Luận văn: PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA doc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LƢU THỊ CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LƢU THỊ CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ QUỲNH LIÊN Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng có ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Lưu Thị Cư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà, KS. Đỗ Tiến Phát Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, là những ngƣời đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn. Trong thời gian thực tập nghiên cứu tôi cũng đã nhận đƣợc sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị, các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh- KTNN và khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên đã hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của những ngƣời thân trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn dành cho tôi, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Thái Nguyên, ngày 25 tháng 09 năm 2009 Học viên Lưu Thị Cư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA 3 1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía 3 1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam 4 1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE 5 1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO 8 1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA INTERFERENCE) 10 1.5.1. Nguồn gốc RNAi 10 1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen 10 1.6. KỸ THUẬT GATEWAY ® 12 1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA 14 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. NGUYÊN LIỆU 16 2.1.1. Nguyên liệu thực vật 16 2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme 16 2.1.3. Hóa chất khác 16 2.1.3. Các thiết bị máy móc 17 2.2. PHƢƠNG PHÁP 17 2.2.1. Thiết kế mồi 17 2.2.2. Tách RNA tổng số 18 2.2.3. RT-PCR 18 2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen 19 2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo 21 2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía 22 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 2 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1. THIẾT KẾ MỒI 24 3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ 25 3.3. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE 27 3.4. TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 28 3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR 28 3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 28 3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR 29 3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit 31 3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi 31 3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway 31 3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli 32 3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. 34 3.7. TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA 35 3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo 35 3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin) bp Cặp base cDNA Complementary DNA = DNA bổ sung đƣợc tổng hợp bằng khuôn mRNA cs Cộng sự DEPC Diethyl pyrocarbonat DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr đEtBrEthiium bromide E.coli Escherichia coli gus β-glucuronidase IBA Indole-3-Butyric Acid kb kilo base LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng nuôi cấy theo Murashige và Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid OD Giá trị mật độ quang (optical density) PCR Polymerase Chaine Reaction = Phản ứng chuỗi Polymerase RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SDS Sodium dodecylsulfat TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus DNA (polymerase) 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm 16 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bƣớc 18 Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 19 Bảng 2.4. Các môi trƣờng tái sinh cây mía 21 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3’INV và 5’INV 25 Bảng 3.2. Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng gen NCBI 25 Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro trên các môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4. 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các enzyme chính 6 Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi 11 Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway 13 Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tổng số tách từ lá và bẹ thân non của 2 giống mía ROC1 và ROC10 trên gel agarose 1% 26 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8% 27 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13 (For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase trong vector pENTR/D 30 Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số AY302083 31 Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi 32 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với HindIII và XbaI 34 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV 35 Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo 37 Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro thông qua trung gian A.tumefaciens 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Đƣờng là một nhu cầu cần thiết trong đời sống con ngƣời. Theo thống kê, nhu cầu tiêu thụ đƣờng trên thế giới trung bình tính theo đầu ngƣời là 35 kg/1 ngƣời/1 năm. Tại Việt Nam, năm 1994 là 8 kg/1 ngƣời/1 năm, hiện nay là 15 kg/1 ngƣời/1 năm và dự kiến nhu cầu về đƣờng còn tiếp tục tăng nữa. Tại các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, 75% sản lƣợng đƣờng đƣợc sản xuất từ cây mía. Mía là một trong số ít loài thực vật tích trữ chủ yếu đƣờng sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn nguyên liệu ban đầu để sản xuất đƣờng. Do đó, ở Việt Nam mía trở thành một cây công nghiệp trọng yếu và là cây xóa đói giảm nghèo của chính phủ. Tuy nhiên, các giống mía của Việt Nam có năng suất đƣờng chỉ đạt mức trung bình của thế giới. Việc nhập các giống mía cao sản của thế giới kết hợp với phƣơng pháp lai tạo truyền thống chƣa thực sự có hiệu quả trong việc tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao lại phù hợp với điều kiện thổ nhƣỡng khí hậu của nƣớc ta. Chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao bằng công nghệ sinh học có tiềm năng giảm giá thành đƣờng mà không cần tăng diện tích trồng mía và thúc đẩy sự phát triển nền công nghiệp mía đƣờng tại Việt Nam. Sinh tổng hợp sucrose là một quá trình phức hợp, trong đó enzyme Invertase đƣợc xem nhƣ là một chiếc chìa khóa điều chỉnh sự tích lũy lƣợng sucrose trong cây mía. Nó có vai trò phân hủy sucrose trong tế bào. Vì vậy, muốn tăng trữ lƣợng sucrose trong cây mía thì phải ức chế đƣợc sự biểu hiện của gen mã hóa Invertase. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA-interference) hiện nay đã trở thành một biện pháp công nghệ hữu hiệu có thể ức chế hoàn toàn biểu hiện của gen ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật [31]. Ở thực vật, [...]... MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: Ức chế biểu hiện của Invertase dạng hòa tan nhằm tăng trữ lƣợng sucrose ở cây mía NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 1 Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía in vitro ROC1 2 Thiết kế đƣợc vector ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase (βfructofuranosidase) ở cây mía 3 Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở cây mía phục vụ cho mục đích chuyển gen tiếp theo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu... đƣợc thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense hoặc RNA kẹp tóc bổ sung chính nó mà chứa trình tự tƣơng đồng với gen đích Với mục tiêu nghiên cứu chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao, chúng tôi chọn đề tài Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía MỤC TIÊU... từ khóa Invertase Sugarcane” để tìm kiếm trong ngân hàng dữ liệu gen NCBI các trình tự gen Invertase đã đƣợc công bố (www.ncbi.nlm.nih.gov) Kết quả đã thu đƣợc sáu trình tự của gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía, trong đó có 5 trình tự mã hóa cho enzyme Invertase hòa tan (soluble acid Invertase) với mã số AF062734, AF 062735, AF083855, AF083856, AY302083; và một trình tự mã hóa cho enzyme Invertase. .. chứng tỏ rằng Invertase có liên quan chặt chẽ tới hàm lƣợng và vận chuyển của sucrose ở thực vật Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 10 Nhƣ vậy, Invertase đƣợc xem nhƣ là một chiếc chìa khoá điều chỉnh sự tích lũy sucrose dự trữ trong thực vật Do đó, ức chế biểu hiện của Invertase có thể tăng tích lũy sucrose trong cây mía 1.5 ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG... Tách dòng và xác định trình tự gen Chọn lọc mô sẹo Tái sinh cây Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Thiết kế vector tái tổ hợp INV_RNAi http://www.Lrc-tnu.edu.vn 24 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THIẾT KẾ MỒI Để nhân đƣợc đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase bằng kỹ thuật RT-PCR điều quan trọng nhất là phải có đƣợc cặp mồi đặc hiệu cho trình tự của đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase. .. tổng hợp và vận chuyển sucrose [16] Cây cà chua chuyển gen tăng cƣờng biểu hiện SPS thì lƣợng sucrose tăng còn lƣợng tinh bột giảm trong quá trình quang hợp [33] Tƣơng tự, cây bông mang gen SPS của rau bi-na (spinacia oleracea) cũng có tốc độ tổng hợp sucrose cao hơn so với đối chứng [13] Ngƣợc lại, khi làm bất hoạt SPS, các dòng cây khoai tây chuyển gen sẽ giảm trữ lƣợng sucrose [10] Gen mã hóa cho... cơ quan này [6] Bất hoạt Invertase làm tăng tỉ lệ tích trữ sucrose trong cây cà chua chuyển gen ở lá và quả, đồng thời cũng làm thay đổi tỉ lệ đƣờng đơn (hexose) trong các dòng cây này [18, 24] Lá của các dòng khoai tây biểu hiện gen mã hóa Invertase phân lập từ nấm men tích trữ chủ yếu glucose và fructose hơn là sucrose Hơn nữa, những dòng này hình thành ít củ và nhỏ hơn các dòng đối chứng, nhƣng chứa... thời tái tạo các cơ chất khác 1.4 ENZYME INVERTASE (β-FRUCTOFURANOSIDASE) Invertase (β-fructofuranosidase) đƣợc mã hóa bởi 5 - 10 đồng phân tùy thuộc từng loài thực vật khác nhau Cây mô hình Arabidopsis thaliana có 5 đồng phân Invertase, trong khi ở cà chua hiện nay đã phân lập đƣợc 8 đồng phân Hiện nay, trên ngân hàng gen đã có trình tự EST (Expressed Sequenced Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học... http://www.Lrc-tnu.edu.vn 9 Tags) của enzyme Invertase phân lập từ một số giống mía [35] Invertase trung tính (có trong tế bào chất) đã đƣợc tinh sạch từ thân mía trƣởng thành Tuy nhiên trình tự gen mã hóa cho dạng enzyme này vẫn chƣa đƣợc công bố trên GenBank Invertase có mặt ở hầu hết các mô thực vật tích trữ đƣờng và tồn tại ở nhiều dạng khác nhau: dạng hoà tan (soluble acid Invertase) có nhiều trong không... thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một loại trình tự đặc hiệu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 11 Hình 1.2 Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi Hình 1.2 cho thấy, Cơ chế RNAi đƣợc bắt đầu bằng việc phân cắt phân tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích . LƢU THỊ CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC. mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía in vitro ROC1 2. Thiết kế đƣợc vector ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase (β- fructofuranosidase) ở cây mía. 3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở cây mía. (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía . MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: Ức chế biểu hiện của Invertase dạng hòa tan nhằm tăng trữ lƣợng sucrose ở cây mía. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 1. Phân lập đoạn gen