Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 đối tượng nghiên cứu
2.5.4.đánh giá ựặc tắnh sinh học của các chủng vi sinh vật
2.5.4.1. Xác ựịnh hoạt tắnh enzym bằng phương pháp khuếch tán trên ựĩa thạch.
Xác ựịnh hoạt tắnh phân giải xenluloza, CMC, tinh bột, protein của các chủng vi sinh vật theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên ựĩa thạch (Wiliam, 1983).
* Tiến hành:
Môi trường ựược hấp khử trùng trong nồi hấp sau ựó ựổ ra ựĩa peptri. Mỗi ựĩa thạch ựổ dày khoảng 0,2cm, ựợi nguội. Dùng khoan khoan lỗ thạch ựường kắnh 1cm trên hộp lồng.
Nhỏ 0,1ml dịch cấy vào các lỗ ựục, chờ dịch khô ựể trong tủ lạnh 6 Ờ 8 giờ. Cho vào tủ nuôi trong 24 giờ ở 370C ựể enzym có khả năng phản ứng với cơ chất. Nhỏ 5ml lugol vào hộp lồng, tráng ựều lên bề mặt thạch, sau 10 Ờ 15 giây xuất hiện vòng phân giải màu vàng chanh. đo ựường kắnh vòng phân giải.
Hoạt tắnh của enzym ựược xác ựịnh qua kắch thước vòng phân giải theo công thức: (D Ờ d) (mm)
Trong ựó: D là ựường kắnh vòng phân giải d là ựường kắnh lỗ khoan
2.5.4.2. Xác ựịnh thời gian nuôi cấy của các chủng giống vi sinh vật
Các chủng VSV ựược nuôi cấy trên môi trường thạch bằng chuyên tắnh trong tủ ựịnh ôn ở 28 Ờ 350C. Theo dõi thời gian mọc của các chủng vi sinh vật tại các mốc thời gian khác nhau: 16, 24, 36, 48, 60, 72, >72h.
2.5.4.3. Xác ựịnh hình thái, kắch thước khuẩn lạc, hình thái vi sinh vật và sơ bộ ựịnh tên
* Xác ựịnh hình thái, kắch thước khuẩn lạc:
Nuôi cấy các chủng giống vi sinh vật trên môi trường thạch bằng chuyên tắnh ở 28 Ờ 350C, trong 5 ngày. Xác ựịnh hình thái và kắch thước khuẩn lạc theo phương pháp quan sát và ựo trực tiếp bằng thước ựo (cm).
* Quan sát hình thái vi sinh vật và ựịnh tên:
- đối với vi khuẩn: Tiến hành phương pháp nhuộm Gram ựể xác ựịnh vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hay Gram dương, quan sát bằng kắnh hiển vi ựể biết hình thái của vi khuẩn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
- đối với xạ khuẩn và nấm: Xạ khuẩn ựược nuôi cấy trên môi trường Gauze 1, nấm ựược nuôi cấy trên môi trường thạch, khoai tây (PDA) có găm lamen nghiêng 450 trên bề mặt môi trường. Sau 7 Ờ 9 ngày nuôi ở nhiệt ựộ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kắnh hiển vi quang học.
Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay lượn sóng ký hiệu là RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Ratinaculiapert) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira).
So sánh với khóa phẩn loại Klich (2004) ựể sơ bộ ựịnh tên chủng nấm và khóa phân loại Bergey (1989) ựể sơ bộ ựịnh tên các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn.
2.5.4.4. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thắch hợp
Các chủng vi sinh vật ựược nuôi cấy lắc 220vòng/phút ở nhiệt ựộ 28 - 300C với các loại môi trường khác nhau. Sau 5 ngày ựem xác ựịnh sinh khối và hoạt tắnh enzym ngoại bào của các chủng vi sinh vật. So sánh kết quả thu ựược ựể lựa chọn ra môi trường nuôi cấy thắch hợp nhất.
2.5.4.5. Xác ựịnh sinh khối
Cân giấy lọc ựã ựược sấy khô ựến khối lượng không ựổi (ở 1050C/2h). Lọc dịch nuôi cấy qua giấy lọc, ựem sấy khô giấy lọc ựến trọng lượng không ựổi. Cân lại giấy lọc. Trọng lượng khô của tế bào ựược xác ựịnh bằng công thức:
P(g) = P2 Ờ P1
Trong ựó: P: Khối lượng khô của sinh khối P1: Khối lượng khô của giấy lọc
P2: Tổng khối lượng khô của giấy lọc và sinh khối.
2.5.4.6. Ảnh hưởng của pH
Các chủng vi sinh vật ựược nuôi cấy lắc (220 vòng/phút) trên môi trường dịch thể ở các mức pH khác nhau (pH = 4, pH = 5, pH = 6, pH = 7, pH = 8). Sau 5 ngày xác ựịnh các thông số: Số lượng khuẩn lạc, sinh khối và hoạt tắnh enzym ngoại bào. So sánh kết quả ựể lựa chọn pH nuôi cấy thắch hợp.
2.5.4.7. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ
Nuôi cấy các chủng vi sinh vật trong ựiều kiện môi trường và pH thắch hợp ở các nhiệt ựộ khác nhau: 200C, 300C, 400C, 500C. Sau 5 ngày xác ựịnh số lượng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
khuẩn lạc, sinh khối và hoạt tắnh enzym ngoại bào. So sánh kết quả ựể lựa chọn nhiệt ựộ nuôi cấy thắch hợp nhất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.5.4.7. đánh giá khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật ựược nuôi lắc (220 vòng/phút) trên môi trường dịch thể ở các mức Streptomycin với các nồng ựộ khác nhau: 300, 500, 800, 1000mg/l (Obtin, 1971). Sau 5 ngày xác ựịnh số lượng khuẩn lạc, sinh khối, hoạt tắnh enzym ngoại bào.
2.5.4.8. Khả năng gây bệnh lên thực vật của các chủng vi sinh vật.
Dùng que cấy chấm các chủng XK lên vết thương của căn hành ựã khử trùng. Sau 4 ngày kiểm tra, nếu vết thương không lở loét, chứng tỏ chủng ựó an toàn ựối với thực vật.