Có nhiều phơng pháp chuyển gen vào thực vật nh chuyển gen thông qua A.
tumefaciens, chuyển gen trực tiếp vào các tế bào trần và thể transient, chuyển gen trực
tiếp qua tế bào trần và chuyển nạp gen bằng thiết bị bắn gen Ph… ơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens vừa cho hiệu quả cao, đơn giản lại ít tốn kém rất phù hợp với nớc ta nên đợc lựa chọn để chuyển các kết cấu gen thiết kế đợc vào một số cây trồng. Chúng ta đã biết, Ti-plasmid tái tổ hợp có thể đợc chuyển vào A. tumefaciens bằng phơng pháp trực tiếp nhờ sốc nhiệt sử dụng CaCl2, tuy nhiên hiệu quả biến nạp vào tế bào A. tumefaciens theo cách này tơng đối thấp so với tế bào E. coli. vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào A.
tumefaciens bằng phơng pháp xung điện.
Ti-plasmid tái tổ hợp sau khi thiết kế thành công chúng tôi tiến hành chuyển vào
A. tumefaciens bằng phơng pháp xung điện, đây là phơng pháp biến nạp rất có hiệu quả,
có thời gian thí nghiệm ngắn. Ba chủng tế bào A. tumefaciens Cv58C1, pGV2206, pGV3101 đợc sử dụng có mang gen mã hoá cho enzym kháng hai loại kháng sinh ampecilin và rifamycin. Trớc tiên, để phân tử ADN đi vào tế bào đợc rễ ràng chúng tôi
tiến hành tạo tế bào khả biến A. tumefaciens (mục 2.2.2.10). Tế bào khả biến A.
tumefaciens đợc bổ sung thêm plasmid tái tổ hợp và đợc xử lý ở điều kiện 25àF, 400Ω, 2,5 kV từ 8 - 10 giây. Sau khi xung điện, mẫu đợc bổ sung ngay 1ml môi trờng SOC, lắc ở 28oC trong hai giờ và cấy trải trên đĩa petri chứa môi trờng chọn lọc thích hợp YEP + ampecilin 50mg/l, kanamycin 50mg/l, rifamycin 100mg/l, nuôi ở 28oC qua đêm. Tơng tự mẫu đối chứng (không đợc bổ sung thêm vectơ tái tổ hợp) cũng đợc xử lý bằng xung điện và cũng đợc nuôi cấy trên môi trờng chọn lọc nh trên. Kết quả biến nạp bằng xung điện đợc trình bày ở bảng dới đây:
Bảng 9. Kết quả thí nghiệm biến nạp bằng xung điện chuyển Ti-plasmid tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens.
Môi trờng
Số lợng khuẩn lạc trung bình/1 đĩa petri Đối chứng Chủng Cv58c1 Chủng pGV 2206 Chủng pGV 3101 YEP+Amp+Rif +++ +++ +++ +++ YEP+Km+Amp+Rif - +++ +++ ++
Chú thích: (+++): xuất hiện rất nhiều khuẩn lạc; (++): xuất hiện khuẩn lạc; (-): không xuất hiện khuẩn lạc
Từ bảng 9 cho thấy, tế bào A. tumefaciens trong mẫu đối chứng (chủng vi khuẩn không mang vectơ tái tổ), mọc rất tốt trên môi trờng YEP chứa kháng sinh chọn lọc A.
tumefaciens, còn trên môi trờng chứa thêm kháng sinh kanamycin chọn lọc khuẩn mang
vectơ tái tổ hợp không mọc đợc. Đối với các mẫu thí nghiệm, khuẩn mọc rất nhiều trên môi trờng chứa cả 3 loại kháng sinh chọn lọc. Điều này cho thấy đã biến nạp thành công vectơ tái tổ hợp vào 3 chủng vi khuẩn A. tumefaciens. Trong đó, ở những đĩa chứa hai chủng Cv58c1 và pGV 2206 số lợng khuẩn lạc mọc nhiều hơn so với chủng pGV3101.
Hình 13. ảnh chụp đĩa thạch sau khi biến nạp vectơ Ti-plasmid vào tế bào A. tumefaciens
chủng Cv58C1