Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate ( Luận văn thạc sĩ)

Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate ( Luận văn thạc sĩ)Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate ( Luận văn thạc sĩ)Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate ( Luận văn thạc sĩ)Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate ( Luận văn thạc sĩ)Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate ( Luận văn thạc sĩ)

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ VĂN SƠN

Thái Nguyên - 2014

Trang 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/

i

LỜI CAM ĐOAN

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thành Luân

XÁC NHẬN CỦA TRƯỞNG KHOA CHUYÊN MÔN

XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Lê Văn Sơn

Trang 3

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Sơn đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành KS Hồ Mạnh Tường, cán bộ nghiên cứu

, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm của đề tài

& Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi bày tỏ lời cảm ơn đến các đồng nghiệp, bạn bè cùng toàn thể gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập

Thái Nguyên, ngày 16 tháng 04 năm 2014

Tác giả

Nguyễn Thành Luân

Trang 4

iii

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Chất diệt cỏ và ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 3

2.1.1 Cỏ dại và cách phòng trừ 3

2.1.2 Các loại thuốc diệt cỏ đang sử dụng 4

2.2 Chất diệt cỏ glyphosate 8

2.2.1 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của glyphosate 8

2.2.2 Tình hình sử dụng thuốc diệt cỏ glyphosate 10

2.3 EPSPS và ứng dụng trong tạo cây trồng kháng glyphosate 13

2.3.1 Cây trồng chuyển gen kháng chất diệt cỏ 13

2.3.2 EPSPS 18

2.3.3 Ứng dụng EPSPS trong tạo cây chuyển gen 19

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Vật liệu 22

3.1.1 Thực vật 22

3.1.2 Chủng vi khuẩn 22

3.1.3 Các vector 22

3.1.4 Hóa chất 22

3.1.5 Máy móc và thiết bị 23

3.2 Phương pháp nghiên cứu 23

3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc 23

.tumefaciens CV58 29

Trang 5

iv

yển gen 30

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc 34

4.1.2 Kết quả chuyển cấu trúc pBI121/EPSPS vào cây thuốc lá 42

4.1.3 Phân tích 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5 2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

Trang 6

v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase

gus β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase

IAA Indoleacetic acid

IBA Indole-3-butyric acid

MS Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

OD Optical density

Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u

Trang 7

3.4 Thành phần phản ứng PCR với pUC18- F và pUC18- R 28 3.5 Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 31 3.6 Thành phần chạy phản ứng PCR với EPSPS-F và CYMC-R 32 4.1 Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen SP-EPSPS-Cmyc 45

Trang 8

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

4.2 Trình tự đoạn gen mã hóa cho protein của EPSPS 35

4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pBluescriptII 37 4.7 Kết quả cắt vector pBI121 bằng XbaI/SacI 38

4.9 Kết quả điện di phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng

XbaI/SacI và PCR

40

4.10 Kết quả PCR pBI121/EPSPS trong A tumefaciens 42 4.11 Mảnh lá cảm ứng trên môi trường GM sau 2 ngày 43 4.12 Mảnh lá sau khi đồng nuôi cấy 2 ngày trên môi trường GM 43 4.13 Chồi mọc lên trên môi trường MS + BAP + kanamycin +

4.18 Kết quả kiểm tra các dòng thuốc lá mang gen EPSPS kháng

glyphosate

48

Trang 9

1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cỏ dại luôn là một vấn đề lớn với cây trồng Cỏ dại không chỉ cạnh tranh với cây trồng để lấy nước, chất dinh dưỡng, ánh nắng mặt trời, khoảng không để phát triển mà còn là nơi cư trú cho côn trùng và các loại sâu bệnh gây hại, làm giảm sút chất lượng mùa màng, đem theo hạt giống cỏ dại trộn lẫn với hạt giống cây trồng

Theo phương pháp truyền thống cỏ dại thường được kiểm soát bằng cách: cầy sới, nhổ cỏ, phun thuốc diệt cỏ, hay kết hợp tất cả những tập quán này Nhưng phương pháp này chỉ áp dụng được trên diện tích rất nhỏ Biện pháp diệt cỏ hiệu quả cho diện tích canh tác lớn được đưa ra là phun thuốc diệt cỏ một lần trên diện tích lớn Thuốc diệt cỏ tác động vào một số enzym chủ yếu trong quá trình trao đổi chất của cây, làm rối loạn quá trình tổng hợp hữu cơ của cây và cuối cùng là tiêu diệt cỏ dại Loại thuốc diệt cỏ hay được

sử dụng phổ biến ở Việt Nam là glyphosate và glufosinate Hai loại thuốc diệt

cỏ này rất hữu ích trong việc kiểm soát cỏ dại và ít ảnh hưởng trực tiếp lên vật nuôi và không tổn hại lâu trong môi trường Chúng có hiệu quả cao nhất và an toàn nhất trong số những hoá chất dùng trong nông nghiệp Tuy nhiên, hoạt tính tác động lên cỏ dại cũng tác động giống hệt lên cây trồng, kết quả là tiêu diệt cả cỏ dại và cây trồng

EPSPS là enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp các amino

và vi khuẩn, dạng này nó bị ức chế bởi glyphosate Dạng EPSPS II chỉ có ở

một số vi khuẩn như Pseudomonas sp strain PG2982, Agrobacterium

cao và đã được nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng Để giải quyết vấn đề

Trang 10

2

phòng trừ được cỏ dại và đảm bảo được năng suất chất lượng cây trồng, việc

chọn tạo được giống cây trồng mang mang gen EPSPS từ A.tumefacien sp

CP4, có khả năng chống chịu được chất diệt cỏ glyphosate là một trong các hướng đi quan tâm nhất hiện nay

Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết

kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate.”

Đề tài được thực hiện nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm khoa học quốc gia Việt Nam

1.2 Mục tiêu của đề tài

Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate

1.3 Nội dung nghiên cứu

1.3.1 Thiết kế vector chuyển gen

- Xác định và sửa đổi trình tự nucleotid gen EPSPS phù hợp biểu hiện trong thực vật

- Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang cấu trúc EPSPS mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate

- Chuyển cấu trúc EPSPS vào vi khuẩn A tumefaciens CV58

- Biến nạp cấu trúc EPSPS vào cây thuốc lá

- Chọn lọc các dòng thuốc lá chuyển gen

1.3.3 Phân tích

- Kiểm tra cấu trúc gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen

- Kiểm tra biểu hiện protein tái tổ hợp trong cây thuốc lá chuyển gen

- Đánh giá khả năng kháng glyphosate của cây thuốc lá chuyển gen

Trang 11

Phân loại theo chu kỳ sinh trưởng: Theo cách phân loại này ta thấy có

hai nhóm cỏ: cỏ hàng năm và cỏ lâu năm

Cỏ hàng năm: là các loại cỏ hoàn thành vòng đời (từ hạt đến nảy mầm ra hoa tạo hạt) trong một hoặc hai mùa canh tác trong một năm Các loại cỏ này thường chết vào mùa khô sau khi hoàn thành vòng đời của chúng

Cỏ lâu năm: là những loại cỏ sống lâu hơn một năm Loại cỏ này rất khó diệt

vì có thân ngầm hoặc thân bò trên mặt đất, có bộ rễ, củ phát triển sâu, khả năng sinh sản vô tính mạnh

Phân loại theo hình thái: Theo kiểu phân loại hình thái, ta có cỏ lá hẹp

(còn gọi là cỏ một lá mầm) và cỏ lá rộng (còn gọi là cỏ hai lá mầm)

Cỏ một lá mầm có những đặc tính chung như: lá hẹp, dày, mọc xiên, mặt lá có lông, rễ thường là rễ chùm, ăn nông, đỉnh sinh trưởng được bọc kín trong bẹ

lá Tuy nhiên, trong nhóm này cũng có một số loại cỏ có đặc tính hơi khác như cỏ cói lác lá hẹp nhưng mềm, mỏng và trơn

Cỏ hai lá mầm thường có lá rộng, nằm ngang, mỏng và mềm; rễ thường là rễ cọc, ăn sâu, đỉnh sinh trưởng để lộ ra ngoài

Phân loại theo đặc điểm thực vật:

Nhóm cỏ hoà bản: cỏ có bản lá hẹp, dài, gân phụ song song với gân chính chạy dài từ đầu lá tới cổ lá Thân: thường tròn và bọng ruột, lá mọc cách, đính trên thân theo hai hàng Rễ: thường là rễ chùm, ăn nông

Trang 12

4

Nhóm cỏ chác lác: lá hẹp nhưng ngắn hơn cỏ hoà bản, thân thường đặc ruột

có góc cạnh tam giác, lá đính trên thân theo ba hàng kiểu xoắn ốc

Nhóm cỏ lá rộng: lá rộng, nằm ngang, mọc đối, mặt lá ít lông, gân lá sắp xếp theo nhiều kiểu hình khác nhau

Cỏ dại từ xưa tới nay đều là vấn đề nhức nhối trong canh tác nông nghiệp Cỏ dại làm giảm năng suất và phẩm chất của cây trồng: do có bộ rễ phát triển rất mạnh, phần lớn được phân bố ở lớp đất mặt nên dễ dàng cạnh tranh với cây trồng về dinh dưỡng, ánh sáng và nước làm cho cây trồng không

đủ điều kiện sinh sống nên sinh trưởng và phát triển kém, cho năng suất thấp, phẩm chất nông sản giảm Cỏ dại là ký chủ của sâu bệnh: Các cây cỏ dại cùng

họ có những đặc điểm giống cây trồng là những ký chủ phụ rất tốt cho sâu bệnh Cỏ dại làm tăng chi phí sản xuất: như tốn công làm cỏ, diệt cỏ bằng hoá chất …

Người nông dân có thể phòng trừ cỏ dại bằng một số phương pháp Biện pháp phòng: Không để cỏ tạo hạt trên ruộng, sử dụng giống không lẩn hạt cỏ,

vệ sinh nông cụ sạch cỏ trước khi sử dụng, dùng phân hữu cơ đã hoai ủ, dùng lưới chắn hạt cỏ khi cho nước vào ruộng…

Biện pháp trừ: có thể nhổ cỏ bằng tay, làm đất, sử dụng nước thích hợp vào dùng thuốc hoá học Hiện nay, việc sử dụng thuốc hoá học để diệt trừ cỏ được coi là biện pháp hữu hiệu nhất vì nó tiết kiệm được công lao động, có thể sử dụng nhanh chóng trên diện rộng và được sử dụng ở nhiều thời điểm khác nhau, không cực nhọc, vất vả như các biệp pháp làm cỏ khác

2.1.2 Các loại thuốc diệt cỏ đang sử dụng

Thuốc diệt cỏ tuỳ theo loại khác nhau có thể tác động đến cỏ dại theo nhiều cách khác nhau Người ta phân loại theo kiểu tác dộng của thuốc trừ cỏ như:

Thuốc diệt cỏ có tác động chọn lọc và thuốc diệt cỏ có tác động không chọn lọc:

Trang 13

và thuốc tiếp xúc với thuốc

Thuốc diệt cỏ tiếp xúc và thuốc diệt cỏ nội hấp:

Thuốc diệt cỏ tiếp xúc chỉ gây hại cho các bộ phận của cây tiếp xúc với thuốc Thuốc chỉ có tác dụng với cỏ hàng năm, không có thân ngầm trong đất Ví dụ các thuốc trừ cỏ Propanil, Gramoxone…

Thuốc diệt cỏ nội hấp (lưu dẫn) có thể dùng bón, tưới vào đất hoặc phun lên

lá Sau khi xâm nhập vào lá, rễ thuốc dịch chuyển đến khắp các bộ phận trong thực vật, thuốc được dùng để trừ cỏ hàng niên và lưu niên

Thuốc diệt cỏ phun lên lá và thuốc diệt cỏ phun hoặc bón, tưới vào đất:

Thuốc diệt cỏ phun lên lá là những thuốc trừ cỏ chỉ có thể xâm nhập vào lá cỏ

để gây hại cho cỏ (thuốc này không có khả năng xâm nhập vào rễ cỏ) Những

thuốc này được dùng phun vào lúc cỏ đã mọc, còn non Ví dụ thuốc trừ cỏ Onecide, Propanil…

Những thuốc diệt cỏ phun hoặc bón vào đất chỉ có thể xâm nhập vào bên trong cỏ dại qua mầm hoặc bộ rễ của cỏ Những thuốc này có loại được dùng phun trên đất mới cày bừa xong hoặc vừa gieo xong, khi cỏ còn chưa xuất hiện trên mặt ruộng Ví dụ: thuốc trừ cỏ Sirius

Ngoài ra còn có những loại thuốc diệt cỏ vừa có khả năng xâm nhập vào lá, vừa xâm nhập vào rễ cỏ Những thuốc này có thể dùng phun lên ruộng khi cỏ

Trang 14

Luận án đầy đủ ở file: Luận án Full

Định dạng
Số trang	63
Dung lượng	721,15 KB
File đính kèm	Luận văn Full.rar (2 MB)