TT Thành phần MT3 MT4 MT5 MT6
1 Glucose 20g 20g 0g 20g
2 (NH4)2SO4 3 3 5 4
3 KH2PO4 2 2 2 1
4 MgSO4.7H2O 2 2 0 0
5 Axit axetic 2% 2% 5ml 2,5ml
6 Rượu etylic 2% 2% 0 0
7 Cao nÊm men 0 5g 3g 0
8 Pepton 0 6g 2g 0
9 Nước mÝa Ðp 0 0 200ml 0
10 Nước dừa 0 0 0 1000ml
11 Nước máy 1000ml 1000ml 1000ml 0
Chú ý: Axit axetic (CH3COOH) và r−ợu etylic (C2H5OH) bổ sung sau khi hấp môi tr−ờng lần thứ 3 [6], [8],[9].
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
2.3.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định (MPA) Cao thịt: 5g Pepton: 5g NaCl: 5g Thạch agar: 20g
N−íc: 1000 ml 2.4. Ph−ơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter theo ph−ơng pháp của Vinogradski Nguồn nguyên liệu là: bia, dịch hoa quả loãng và r−ợu vang, chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn Acetobacter theo ph−ơng pháp của Vinogradski.
Tr−ớc hết, chúng tôi thực hiện lên men giấm trên các vật liệu trên.Vi khuẩn axetic là loại vi khuẩn hiếu khí nên chúng phát triển trên môi tr−ờng lỏng tạo thành lớp màng dai, màu trắng. Màng đó bao gồm tập hợp các vi khuẩn axetic, lấy màng đó đưa vào môi trường số 2. Môi trường số 2 được pha chế đầy đủ các thành phần, khử trùng trong nồi hấp Autoclave ở áp xuất 1 atm, trong thời gian 15 phút, để nguội, bổ sung r−ợu etylic và axit axetic, chia vào các bình cầu hoặc bình tam giác. Sau khi thả màng vào giữa trong tủ ấm 28°C - 30°C trong thời gian 4 - 7 ngày (chú ý khi nút bông các bình không qua chặt cũng không quá lỏng) trên bề mặt môi tr−ờng xuất hiện một lớp màng mới. Từ màng này tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn Acetobacter.
Ph−ơng pháp pha loãng của Pasteur: Việc pha loãng đ−ợc thực hiện với dung dịch NaCl 0,5% vô trùng hoặc n−ớc cất vô trùng. Chuẩn bị dung dịch pha loãng rồi khử trùng ở 1atm, ở 121oC, thời gian 15 phút, dùng 10 ống nghiệm định mức 10ml (đậy nút bông, đã khử trùng). Sử dụng pipet vô trùng chia vào các ống nghiệm vô trùng mỗi ống 9ml dung dịch NaCl hoặc n−ớc cất, sau đó dùng pipet lấy 1ml dịch lên men cho vào một ống nghiệm có chữa sẵn 9ml nước cất hoặc dung dịch NaCl trên, đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách vontex trong 5 phút sẽ thu đ−ợc dung dịch pha loãng với nồng độ 10-1. Dùng pipet lấy 1ml dung dịch ở ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-1 nhỏ vào
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
ống nghiệm thứ 2 (cũng có 9 ml nước), đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách vontex trong 5 phút thu đ−ợc dung dịch pha loãng với nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng nh− vậy đến nồng độ 10-10 ta đ−ợc 10 ống nghiệm chứa dung dịch lên men với các nồng độ từ 10-1 đến 10-10. Căn cứ vào số l−ợng vi khuẩn có trong mẫu, chúng tôi chọn mẫu ở mức độ pha loãng 10-4 đến 10-7 để tiến hành phân lập lại trên môi trường thạch đĩa.
Phương pháp thạch đĩa: Chuẩn bị môi trường 1 hấp khử trùng ở 121oC và 1atm, để nguội, bổ sung r−ợu và axit, tiếp theo đổ vào hộp peri đã vô trùng,
để nguội khi đó bề mặt thạch sẽ đông lại. Dùng pipét vô trùng hút 100 μl dịch màng đã chuẩn bị ở trên (có độ pha loãng 10-4 đến 10-7) nhỏ vào hộp peri, sau
đó dùng que trang dàn đều trên khắp bề mặt thạch. Đặt ng−ợc các hộp lồng, bao gói cẩn thận, cất trong tủ ấm ở 28°C - 30°C. Sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (các đặc điểm về hình dạng, kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền mép quanh khuẩn lạc), vòng phân giải CaCO3 quanh khuẩn lạc.
Chú ý: tất cả các dụng cụ thí nghiệm, dung dịch và môi tr−ờng nuôi cấy trước khi sử dụng đều phải hoàn toàn vô trùng, các thao tác thí nghiệm đều
đ−ợc làm trong box cấy vô trùng.
2.4.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng xenluloza theo ph−ơng pháp của Graxinop
Tr−ớc khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn bằng cách: từ mỗi khuẩn lạc đã chọn trên dùng que cấy đầu tròn (đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợi lấy khuẩn lạc cấy vào một ống nghiệm đã đ−ợc đổ môi trường thạch (môi trường số 2, đặt nghiêng, để nguội ) theo đường ziczăc. Mỗi ống là một ký hiệu riêng. Để vào tủ ấm 4 - 6 ngày các vi khuẩn sẽ phát triển theo đ−ờng cấy. Tiếp theo là tuyển chọn các chủng vi khuẩn sẽ phát triển theo
đường cấy. Sau đó, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi trường oxy hoá (MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng. Cho 1 ml nước cất
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
thanh trùng vào ống giống (ống nghiệm thạch nghiêng chứa các tế bào vi khuẩn đã đ−ợc hoạt hoá bằng cách cấy chuyển ống giống đ−ợc bảo quản trong tủ lạnh sang ống thạch nghiêng khác, khi tế bào vi khuẩn đã phát triển theo
đ−ờng cấy sẽ đ−ợc kiểm tra khả năng tạo màng), dùng que cấy vô trùng gợt các tế bào ra khỏi đ−ờng cấy hoà tan vào n−ớc, dùng pipet vô trùng hút dịch vi khuẩn đưa sang môi trường oxi hoá để thử khả năng tạo màng. Dựa vào khả
năng tạo màng của các mẫu vi khuẩn trên môi tr−ờng dịch thể tuyển chọn sau ba lần liên tiếp chọn ra những chủng có khả năng tạo màng dai, mỏng, trong thời gian ngắn.
Để giữ giống cần tiến hành cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng này sang ống thạch nghiêng khác với chu kỳ 2 tháng một lần.