Thiết kế Vectơ Nhị Thể pBI121 Mang Gen Mã Hóa Kháng Nguyên Glycoprotein Của Virus Dại Phục Vụ Việc Chuyển Gen Trong Cây Trồng

Vectơ nhị thể (binary vector)

Vectơ nhị thể ra đời đã khắc phục đợc tình trạng khó nhân bản trong a. tumefaciens của vectơ liên hợp. Một vectơ nhị thể bao gồm những thành phần sau: 1) Vị trí ghép nối đa điểm; 2) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả trong E. tumefaciens, ví dụ RK2; 3) gen chọn lọc hoạt động cả ở vi khuẩn và thực vật nh gen kháng kháng sinh, gen β- glucuronidase ; 4) có khả năng vận chuyển nh… oriV, oriT, trfA, chỉ cần khi chuyển thông qua a. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp;. 5) Đoạn T-ADN ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên bắt buộc phải có. Ngoài ra còn có một số thành phần phụ trợ khác nh gen kích thích vận chuyển T-ADN (T-DNA transfer stimulator sequence = TSS). Loại vectơ vận tải mang GOI giữa đoạn biên của T-ADN và một plasmid bổ trợ có gen vir đảm nhận chức năng vận chuyển gen ngoại lai vào tế bào thực vật.

Plasmid bổ trợ đợc cải biến từ Ti-plasmid tự nhiên bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thùc vËt [1]. Hệ thống vectơ nhị thể luôn đợc cải tiến để có thể nâng cao hiệu suất chuyển gen thông qua A. Một trong những hớng cải biến là đa vào vectơ một chuỗi COS để phân lập các đoạn gắn lớn hoặc th viên gen thực vật, trong đó điển hình là vectơ.

Vectơ pBI121

Lợi dụng tính chất này, có thể gắn gen ngoại lại vào vùng enhancer sẽ làm mất khả năng gây nhiễm của virus khảm súp lơ [17]. Các đoạn kết thúc thờng chứa đuôi polyA nh AATTAA, hoặc AACCAA giúp bảo vệ các phân tử ARN thông tin đợc bền vững hơn và tránh đợc sự phân huỷ. - Chỉ thị chọn lọc (selectable marker): kết cấu gen mang đoạn khởi động NOS (nopaline synthase promoter-terminater) điều khiển sự biểu hiện gen kháng npt2 (neomycin phospho transferase gene), chỉ có những thể biến nạp sống đợc trên môi tr- ờng có kháng sinh kanamycin.

- Chỉ thị sàng lọc (screenable marker) không chỉ giúp nhận biết các thể biến nạp mà còn dự đoán đợc mức độ biểu hiện gen quan tâm trong mô thực vật đợc chuyển gen. Gen chỉ thị sàng lọc cần có một số đặc điểm sau: sản phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào thực vật, các enzym chỉ thị phải có khả năng dịch mã ổn định cao, phơng pháp phân tích thuận tiện, rẻ tiền, độ nhạy cao và có khả năng phản ứng với các polypeptit ngoài mà không ảnh hởng hoạt tÝnh enzym [7]. - Vùng MCS có chứa trình tự điểm cắt của rất nhiều loại enzym nh HindIII, SphI, PstI, EcoRV Trong đó chúng ta quan tâm đến hai loại enzym là … BamHI và SacI, trình tự điểm cắt của chúng ở hai đầu của gen GUS.

Vì vậy khi cắt pBI121 bằng hai loại enzym trên sau đó điện di chúng ta sẽ thu đợc hai băng tơng ứng với kích thớc khoảng 11,2Kb (vectơ) và 1,8Kb (gen gus). Trong tơng lai, việc tối u hoá hệ thống chủ/vectơ và cải tiến các vectơ trên cơ sở nghiên cứu tỉ mỉ các yếu tố tham gia vào quá trình chuyển nạp ổn định, các yếu tố đa gen chuyển nạp vào vị trí nhất định trong genome thực vật và các điều kiện nuôi cấy tái sinh cây chuyển gen vẫn là những vấn đề cần thiết trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vËt.

Tình hình nghiên cứu vaccine thực vật trên thế giới

Những nhà nghiên cứu ở trờng đại học Thomas Jefferson bang Philadelphia, USA đã tạo ra cây cà chua có biểu hiện kháng nguyên của virus dại. Karaser và các cộng sự tại phòng thí nghiệm Biotechnology Foundation của Thomas Jefferson University cũng đã biểu hiện đợc vaccine dại trong cây rau bina (spinach). Karaser thông báo rằng, đề tài nghiên cứu này đã đợc kiểm chứng bằng một cuộc thử nghiệm gồm 16 ngời chia thành hai nhóm: một nhóm đối chứng và một nhóm thí nghiệm.

Kết quả khi kiểm tra thì những ngời này có số lợng kháng thể tăng hơn so với nhóm còn lại. Xuất phát từ nhu cầu về vaccine ở nớc ta hiện nay, đồng thời để nhanh chóng nắm bắt và tiếp cận với công nghệ mới trong việc sản xuất vaccine và các dợc chất chữa bệnh cho ngời, động vật trên đối tợng cây trồng. Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học đang thực hiện một số đề án chuyển gen mã hoá cho kháng nguyên của một số virus nh virus dại và virus viêm não Nhật Bản vào cây trồng.

Vật liệu v à phơng pháp

- Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi ADN (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gene Plulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Khi nằm trong điện trờng ADN sẽ đi từ cực âm sang cực dơng, trọng l- ợng phân tử ADN nào nhẹ nhất sẽ đi xuống trớc, nặng di chuyển chậm sẽ đi xuống sau tạo thành một dãy ADN có kích thớc khác nhau. Mẫu ADN đợc trộn với 3àl đệm tra mẫu (loading buffer - 0,1ml bromophenol blue 10%; 0,3ml glycerol 100% và dẫn bằng nớc đến 1ml) và đợc tra vào các giếng nhỏ trên gel, giếng đầu tiên thờng dùng để tra thang ADN chuẩn, chạy điện di với hiệu điện thế 100V trong thời gian 30 phút.

Để quan sát đợc ADN dới ánh sáng tử ngoại ngời ta phải tiến hành nhuộm mẫu trong dung dịch ethidium bromide nồng độ 0,5àg/ml trong 30 - 40 phút, lắc nhẹ, sau đó rửa bằng nớc cất và đem soi dới tia tử ngoại 234nm trên máy soi ADN và chụp ảnh. - Điện di sản phẩm PCR hoặc sản phẩm cắt enzym, mỗi một mẫu thì điện di thành hai giếng, một giếng đối chứng điện di với 5àl mẫu, sau khi điện di xong chỉ cắt, nhuộm và soi gel ở giếng đối chứng, sau đó đánh dấu vào kích thớc cần tìm, ghép hai mẫu gel lại và cắt lấy đoạn gel mang gen cần quan tâm ở giếng còn lại. - Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm cực đại trong 1 phút - Loại bỏ dịch chảy qua cột.

Tinh sạch sản phẩm PCR nhằm loại bỏ các thành phần trong phản ứng còn d thừa (Taq polymerase, các ion ).…. Vì trong mồi RabG-start-BamHI có chứa trình tự điểm cắt của enzym BamHI và RabG-stop-SacI có chứa trình tự điểm cắt của SacI. Sản phẩm PCR và vectơ pBI121 sau khi đợc xử lý bằng enzym giới hạn sẽ tạo ra những đầu dính ở hai đầu phân tử ADN.

Khi ta trộn lẫn chúng với nhau dới sự xúc tác của enzym T4 ligase, các đầu dính này sẽ ghép cặp bổ sung với nhau. Cách pha: Cân lần lợt các thành phần trên, sau đó bổ sung nớc cất đến thể tích. Chia 50àl dịch khuẩn vào mỗi ống eppendorf 1,5ml, làm đông lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và giữ chủng ở -85oC.

Cách pha: Cân lần lợt các thành phần trên, sau đó bổ sung nớc cất đến thể tích định mức, dùng máy khuấy từ khuấy đều cho tan hết, sau đó chỉnh đến pH 7,0. Cách làm: Cân lần lợt các thành phần trên, thêm nớc cất đến thể tích định mức, dùng máy khuấy từ khuấy tan hết các chất và khử trùng ở 1170C. - Dùng pipet chuyển dung dịch sang cuvet dùng trong xung điện đã đợc làm lạnh từ trớc.

- Cấy trải 50àl trên môi trờng chọn lọc YEP đặc có bổ sung thêm rifamycin 100mg/l, ampicilin 50mg/l, kanamycin 50mg/l. + Colony-PCR: Phơng pháp này cũng tơng tự nh phản ứng PCR nhng thay các mẫu ADN hoặc plasmid bằng các tế bào vi khuẩn đợc lấy trực tiếp từ khuẩn lạc.