PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG NẤM Fusarium oxysporum GÂY BỆNH HÉO RŨ TRÊN MỘT SỐ CÂY TRỒNG CẠN Vũ Thuý Nga Summary Isolation and selection of Bacillus antagon
Trang 1PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN Bacillus
ĐỐI KHÁNG NẤM Fusarium oxysporum GÂY BỆNH HÉO RŨ
TRÊN MỘT SỐ CÂY TRỒNG CẠN
Vũ Thuý Nga
Summary
Isolation and selection of Bacillus antagonistic to wilt caused by Fusarium oxysporum
The result of study showed that some Bacillus strains can antagonistic wilt caused Fusarium oxysporum The result of identification by sequence rARN 16S method showed that the sequence rARN 16S of 5.1 strain has 100% base similar Bacillus subtilis strain, the sequence rARN 16S of M strain has 99% base similar Bacillus velezensis and the sequence rARN 16S of B17 has 99,1% base similar Bacillus polyfermenticus According to European Comunity, species are selected have high biosafety and it is promissing to apply in common All of them can grow very good in MT1, King and PDA medium at pH 6,5-7 and temperate 25-300C
Keywords: Bacillus, strain, wilt, antagonistic, Bacillus polyfermenticus, Bacillus velezensis,
Bacillus subtilis
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Bacillus thuộc nhóm vi khuNn sống phổ
biến trong đất Một số chủng Bacillus đã
được sử dụng để sản xuất các chế phNm
sinh học trừ côn trùng gây hại cây trồng
như Bacillus thuringiensis var Kurstaki trừ
sâu tơ, Bacillus thuringiensis var Bralensis
trừ muỗi, các chế phNm này đã được sản
xuất với khối lượng lớn phục vụ sản xuất
Một số chủng Bacillus khác còn có khả
năng ức chế một số loại nấm gây bệnh cây
trồng cũng đang được các nhà khoa học
quan tâm nghiên cứu nhằm khai thác có
hiệu quả khả năng này Công trình nghiên
cứu được thực hiện theo hướng phân lập
tuyển chọn một số chủng Bacillus có khả
năng ức chế loại nấm gây bệnh héo rũ cây
trồng cạn Fusarium oxysporum, là loại ký
sinh gây hại nghiêm trọng nhiều loại cây
trồng, rất khó phòng trừ bằng thuốc hoá
học Bài báo trình bày kết quả nghiên cứu
bước đầu phân lập, tuyển chọn nhằm bổ
sung vào quỹ gen vi sinh vật một số chủng
Bacillus có khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum gây bệnh cây trồng cạn có thể
ứng dụng sản xuất phân bón sinh học phục
vụ sản xuất
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
- Các mẫu đất, phân chuồng hoai mục, mẫu cây trồng thuộc họ cà, họ bầu bí, họ đậu được thu thập từ một số nơi như: Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa, Hà Tây, Hòa Bình và Vĩnh Phúc
- Chủng nấm bệnh Fusarium oxysporum gây bệnh cho ớt, dưa hấu, lạc
được lưu giữ trong bộ giống quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp tại Bộ môn Vi sinh vật - Viện Thổ nhưỡng Nông hóa
- Giống lạc L50 do Trung tâm Đậu đỗ - Viện Cây lương thực và Cây thực phNm cung
Trang 2cấp Giống dưa hấu Hắc Mỹ Nhân 224, ớt
cay F1 nhập nội từ Hàn Quốc do Trung tâm
Giống cây trồng Trung ương 1 cung cấp
- Môi trường phân lập, nuôi cấy, nhân
giống vi sinh vật (VSV) như: King, MT1,
PDA, Czapeck, Ashby, Pikovskaya)
2 Phương pháp nghiên cứu
- Phân lập vi khuNn Bacillus: Các mẫu
đất, cây và phân ủ được thu thập, bảo quản ở
nhiệt độ phòng Sau đó lấy 10 gram mẫu
nghiền mịn cho vào bình tam giác chứa 90 ml
nước cất khử trùng, xử lý ở nhiệt độ cao
80 - 1000C trong thời gian 5 - 10 phút Cấy
trên môi trường King, thu nhận khuNn lạc
lần đầu, tiếp tục làm sạch nhiều lần để được
khuNn lạc thuần khiết, thử hoạt tính đối
kháng và giữ lại các khuNn lạc có hoạt tính
cao để làm các thí nghiệm tiếp theo
- Đặc điểm sinh học của các chủng VSV
được xác định theo các phương pháp nghiên
cứu vi sinh vật học thông thường
- Phân loại theo phương pháp truyền
thống, hệ thống BIOLOG và phương
pháp PCR
- Phương pháp đánh giá hoạt tính đối
kháng nấm bệnh theo 10TCN 867:2006
- Phương pháp đánh giá trên cây trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới Tiến hành thí nghiệm trồng cây trong nhà lưới đối với giống lạc L50, giống dưa hấu Hắc Mỹ Nhân 224, giống ớt cay F1 trên nền đất khử trùng Công thức thí nghiệm được lặp lại 5 lần với khay hoặc rổ chứa 8 - 10 kg đất
Các chủng vi khuNn Bacillus và nấm bệnh
Fusarium oxysporum được nhiễm vào đất, rễ
cây con hoặc hạt đã nảy mầm với mật độ tương đương nhau đạt 108 CFU/g đất Tiến hành theo dõi trong thời gian thí nghiệm 45 -
60 ngày, đánh giá chỉ tiêu trọng lượng khô thân lá và xác định tỉ lệ cây bệnh
- Số liệu thí nghiệm được xử lý theo chương trình phần mềm IRRISTAT 4.0 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thu thập, phân lập, tuyển chọn và đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng
Bacillus đối kháng nấm bệnh Fusarium oxysporum
Đã thu thập được 103 mẫu đất Tiến hành phân lập, tuyển chọn và xác định được
một số chủng Bacillus có hoạt tính đối kháng nấm bệnh Fusarium oxysporum
tương đối cao và ổn định (Bảng 1)
Bảng 1 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus có hoạt tính đối kháng
TT Ký hiệu
chủng
Khả năng tạo màng
Vòng đối kháng nấm Fusarium oxysporum (mm)
Gây bệnh trên ớt Gây bệnh trên lạc Gây bệnh trên dưa hấu
+: Có khả năng tạo màng
Số liệu Bảng 1 cho thấy các chủng
được lựa chọn đều có vòng đối kháng nấm
bệnh ở mức độ cao, đạt từ 15,5 đến 22 mm
và ổn định qua các lần đánh giá
Trang 3Hình 1 Vòng đối kháng nấm Fusarium
oxysporum của các chủng Bacillus
2 Đặc điểm sinh học, phân loại các
chủng vi khu-n Bacillus phân lập và
tuyển chọn
Đã xác định được các đặc điểm sinh học
của các chủng vi khuNn Bacillus đã được
phân lập và tuyển chọn Kết quả được trình bày trong Bảng 2 cho thấy đây là các chủng
có khả năng tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy
Bảng 2 Đặc điểm sinh học của các chủng vi khu-n Bacillus
Đặc điểm sinh hoc Chủng vi khuẩn Bacillus phân lập và tuyển chọn
Hình dạng khuẩn lạc Khuẩn lạc màu vàng nhạt,
bề mặt nhăn, có vòng tròn đồng tâm ở giữa
Khuẩn lạc khô, màu trắng vàng, mép không đều, nhân có vòng tròn
Khuẩn lạc màu trắng hơi vàng, bề mặt khô, hơi nhăn, mép không đều
nuôi cấy
Xuất hiện nhiều sau 48 giờ nuôi cấy
Xuất hiện nhiều sau 48 giờ nuôi cấy
Khả năng phân giải kitin sau
48 giờ nuôi cấy (mm)
+: Có phản ứng
Trên cơ sở phương pháp định tên VSV
bằng kỹ thuật phân tử (16S ARN riboxom),
hệ thống định danh BIOLOG và hệ thống
phân loại Bergey’s đã xác định được tên
của các vi khuNn Bacillus phân lập, tuyển
chọn trong nghiên cứu (Bảng 3)
Bảng 3 Kết quả xác định tên và độ an toàn
sinh học của các chủng vi khu-n Bacillus
STT
Ký
hiệu
chủng
Tên vi sinh vật
Mức độ
an toàn CNSH
Để xác định độ an toàn của các chủng
Bacillus sau khi được phân lập và tuyển
chọn, chúng tôi đã so sánh các chủng VSV nêu trên với danh mục vi khuNn trong phân nhóm các tác nhân sinh học theo Định hướng an toàn công nghệ sinh học của CHLB Đức và Cộng đồng châu Âu
(Sichere Biotechnologie: Eingruppierung
biologischer Agenzen: Bakterien- 1998)
Kết quả (Bảng 3) cho thấy: 3 chủng vi
khuNn Bacillus được phân lập và tuyển
chọn thuộc nhóm các vi khuNn có độ an toàn cao (độ nguy hiểm cấp 1) Theo Hướng dẫn số 90/679/EWG ngày 26 tháng
11 năm 1990 của Cộng đồng châu Âu thì VSV thuộc độ nguy hiểm cấp 1 là các VSV không có khả năng gây bệnh đối với người và động vật
Trang 43 Một số điều kiện sinh trưởng và phát
triển của các chủng Bacillus
Tiến hành nuôi cấy các chủng phân lập
được trên môi trường dinh dưỡng, kết quả
cho thấy trên môi trường MT1, King, PDA
các chủng vi khuNn Bacillus phát triển mạnh
và hình thành các khuNn lạc điển hình, trên
môi trường Pikovskaya và Ashby chúng
không phát triển hoặc phát triển yếu (Bảng 4)
Bảng 4 Khả năng phát triển của khu-n lạc
vi khu-n Bacillus trên một số môi trường
nghiên cứu
Chủng
vi
khuẩn
Khả năng phát triển trên môi trường
MT1 PDA Ashby King Pikovskaya
-Ghi chú: ++: Phát triển mạnh, khuNn lạc điển hình
+/-: Phát triển yếu
+: Phát triển bình thường
-: Không phát triển, khuNn lạc không điển hình
Tiến hành xác định một số điều kiện
nhiệt độ cũng như pH ảnh hưởng đến sự
phát triển của các chủng vi khuNn phân lập
được Trên cơ sở các kết quả thu được có
thể nhận thấy cả 3 chủng B17, M, 5.1 đều
có thể phát triển mạnh trong điều kiện pH
6,5 - 7 và nhiệt độ 25 - 30 C, không phát triển hoặc phát triển yếu trong điều kiện pH thấp 4 - 4,5 Chúng đều phát triển được ở nhiệt độ cao 370C, hoạt tính ức chế nấm
bệnh Fusarium oxysporum tương đối ổn
định trong các lần thí nghiệm (Bảng 5)
Bảng 5 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến khả năng phát triển của các chủng vi khu-n
Bacillus
Chủng
vi khuẩn
pH Nhiệt độ ( 0 C)
4 - 4,5 6,5 - 7 8 - 8,5 25 30 37
Ghi chú: ++: Phát triển mạnh, khuNn lạc điển hình +/-: Phát triển yếu
+: Phát triển bình thường
-: Không phát triển, khuNn lạc không điển hình
4 Đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây
bệnh Fusarium oxysporum của các chủng
vi khu-n Bacillus đối với một số cây
trồng
Kết quả đánh giá hoạt tính đối kháng
của các chủng Bacillus đối với nấm
Fusarium oxysporum trên cây ớt, dưa hấu
và lạc thể hiện trong Bảng 6
Bảng 6 Ảnh hưởng của các chủng Bacillus đến sinh trưởng của một số cây trồng
TT Công thức thí nghiệm
Trọng lượng khô thân
lá (g/cây)
Tỉ lệ cây héo chết (%)
Trọng lượng khô thân
lá (g/cây)
Tỉ lệ cây héo chết (%)
Trọng lượng khô thân
lá (g/cây)
Tỉ lệ cây héo chết (%)
Trang 5Tỉ lệ cây bị bệnh héo rũ ở các công
thức nhiễm vi khuNn Bacillus B17, M, 5.1
đều thấp hơn so với đối chứng nhiễm nấm
bệnh Fusarium oxysporum và chỉ đạt từ 6,7
đến 8,3 Trọng lượng khô thân lá ở các
công thức nhiễm vi khuNn đối kháng đều
không sai khác so với công thức đối chứng
không nhiễm Do vậy có thể nói nhiễm vi
sinh vật đối kháng B17, M, 5.1 không ảnh
hưởng đến sinh trưởng của cây
IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ N GHN
1 Kết luận
Đã phân lập, tuyển chọn được 3 chủng
vi khuN n Bacillus đó là chủng B17, M và
5.1 có hoạt tính đối kháng với nấm bệnh
Fusarium oxysporum Trình tự gen rARN
16S của chủng 5.1 giống 100%
(1400/1400) với đoạn 16S của vi khuN n
Bacillus subtilis Trình tự gen rARN 16S
của chủng M giống 99% (1333/1339) với
đoạn 16S của vi khuN n Bacillus velezensis
Chủng B17 có 99,1% bazơ giống với loài
Bacillus polyfermenticus Đây là những
chủng có độ an toàn cao thuộc các vi sinh
vật không có khả năng gây bệnh đối với
người và động vật
Các chủng vi khuN n Bacillus B17, M,
5.1 đều phát triển mạnh và hình thành các
khuN n lạc điển hình trên môi trường: MT1,
King, PDA trên môi trường Pikovskaya và
Ashby chúng không phát triển hoặc phát
triển yếu Cả 3 chủng đều có thể phát triển
mạnh trong điều kiện pH 6,5 - 7 và nhiệt độ
25 - 300C Chúng không phát triển hoặc
phát triển yếu trong điều kiện pH thấp 4 -
4,5 nhưng phát triển được trong điều kiện
nhiệt độ cao 370C
Các chủng vi khuN n Bacillus phân lập
đều không ảnh hưởng đến sinh trưởng của
cây thí nghiệm Trọng lượng khô thân lá
của cây lạc, ớt và dưa hấu ở công thức
nhiễm vi khuN n Bacillus B17, M, 5.1 không
sai khác so với đối chứng với mức tin cậy cho phép Tỉ lệ cây chết do được nhiễm vi sinh vật đều giảm hơn so với đối chứng
2 Đề nghị
Vi khuN n Bacillus đối kháng nấm bệnh
Fusarium oxysporum có tiềm năng lớn trong
nghiên cứu kiểm soát sinh học các nguồn bệnh trên cây trồng, do đó cần được tiếp tục nghiên cứu thêm về cơ chế đối kháng TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Gguyễn Lân Dũng, 1976 Thực tập vi
sinh vật NXB Đại học và THCN, Hà Nội
2 Gguyễn Lân Dũng, 1978 Một số
phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập 1, 2, 3 Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội
3 Phạm Chí Thành, 1988 Phương pháp
thí nghiệm đồng ruộng Giáo trình, Trường Đại học Nông nghiệp 1, Hà Nội
4 10TCG 867: 2006 Vi sinh vật - Phương
pháp đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn
?gười phản biện: Bùi Huy Hiền
Trang 6T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6