1,94 15,5 15,5 5 A5 2,58 1,52 17 15 6 A6 1,2 1,64 15 15 7 A7 1,66 1,22 16 15 8 A8 1,6 1,66 16,5 16 9 A9 2,3 1,8 17 16
Căn cứ vào khả năng sinh acid và chất lƣợng cảm quan sản phẩm đƣợc lên men từ 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter, chúng tôi thấy chủng vi khuẩn A1 có khả năng sinh acid cao và cho sản phẩm có chất lƣợng cảm quan khá. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chủng A1 làm đối tƣợng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men
3.1.2.1. Phân lập các chủng nấm men
Từ dịch trà kombucha đƣợc lên men tự nhiên, chúng tôi tiến hành phân lập nấm men trên môi trƣờng Haxen. Dựa vào hình thái, màu sắc và kích thƣớc khuẩn lạc, thu đƣợc 2 chủng nấm men. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả phân lập các chủng nấm men STT Tên chủng Kích thƣớc khuẩn lạc (mm) Đặc điểm khuẩn lạc Hình ảnh 1 M1 1 - 2 Khuẩn lạc màu trắng ngà, tròn, bề mặt lồi. 2 M2 1,5 – 3,5 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, bề mặt lồi.
Các chủng nấm men đều có khuẩn lạc tròn, bề mặt lồi, bóng, đƣờng kích khuẩn lạc từ 1 – 3,5 mm.
3.1.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha tốt
Bƣớc 1: Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi quang học
Tiến hành nhuộm đơn 2 mẫu nấm men phân lập đƣợc. Kết quả quan sát thấy, tế bào nấm men có hính ovan hoặc hình trứng, sinh trƣởng theo kiểu nảy chồi.
Hình 3.11. Hình thái tế bào học chủng nấm men M1 (x1000)
Hình 3.12. Hình thái tế bào học chủng nấm men M2 (x1000)
Bƣớc 2: Đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men
Nuôi lắc chủng nấm men trong môi trƣờng nhân giống trong vòng 24h. Tiến hành lên men từng chủng nấm men trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng (trích li từ 150g/l lá chè, bổ sung 100g/l đƣờng sacharose), bổ sung 10% dịch giống nấm men và 10% dịch giống vi khuẩn ở nhiệt độ 25 – 30o
C. Sau 3 ngày lên men, đem cân trọng lƣợng bình ban đầu sau đó mở nắp bình lên men, tiếp tục đem cân trọng lƣợng bình thấy trọng lƣợng bình giảm đi. Đó chính là lƣợng CO2 sinh ra trong quá trình lên men. Lƣợng CO2 sinh ra càng nhiều thì trọng lƣợng bình càng giảm, chứng tỏ hoạt lực lên men càng cao. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hoạt lực lên men của các chủng nấm men
Chủng nấm men M1 M2
Lƣợng CO2 thoát ra (g) 0,87 0,8
Qua bảng trên, ta thấy chủng nấm men M1 có hoạt lực lên men cao hơn chủng nấm men M2.
Bƣớc 3: Khả năng kết lắng
Hòa sinh khối nấm men thu đƣợc vào dịch đệm acetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3 – 5 phút và để lắng 20 phút. Kết quả thể hiện ở hình 3.13.
Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn chiều cao cột kết lắng của các chủng nấm men
Biểu đồ trên cho thấy chủng nấm men M1 có khả năng kết lắng cao hơn chủng nấm men M2.
Qua kết quả bƣớc 2 và bƣớc 3, chúng tôi nhận thấy chủng nấm men M1 có hoạt lực lên men và khả năng kết lắng cao hơn chủng nấm men M2. Vì vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn chủng nấm men M2 cho các nghiên cứu tiếp theo.
Như vậy, từ dịch chè đường Ngọc Thanh lên men tự nhiên, chúng tôi đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn trong đó có 9 chủng vi khuẩn Acetobacter. Tuyển chọn được 1 chủng vi khuẩn A1 có khả năng sinh acid cao và cho sản phẩm kombucha có chất lượng cảm quan khá. Đã phân lập được 2 chủng nấm men, và tuyển chọn được 1 chủng nấm men M1 có hoạt lực lên men và khả năng kết lắng tốt. 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17
Chiều cao cột sinh khối (mm)
M1 M2
3.2. Động thái sinh trƣởng chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1
Để nghiên cứu động thái sinh trƣởng các chủng vi khuẩn A1 và nấm men M1, chúng tôi tiến hành cấy chủng trên môi trƣờng nhân giống đặc trƣng, với số lƣợng vi khuẩn ban đầu là 2x106
tế bào/ml và nấm men là 3,5x106 tế bào/ml. Nuôi trên máy lắc 150 vòng/phút ở 35oC. Sau 12h kiểm tra số lƣợng tế bào 1 lần. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1
Thời gian (h) Chủng vi khuẩn A1 Chủng nấm men M1 Số lƣợng tế bào (x106 ) δ Số lƣợng tế bào (x106 ) δ 0 2,00 ± 0,006 0,01 3,50 ± 0,006 0,01 12 10,67 ± 1,01 1,80 23,00 ± 0.69 1,20 24 39,67 ± 1,50 2,60 33,67 ± 0,69 1,20 36 68,67 ± 1,35 2,33 115,00 ± 1,3 2,30 48 119,00 ± 1,35 2,33 103,00 ± 2,22 3,80 60 130,00 ± 1,20 2,00 71,67 ± 0,84 1,50 72 138,67 ± 1,17 2,00 54,67 ± 0,84 1,50 84 110,67 ± 2.22 3,80 96 78,33 ± 1,58 2,70
Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Số lƣ ợn g tế b ào (x 10 6) Thời gian (h) Vi Khuẩn Nấm men
Qua quá trình nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men M1 và chủng vi khuẩn A1 chúng tôi nhận thấy sự phát triển này tuân theo quy luật 4 pha bao gồm pha tiềm phát, pha log, pha cân bằng và pha suy vong. Đối với chủng nấm men M1 ở giờ 36 số lƣợng tế bào là cực đại và sau đó giảm dần; đối với chủng vi khuẩn A1 số lƣợng tế bào cực đại ở giờ 72 và sau đó giảm dần.
Vậy khi chuyển sang môi trường lên men, đối với chủng nấm men M1 chúng tôi lấy ở thời điểm 36 giờ và chủng vi khuẩn A1 lấy ở thời điểm 72 giờ.
3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến lên men kombucha
3.3.1. Nhiệt độ lên men
Tiến hành lên men kombucha ở 25o
C, 30oC, 35oC trong vòng 9 ngày [16], theo dõi sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số, hàm lƣợng đƣờng sót và đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm của dịch lên men. Kết quả thể hiện ở hình 3.15, 3.16 và hình 3.17.
Hình 3.15. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót ở các nhiệt độ lên men
Qua biểu đồ trên, thấy hàm lƣợng đƣờng giảm theo thời gian lên men, sai khác ở các ngƣỡng nhiệt không lớn. Hàm lƣợng đƣờng sót ở 30o
C là thấp nhất. 0 2 4 6 8 10 0 3 5 7 9 Hàm lƣợ ng đƣờ ng sót (B rix )
Thời gian (ngày)
25 30 35
Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ở các nhiệt độ lên men
Qua biểu đồ trên, thấy hàm lƣợng acid tổng số tăng theo thời gian lên men và nhiệt độ lên men. Ở nhiệt độ 25o C hàm lƣợng acid tổng số tạo ra là thấp nhất. Ở nhiệt độ 30oC hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo ra là cao nhất.
Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 9 ngày lên men ở các nhiệt độ khác nhau
Qua biểu đồ hình 3.15, 3.16, ta thấy ở ngƣỡng nhiệt độ 30o
C quá trình lên mem cho hàm lƣợng acid tổng số cao nhất và hàm lƣợng đƣờng sót là thấp nhất, đây là nhiệt độ cực thuận cho quá trình lên men. Ở nhiệt độ này cũng cho sản phẩm có chất lƣợng cảm quan khá hơn ở 25o
C và 35oC (hình 3.17). Ở nhiệt độ 35oC ức chế quá trình sinh trƣởng lên men và tạo màng vì ở nhiệt độ
0 2 4 6 3 5 7 9 Hàm lƣợ n g ac id tổng số (g/l )
Thời gian (ngày)
25 30 35 15.5 16 16.5 17 25 30 35 Điể m Nhiệt độ Tổng điểm
cao sẽ làm bay hơi acid acetic tạo thành trong môi trƣờng làm tăng làm tăng pH dịch lên men, gây ảnh hƣởng tới quá trình lên men. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Ghosh và cộng sự (2012): Nhiệt độ thuận lợi cho vi khuẩn Acetobacter sản xuất acid là 30oC[19].
Vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn lên men kombucha ở nhiệt độ 30o
C.
3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men kombucha
Hầu hết tất cả các vi sinh vật cần nguồn cacbon cho sự trao đổi chất để sinh trƣởng và phát triển. Ngoài ra, cacbon còn là thành phần cơ bản của tất cả các chất cấu tạo nên nguyên sinh chất. Reiss (1994) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của các loại đƣờng nhƣ sucrose, lactose, glucose và fructose ở các nồng độ khác nhau (50 – 150g/l) đến sự trao đổi chất của nấm trà và sự hình