Kỹ thuật PCR (polymerase chain Reaction) đợc sử dụng rất hiệu quả trong việc xác định sự có mặt và nhân bản gen GlyP với ADN khuôn là ADN plasmid (vector pCRđ2.1 + GlyP) mang toàn bộ gen GlyP đã dùng để xác định trình tự (Chu Hoàng Hà và cs). Ngoài những yếu tố cần thiết khác nh Taq polymerase, MgCl2 , buffer thì cặp… mồi đặc hiệu là thành phần không thể thiếu để phản ứng PCR thực hiện đợc. Dựa vào trình tự đã đợc công bố trên ngân hàng gen thế giới và trình tự gen GlyP chủng Vnucovo-32 do viên Công nghệ Sinh học xác định đợc, chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacIsử dụng cho việc nhân bản một đoạn gen GlyP có kích thớc 1,5Kb bằng kỹ thuật PCR.
RabG-start-BamHI 5’-GAGGATCCCTTATGGTTCCTCAGGCTCTCCT-3’
BamHI
96 54,84
RabG-stop-SacI 5’-GCGAGCTCTCACAGTCTGGTCTCAC-3’
SacI
80 60,00
PUC18-F1 5’-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’ 62 55,00
PUC18-R1 5’-GCGGATAACAATTTCACACA-3’ 56 40,00
Đặc biệt, để phục vụ cho việc thiết kế vectơ chuyển gen sau này, chúng tôi đã thiết kế thêm trên cặp mồi trình tự điểm cắt của hai enzym hạn chế là BamHI và SacI. Trình tự nhận biết của hai enzym này bao gồm 6 nuclêotit, trong đó trình tự của BamHI là 5’-G GATCC-3’ và của SacI là 5’-GAGCT C-3’.
Phản ứng PCR đợc tiến hành tơng tự nh mục 2.1. Mặc dù nhiệt độ bắt mối theo tính toán lý thuyết của mồi RabG-start-BamHI là 960C và của RabG-stop-SacI là 800C, nhng khi trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi thấy hiệu quả cao nhất thu đợc khi thực hiện phản phản ứng với nhiệt độ gắn mồi là 600C, trong khoảng 32 chu kì.
Sản phẩm PCR đoạn gen GlyP đợc giữ ở 40C và lấy 5àl sản phẩm để diện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Sau khi tiến hành nhuộm và soi gel chúng tôi thu đợc một băng rất đặc hiệu có kích thớc 1,5Kb (hình 6), điều này phù hợp với yêu cầu về kích thớc của đoạn gen mà chúng tôi cần nhân bản, đoạn gen không bị lẫn với ADN tạp nhiễm khác. Vậy có thể kết luận đợc rằng chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn gen GlyP của virus dại.
1 2 M
1,5Kb
Trong sản phẩm PCR gen GlyP thu đợc sẽ có chứa những đoạn gen đã đợc nhân bản, đoạn mồi, sợi khuôn và những đoạn gen cha hoàn thiện. Vì vậy, công việc tiếp theo chúng tôi là tiến hành thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR để thu đợc đoạn gen GlyP có độ tinh sạch cần thiết cho phản ứng cắt enzym hạn chế. Quy trình này đợc thực hiện tơng tự nh mục 2.2.3. Sản phẩm ADN thu đợc đợc bảo quản ở -20oC để sử dụng cho bớc thí nghiệm tiếp theo.