Sau khi sơ tuyển, chúng tôi đã chọn ra một số chủng, các chủng này tiếp tục được xác định bằng phương pháp quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học để xác định xem chúng có đúng là chủng vi khuẩn cần tìm không. Quan sát hình dạng tế bào bằng ph−ơng pháp nhuộm Gram: ph−ơng pháp này gồm các b−ớc sau:
+ Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCl hoặc H2SO4. + Rồi rửa lại bằng cồn, n−ớc cất và lau khô.
+ Nhỏ một giọt n−ớc vô trùng lên lam kính, dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít màng màu trắng hoặc dịch nuôi cấy hoặc giống vi khuẩn hoà vào giọt nước vô trùng đó, hơ qua trên ngọn lửa
đèn cồn để cố định vết bôi (cách ngọn lửa đèn cồn 10 - 15 cm).
+ Đặt lên trên vết bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian giữ
trong 1 - 2 phót.
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
+ Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho thuốc nhuộm chảy xuống chậu hứng, nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi, giữ trong vòng 5 phút.
+ Rửa tiêu bản bằng nước, rửa bằng cồn (20 giây) sau đó rửa tiếp bằng nước.
+ Nhỏ dung dịch Fucshin lên giữa trong 1 - 2 phút.
+ Rửa lại tiêu bản bằng n−ớc, hong khô tự nhiên.
Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn gram
âm (Gr-) với vi khuẩn Gram d−ơng (Gr+). Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr-. Ng−ợc lại nếu bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gr+. Khả năng bắt màu của vi khuẩn Gr+ và vi khuẩn Gr- khác nhau là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr+ đ−ợc cấu tạo từ một loại protein
đặc biệt chứa muối nucleatmagie có khả năng tạo với tím Gentian và Lugol một phức chất bề khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế bào của vi khuẩn Gr+ bắt màu tím Gentian. Trong khi đó những vi khuẩn Gr- không có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm Gentian và Lugol nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Do đó, khi nhỏ Fucshin lên tế bào vi khuẩn Gr- bắt màu hồng màu của Fucshin.
a b
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
c
Hình 2.1. Tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III a. Hình thái màu sắc tế bào của chủng C1
b. Hình thái màu sắc tế bào của chủng C2 c. Hình thái màu sắc tế bào của chủng C5
Từ những mẫu vi khuẩn axetic thu đ−ợc ở trên chúng tôi tiến hành tuyển chọn ra những mẫu vi khuẩn Acetobacter thuần khiết và có khả năng tạo màng dai trên môi tr−ờng nuôi cấy dịch.
2.4.3.2. Kiểm tra đặc tính sinh học của Acetobacter
* Kiểm tra khả năng oxi hoá ethanol thành axit axetic
Sau khi đã có các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng xenluloza trên môi tr−ờng oxy hoá chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter thuần khiết dựa trên những đối chiếu định loại đặc điểm khuẩn lạc trên hai môi tr−ờng A và B.
Môi tr−ờng A: dịch chiết nấm men 3%, CaCO3 2%, Agar-agar 2%, r−ợu etylic 15% - 2ml. Khi nuôi cấy giống vi khuẩn axetic trên môi tr−ờng này nếu là Gluconobacter thì có một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là Acetobacter thì vòng sáng rõ hơn và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc h−ớng về phía vòng sáng do vi khuẩn sinh tr−ởng và phát triển sẽ tạo ra axit axetic – axit này tạo ra sẽ kết hợp với CaCO3 làm vòng sáng rộng hơn và tạo ra lớp cặn đục thấy rõ.
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
Môi tr−ờng B: dịch chiết nấm men 3%, Agar – agar 2%, r−ợu etylic 15% - 1ml, xanh lôc bromocresol 2,2% - 1 ml. Khi cÊy gièng vi khuÈn axetic, nếu là Gluconobacter sẽ làm cho môi trường biến đổi thành màu vàng, nếu là Acetobacter cũng làm môi trường biến đổi thành màu vàng nhưng có một vành màu xanh lơ do quá trình oxy hoá các axit.
* Phương pháp xác định khả năng tổng hợp axit axetic bằng chuẩn
độ với NaOH 0,1N có Phênolphtalein làm chỉ thị màu
Cho vào bình tam giác loại 100 ml hoặc 200ml, 10 ml dung dịch đã lên men, thêm vào đó 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N. Tính số gam axit axetic trong 100 gam dung dịch lên men.Cứ 1ml NaOH 0,1N tương ứng với 0,006 gam axit axetic. Chú ý khi chuẩn độ ta lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng là đ−ợc.
Cách tính:
10 1000 . .K
X = V (g/l)
X: số gam axit axetic có trong 1 lít dung dịch lên men V: số ml NaOH 0.1 N dùng chuẩn 10 ml dung dịch lên men * Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu đ−ợc tách từ dịch, nuôi cấy bằng li tâm 3000 vòng trong 20 phút. Nếu thấy hiện t−ợng sủi bọt thì chủng đó đ−ợc coi là có hoạt tính catalase (catalase +), nếu không thấy sủi bọt thì chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase-).
2.4.3.3. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn
Lấy 1 ml dịch huyền phù có chứa tế bào vi khuẩn có thời gian nuôi cấy khác nhau tuỳ theo yêu cầu của nghiên cứu, pha loãng theo ph−ơng pháp pha loãng Pasteur, dùng micropipet hút 100 μl dịch pha loãng, trang đều trên môi
Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học
trường thạch đĩa. Nuôi ở 30oC trong 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức:
N = A −n
10 . 1 100
. 1000
Trong đó: N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu A- Số CFU trung bình đếm đ−ợc trên mỗi đĩa petri 10-n - Độ pha loãng