2.1.1. Nguyên liệu thực vật
Chúng tôi sử dụng giống mía ROC1 và ROC10 in vitro đang đƣợc giữ
tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme
Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm
Plasmid Kích thƣớc
(bp) Kháng sinh chọn lọc Nguồn cung cấp
pENTRTM/D-
TOPO 2580 Kanamycin Invitrogen (Mỹ)
pK7GWIWG2(II)
12904 Spectinomycine,
streptomycine
Trƣờng Đại học Ghent (Bỉ)
- Các chủng vi khuẩn: E.coli One Shot TOP 10 và A.tumefaciens chủng
CV58C1 mang plasmid pGV2260
- Các enzyme giới hạn: HindIII , XbaI của hãng New England Biolabs
- Các enzyme T4 ligase, T4 kinase do hãng Fermentas cung cấp
2.1.3. Hóa chất khác
- Cặp mồi 3’INV/5’INV nhân đoạn gen mã hóa enzyme Invertase và
dòng pENTRTM/D-TOPO do chúng tôi thiết kế và đặt tổng hợp tại hãng Bioneer (Hàn Quốc).
- GatewayLR ClonaseTMII Enzyme Mix Kit (Invitrogen, Mỹ)
- Bộ kit kit Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ) - Bộ kit Qiagen (QIAquick Gel Extraction) - Bộ kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN).
- Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử (thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, isoamylalcholhol... ) và các hóa chất cho nuôi cấy mô đều thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng nhƣ Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs...
2.1.3. Các thiết bị máy móc
Pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech), máy li tâm (Ependorf), máy đo pH (Mettler), bộ điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR (MJ Research), bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, máy biến nạp bằng xung điện, máy đo OD, máy vortex, máy xác định trình tự nucleotid tự động... của Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học.
2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Thiết kế mồi
Khai thác dữ liệu trong GenBank để tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá Invertase của cây mía (Bảng 3.2). Sử dụng phần mềm chuyên dụng DNAstar so sánh độ tƣơng đồng giữa các trình tự Invertase thu đƣợc và thiết kế cặp mồi đặc hiệu tại các vùng có độ bảo thủ cao nhất.
2.2.2. Tách RNA tổng số
Sử dụng hóa chất Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ) để tách chiết RNA
tổng số từ các mẫu lá và bẹ thân non của 2 giống mía in vitro ROC1 và
ROC10 theo hƣớng dẫn kèm theo.
2.2.3. RT-PCR
Phân lập gen mã hóa enzyme Invertase ở mía bằng kỹ thuật RT-PCR
một bƣớc (RT-PCR one step) theo chu kỳ sau:
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bƣớc
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ
(oC) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1
2 Biến tính 95 5 phút 1
3 Biến tính 94 20 giây 35
4 Gắn mồi 52 1 phút 35
5 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 35
6 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1
7 Kết thúc phản ứng 8 24 giờ 1
Thành phần của phản ứng với tổng thể tích 25 l đƣợc bổ sung vào ống
effendorf 0,5 ml đã đƣợc xử lý DEPC theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất (Bioneer) gồm có: 2X dung dịch đệm RT-PCR; 1 µg RNA tổng số; 0,4 - 0,6 mM 3’INV; 0,4 - 0,6 mM 5’INV; 0,5 g enzyme RT. Mix mẫu nhẹ nhàng và thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu kỳ nhiệt nhƣ bảng 2.2.
Sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8 - 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X và nhuộm bản gel trong ethidium
bromide (EtBr). Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction Kit.
2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen
Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đƣợc gắn vào vector tách dòng pENTR/D của hãng Invitrogen (Mỹ) để tạo vector tổ hợp có mang đoạn gen mã hóa Invertase mong muốn (INV_pENTR). Phản ứng đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, vector tái tổ hợp INV_pENTR đƣợc biến nạp
vào tế bào khả biến E.coli Top 10 và nhân nuôi lƣợng lớn trong môi trƣờng
LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 50 mg/l kanamycin. Plasmid tái tổ hợp
đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp Sambroock và đƣợc cất giữ ở -20o
C. INV_pENTR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev với tổng thể tích 25 μl bao gồm: 1X dung dịch đệm PCR, 50 ng plasmid, 50 mM
MgCl2, 2 mM dNTPs, 10 ng M13for, 10 ng M13rev, 0,5 g Taq polymerase.
Chu kỳ của phản ứng nhƣ sau:
Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (o
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 95 5 phút 1
2 Biến tính 94 20 giây 35
3 Gắn mồi 52 1 phút 35
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 35
5 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1
Mẫu plasmid tái tổ hợp INV_pENTR sau khi kiểm tra sẽ đƣợc loại RNA và thực hiện xác định trình tự nucleotide trên máy ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen.