tạo màng cellulose theo ph−ơng pháp của Graxinop (sơ tuyển lần 1) Từ 3 nhóm khuẩn lạc đã sơ bộ phân loại ở trên, chúng tôi đã thử khả
năng tạo màng của 3 nhóm trên môi trường dịch thể là nước dừa. Từ đó chọn ra những chủng có khả năng tạo màng dai. Để thuận tiện cho việc nghiên cứu chúng tôi tạm gọi mỗi khuẩn lạc thu đ−ợc là một chủng và mã hoá theo ký hiệu sau: * Nhóm I: A1 A10
* Nhãm II: B1 B10
* Nhãm III: C1 C10
Mỗi khuẩn lạc đó tiến hành nhân giống bằng cách cấy lại trên một ống thạch nghiêng theo đ−ờng cấy ziczắc. Sau 4-5 ngày thấy xuất hiện khuẩn lạc ở ống thạch nghiêng, tiếp tục dùng que cấy vô trùng gợi các khuẩn lạc đó nuôi trong môi trường dịch thể (môi trường số 2 đã được khử trùng) rồi quan sát khả năng tạo màng. Để ở nhiệt độ phòng (vào mùa hè là điều kiện nhiệt độ thích hợp nhất cho khả năng tạo màng), quan sát từ ngày thứ 3 đã có một số chủng tạo màng còn một số chủng khác màng bắt đầu tạo thành từ ngày thứ 4 họăc ngày thứ 5. Kết quả đ−ợc dẫn ra ở bảng 3.2.
Qua kết quả trên cho thấy các mẫu thuộc nhóm III đặc điểm khuẩn lạc khá đồng nhất, lại xuất hiện vòng phân giải CaCO3 là viền nhỏ xung quanh khuẩn lạc, đều có khả năng tạo màng mỏng. Theo mục đích nghiên cứu cần chọn các chủng tạo màng mỏng, do vậy chúng tôi lựa chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm III để tiến hành các ngiên cứu tiếp theo. Kết quả nghiên cứu này đồng nhất với nghiên cứu cuả Alina Krystynowicz và cs (2005) [10]
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
khi tiến hành nghiên cứu hình dạng vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường thạch đĩa.
Bảng 3.3. Quan sát thời gian, đặc điểm màng tạo thành và đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Acetobacter phân lập đ−ơc.
Chủng Đặc điểm khuẩn lạc Có tạo màng(+) Không tạo màng(-)
Thêi gian tạo màng
Đặc điểm của màng A1 -
A2 - A3 -
A4 + 7 ngày Màng mỏng, dễ vỡ
A5 + 7 ngày Màng mỏng, dễ vỡ
A6 -
A7 + 7 ngày Màng mỏng, nhăn
nheo bám theo thành bình mỏng, dễ vỡ, dịch nuôi cấy
đục
A8 -
A9 + 5 ngày Mỏng, dễ vỡ, dịch
nuôi cấy đục A10
§−êng kÝnh lín 3,5-5mm, bÒ m¨t trơn bóng ở giữa lồi lên, dày và
đậm màu sắc hơn các vùng xung quanh
-
B 1 -
B2 + 6 ngày Màng rất dày, khá
dai
B3 - B4 -
B5 + 6 ngày Màng dày vừa phải,
nhẵn khá dai B6
KhuÈn lac ®−êng kính 1,5 mm, màu vàng nâu
Khuẩn lạc đ−ờng kÝnh 2mm
+ 7 ngày Màng dày, không dai
C1 + 5 ngày Màng khá dai,
máng
C2 + 3 ngày Màng mỏng , khá
dai
C3 + 5 ngày Màng mỏng , không
nhẵn
C4 + 6 ngày Màng mỏng, không
dai C5
Khuẩn lạc nhỏ 0,8 - 1mm , bÒ mặt trơn bóng, màu trắng sữa
+ 4 ngày Màng rất dai , nhẵn
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
3.2.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng cellulse mỏng (tuyển chọn lần 2)
Cơ sở để tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum
* Đặc điểm khuẩn lạc: tròn, đều, trơn bóng, màu sắc trắng trong hoặc trắng sữa (tuỳ môi tr−ờng nuôi cấy), mép khuẩn lạc nhẵn, sau 5 - 6 ngày kích thước đạt từ 0,8 - 1 mm.
* Quan sát vi thể bằng nhuộm Gram, vi khuẩn Acetobacter xylinum bắt màu Gram âm, nhuộm tế bào có dạng hình que đứng riêng lẻ hay xếp thành từng chuỗi.
* Kiểm tra thông qua các đặc điểm sinh hoá sau:
Bảng 3.4. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum STT Đặc điểm sinh hoá của vi
khuÈn Acetobacter xylinum
Hiện t−ợng Kết quả
1 - Oxy hoá ethanol thành axit axetic
- Axit axetic tạo ra kết hợp với CaCO3 làm vòng sáng rộng hơn và tạo lớp cặn đục râ
+
2 - Catalase - Sủi bọt khí +
3 - Hoyer - Sinh khối không phát triển - 4 - Chuyển hoá glycerol thành
dihydroxyaceton
- Vòng CuO xuất hiện xung quanh khuẩn lạc
+ 5 - Chuyển hoá glucose thành
axit
- Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc
+ 6 - Kiểm tra khả năng sinh sắc
tè n©u
- Không thấy sắc tố nâu - 7 - Kiểm tra khả năng tổng hợp
cellulsse
- Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam
+
Dựa theo các cơ sở tuyển chọn trên thì các chủng vi khuẩn thuộc nhóm III đều có đặc điểm khuẩn lạc (đường kính, màu sắc, kích thước khuẩn lạc) phù hợp. Qua kiểm tra hoạt tính catalase thấy có hiện t−ợng sủi bọt khí chứng tỏ các chủng đều có họat tính catalase dương. Mặt khác, các chủng có khả
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
năng chuyển hoá etanol thành axit axetic trên môi tr−ờng A và B, chuyển hoá
glucose thành axit với sự xuất hiện của vòng phân giải CaCO3.
Acetobacter xylinum là nhóm vi khuẩn duy nhất có khả năng tổng hợp cellulose mạnh. Do vậy chúng tôi tuyển chọn bằng cách thử khả năng tạo màng trên môi tr−ờng dịch thể. Kết quả tất cả 5 chủng vi khuẩn thuộc nhóm III đều có khả năng tạo màng trên môi trường lỏng. Màng này là sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng và phát triển.
Màng cellulose gồm những bó vi sợi cellulose đ−ợc đẩy ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm trên màng tế bào của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Những dải cellulose này bện vào nhau tạo thành màng. Chất kiến tạo cơ bản của quá trình tổng hợp cellulose là glucoza là thành phần chính của môi tr−ờng nuôi cấy Acetobacter .
Nh− vậy chúng tôi khẳng định 5 chủng vi khuẩn này là vi khuẩn Acetobacter xylinum. Từ 5 chủng vi khuẩn này chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm tiếp nhằm tìm ra chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng nhÊt.
Chúng tôi tiến hành tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng theo các tiêu chí sau:
+ Màng tạo ra mỏng, dai + Bề mặt màng trơn
+ Thời gian tạo màng ngắn
Chúng tôi dùng 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum tuyển chọn đ−ợc cấy sang mô lỏng (môi tr−ờng số 2, thay n−ớc máy bằng n−ớc dừa). Môi trường đã được khử trùng trong nồi hấp Autoclave ở áp suất 0,5 atm trong thời gian 30 phút, 3 ngày liên tiếp để nguội, bổ sung thêm etylic, axit axetic 2%
cấy giống. Theo dõi khả năng tạo màng, độ dày màng, đặc điểm môi trường nuôi cấy.
Khi theo dõi quá trình hình thành màng của vi khuẩn trên môi tr−ờng số 2, chúng tôi thấy rằng đa số mẫu màng bắt đầu hình thành ở ngày thứ 3, thứ 4.
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
Khoảng 4 ngày sau khi màng xuất hiện, màng dày lên rất nhanh, những ngày sau đó chậm dần. Màng có thể mỏng, dày, trơn, nhăn, khá dai, môi trường nuôi cấy trong hoặc đục. Thu màng, rửa sạch, đem cân thu đ−ợc kết quả:
Bảng 3.5. Khảo sát khả năng tạo màng của một số chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
Tên chủng
Khối l−ợng màng/1 l môi tr−ờng nuôi cÊy (g)
Thêi gian tạo màng (ngày)
Độ dày màng (mm)
Đặc điểm của màng C1 3,73 5 1,2 Màng mỏng, dai ,
dịch nuôi cấy đục.
C2 3,11 4 0,8 Màng mỏng, dai, nhẵn, có màu sáng , dịch nuôi cấy trong.
C3 3,29 6 1,5 Màng mỏng, dai, màu đậm.
C4 3,93 6 1,65 Màng dày, màu vàng ngà, dịch nuôi cấy
đục.
C5 3,32 4 0,5 Màng mỏng, dai, nhẵn, trắng trong, dịch nuôi cấy trong.
Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi bước đầu khẳng định chủng vi khuẩn Acetobacter C5 thuộc loại vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng tạo thành màng cellulose mỏng, dai. Chúng tôi quyết định lựa chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum C5 làm đối t−ợng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kiểm tra khả năng tạo màng ổn định của chủng vi khuẩn C5 qua 3 lần liên tiếp bằng cách: từ các mẫu màng dai, nhẵn, mỏng thu đ−ợc (do các khuẩn lạc của chủng C5 vào môi tr−ờng dịch thể) tiến hành phân lập lại trên môi trường thạch đĩa. Các khuẩn lạc biểu hiện khá đồng nhất (đặc điểm màu sắc, kích th−ớc của khuẩn lạc giống với chủng C5).
Từ các khuẩn lạc này tiếp tục tiến hành nuôi cấy trên môi tr−ờng dịch thể cũng thấy xuất hiện màng sau 3 - 4 ngày nuôi cấy. Qua 3 lần tuyển chọn
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
liên tiếp đều thấy xuất hiện màng và đặc điểm khuẩn lạc đồng nhất. Do vậy có thể khẳng định chủng vi khuẩn C5 có khả năng tạo màng mỏng ổn định.
Nh− vậy chúng tôi đã chọn đ−ợc chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum C5 có khả năng cho màng mỏng, ổn định.