Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GlyP sau khi đã xử lý bằng BamHI và SacI, tinh sạch, đợc gắn trực tiếp vào vectơ chuyển gen pBI121 đã đợc mở vòng sẵn và sẽ đợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lợng lớn.
* Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli DH5α
E. coli là một vi khuẩn Gram âm khi nuôi trong môi trờng có chứa CaCl2, màng tế bào sẽ bị làm cho mỏng đi và có những lỗ nhỏ tạo điều kiện thuận lợi cho các phân tử ADN đi vào. Có nhiều phơng pháp tạo tế bào khả biến nh phơng pháp hoá học, phơng pháp vật lý, phơng pháp sử dụng sóng siêu âm nh… ng thông thờng ngời ta hay sử dụng phơng pháp hoá học hơn vì phơng pháp này rất đơn giản và tiết kiệm chi phí. Tế bào E.
coli khả biến đợc tạo ra theo quy trình ở mục 2.2.6.
* Biến nạp vectơ Ti-plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc 35S/GlyP/NOS vào tế bào khả biến E. coli DH5α.
Vectơ tái tổ hợp đợc đa vào tế bào E. coli khả biến bằng phơng pháp sốc nhiệt ( mục2.2.7). Khi biến nạp có các trờng hợp sau xảy ra:
T4- Ligase GAGCT G Gen GlyP GATCC C NOS TCGAG C CCTAG 35S G pBI121 pBI121 GAGCT G Gen GlyP GATCC C NOS TCGAG C CCTAG 35S G pBI121 pBI121
- Các tế bào không chứa vectơ tái tổ hợp, chúng sẽ không mọc đợc trên môi tr- ờng có chứa kháng sinh kanamycin vì không có gen npt2 mã hoá cho enzym phân giải kháng sinh.
- Các tế bào mang plasmid bình thờng không có gen GlyP gắn vào, chúng vẫn mọc trên môi trờng chọn lọc.
- các tế bào có chứa vectơ mang gen GlyP nhng gen này không còn nguyên vẹn do bị đứt gãy trong quá trình thí nghiệm, những tế bào này vẫn mọc đợc trên môi trờng chọn lọc.
- Các tế bào mang vectơ có chứa gen đích nguyên vẹn và có thể đợc biểu hiện trong môi trờng tế bào. Tất nhiên, những tế bào này cũng mọc đợc trên môi trờng chọn lọc kháng sinh.
Kết quả thu đợc trên đĩa thạch có rất nhiều khuẩn lạc mọc. Điều này cho thấy hiệu quả biến nạp bằng phơng pháp sốc nhiệt cao. Chúng tôi có thể kết luận sơ bộ rằng đã biến nạp đợc vectơ Ti-plasmid tái tổ hợp mang gen GlyP vào chủng tế bào E.coli DH5α. Vấn đề đặt ra là liệu trong những khuẩn lạc thu đợc, khuẩn lạc nào mang vectơ có chứa đoạn gen GlyP còn nguyên vẹn, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự có mặt của đoạn gen GlyP trong các dòng khuẩn lạc bằng phơng pháp colony-PCR (PCR trực tiếp từ khuẩn lạc).