Bước đầu đánh giá đa dạng sinh học của loài gymnema SP ở việt nam thông qua chỉ thị hình thái và chỉ thị ADN

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ VÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ VÂN

ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN

XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG

PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG

CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CÓ HIỆU LỰC CAO NHẤT

TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ VÂN

ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN

XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG

PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG

CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CÓ HIỆU LỰC CAO NHẤT

LỜI CẢM ƠN

Để thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính

trọng và biết ơn sâu sắc tới cô giáo ThS Lê Thị Thu Hương (Bộ môn Vi sinh – Sinh học,

trường Đại học Dược Hà Nội) – người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và cho tôi những lời khuyên quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy TS Bùi Quang Phúc (Khoa Nghiên cứu

điều trị sốt rét, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương) cùng tập thể cán bộ trong

Khoa đặc biệt chị TS Nguyễn Thị Minh Thu đã hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi

giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm và nghiên cứu hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, các phòng ban và các bộ môn Trường Đại Học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, tạo điều kiện trong 5 năm học và hoàn thành tốt khóa học

Cuối cùng, tôi xin gửi đến những người thân trong gia đình, bạn bè đặc biệt nhóm NNCC,

những người đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi lời cảm ơn sâu sắc trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2013

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT PLASMODIUM 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái 3

1.1.2 Chu kỳ phát triển 4

1.1.2.1 Chu kỳ phát triển vô tính trong người 4

1.1.2.2 Chu kỳ phát triển hữu tính trong cơ thể muỗi 5

1.2 TÌNH HÌNH SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 5

1.2.1 Vài nét khái quát về bệnh sốt rét 5

1.2.2 Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam 6

1.2.2.1 Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới 6

1.2.2.2 Tình hình bệnh sốt rét ở Việt Nam 6

1.2.3 Tình hình kháng thuốc của Plasmodium 7

1.2.3.1 Tình hình kháng thuốc của Plasmodium trên thế giới 7

1.2.3.2 Tình hình kháng thuốc của Plasmodium ở Việt Nam 8

1.3 ĐẶC ĐIỂM ARTEMISININ VÀ DẪN XUẤT 9

1.3.1 Nguồn gốc, tính chất của artemisinin và dẫn xuất 9

1.3.1.1 Nguồn gốc, cấu trúc, tính chất của artemisinin 9

1.3.1.2 Đặc điểm một số dẫn xuất của artemisinin 9

1.3.2 Cơ chế tác dụng và nhược điểm chống sốt rét của ART và dẫn xuất 10

1.3.2.1 Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất 10

1.3.2.2 Nhược điểm của artemisinin và dẫn xuất 11

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ 32, 33, 39c, 39d, 39e 12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu, ưu điểm của các dẫn xuất 10 – deoxoartemisinin 12

1.4.2 Cấu trúc, tính chất của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 12

1.4.2.1 Nghiên cứu tổng hợp 10-[(2’-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32) và 10-[(2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (33) 13

1.4.2.2 Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất amid 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide (39c), (deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide (39d), 10-(deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide (39e) 13

1.4.2.3 Tính chất của 5 dẫn xuất 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 16

2.1.1 Chủng ký sinh trùng sốt rét 16

2.1.2 Động vật thí nghiệm 16

2.1.3 Thuốc và hóa chất nghiên cứu 16

2.1.4 Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu 17

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.3.1 Thử nghiệm in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e trên chủng P.falciparum kháng CHQ nuôi cấy 17

2.3.1.1 Nuôi cấy KSTSR P falciparum liên tục trong phòng thí nghiệm 17

2.3.1.2 Thử nghiệm in vitro theo phương pháp thử thuốc 48 giờ 19

2.3.2 Thử nghiệm độc tính cấp của dẫn xuất có hoạt lực in vitro mạnh nhất 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1.1 Thử nghiệm hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 23

3.1.2 Thử nghiệm độc tính cấp của hợp chất 32 32

3.2 BÀN LUẬN 33

3.2.1 Kết quả thử hoạt lực in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 33

3.2.2 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp dẫn xuất 32 – chất có hiệu lực in vitro mạnh nhất 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 KẾT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tiếng việt

32 10β-[2’β-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin

33 10β-[2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin

39c 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl)

acetamide

39d 10β-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl)

acetamide39e 10β-(deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide

P falciparum Plasmodium falciparum

P vivax Plasmodium vivax

RI, II, III Mức độ kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét

GHS Globally Harmonised Classification System

for Chemical Substances and Mixtures

Hệ thống phân loại độc tính cấp theo giá trị giới hạn LD50

IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% ký sinh

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Biểu

3.1 Tỉ lệ ức chế chủng P falciparum K1 của chất 32 25

3.2 Giá trị IC50 của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P falciparum K1 30

3.3 Giá trị MIC của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P falciparum K1 31

Hình Tên hình Trang

1.1 Công thức cấu tạo của ART 9

1.2 Sự biến đổi của dẫn xuất ART trong huyết tương 11

1.3 Qui trình tổng hợp các chất 32 và 33 13

1.4 Qui trình tổng hợp các dẫn xuất amid của ART (39a-e) 14

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Đặc trưng lý – hóa cơ bản của 5 dẫn xuất 15

3.1 Mật độ KST chủng P falciparum kháng CHQ trong 10 ngày

trước khi thử thuốc

23

3.2 Sự đáp ứng của chủng P falciparum K1 trên in vitro với chất 32 24

3.3 Sự đáp ứng của chủng P falciparum K1 trên in vitro với chất 33 26

3.4 Sự đáp ứng của chủng P falciparum K1 trên in vitro với chất

3.7 Nồng độ ức chế 50% KST phát triển của 5 dẫn xuất ở chủng K1 29

3.8 Nồng độ ức chế tối thiểu của 5 dẫn xuất trên chủng

3.10 Kết quả quan sát cân nặng và đại thể các cơ quan khi mổ toàn

bộ cả 13 lô chuột sau 7 ngày theo dõi 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Sốt rét (SR) là một bệnh lây theo đường máu, do ký sinh trùng (KST) Plasmodium được truyền từ người bệnh sang người lành bởi muỗi thuộc giống Anopheles

Y tế thế giới (WHO) năm 2012 còn 99 quốc gia sốt rét lưu hành nặng và số ca mắc sốt rét ước tính chiếm 78% toàn cầu Việt Nam là khu vực sốt rét lưu hành nặng, đặc biệt là khu vực trung Nam bộ và đông Nam bộ Trong những năm gần đây sốt rét đang tăng lên, chỉ trong năm 2011

đã có 15,6 triệu người nhiễm ký sinh trùng sốt rét và 10% trong đó bị tử vong [41]

Tình trạng xuất hiện và lan rộng ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc đang đe dọa một số

chương trình phòng chống sốt rét, đặc biệt là ký sinh trùng Plasmodium falciparum đã kháng lại

cloroquin và các thuốc truyền thống khác Từ năm 1990, thuốc artemisinin và dẫn chất artesunat được tiến hành thử nghiệm lâm sàng và chính thức đưa vào sử dụng rộng rãi trong Chương trình Quốc gia phòng chống sốt rét ở nước ta góp phần quan trọng trong trong việc hạ thấp tỷ lệ bệnh

và tỷ lệ tử vong do sốt rét Tuy nhiên nhược điểm của artemisinin và dẫn xuất là thời gian bán

thải ngắn và tỷ lệ tái phát cao [4] Ngoài ra, theo báo cáo của WHO năm 2012 Plasmodium

falciparum đã kháng lại artemisinin ở nhiều khu vực như Đông Nam Á, Châu Phi đặc biệt là các

nước khu vực sông Mê-kông Do đó, việc tìm ra thuốc điều trị mới có hiệu lực cao với

Plasmodium kháng thuốc là mục tiêu cấp bách của các nhà khoa học trên toàn thế giới [41].

Hiện nay, hướng nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất artemisinin đã cho nhiều kết quả tốt, nổi bật là dẫn xuất mono hoặc dime của artemisinin có chứa liên kết 10-C-C bền vững Đi từ dihydroartemisinin và sản phẩm trung gian 10β-allyldeoxoartemisinin, các nhà khoa học của Viện Hóa học lần đầu tiên đã sản xuất thành công 5 dẫn xuất của artemisinin là: 32, 33, 39c,

39d, 39e Các hợp chất này bước đầu đã thể hiện hoạt tính chống sốt rét in vitro và in vivo vượt

trội so với artemisinin và arteether [36], [37]

Vì vậy, để góp phần đánh giá hiệu lực của các dẫn xuất artemisinin trên Plasmodium

falciparum chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất artemisinin

trên chủng Plasmodium falciparum kháng cloroquin và thử độc tính cấp của dẫn xuất có

hiệu lực cao nhất trên động vật thực nghiệm” với các mục tiêu sau:

 Nghiên cứu hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất artemisinin 32, 33, 39c, 39d, 39e trên chủng Plasmodium falciparum kháng cloroquin.

 Thử nghiệm độc tính cấp của dẫn xuất có hiệu lực mạnh nhất trên động vật thực nghiệm.

Plasmodium ovale (P ovale), Plasmodium malariae (P malariae) [8], [10] Cố định hồng cầu

(HC) trên phiến kính (lam kính) rồi nhuộm theo phương pháp Giemsa hay các phương pháp tương tự (Wright, Field) để có thể quan sát và định loài ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) Trên tiêu bản thường thấy KSTSR gồm 2 thành phần chính là nguyên sinh chất bắt màu xanh và nhân bắt màu đỏ, ngoài ra còn thấy các hạt sắc tố [8], [15] Trong giai đoạn HC ở người, KSTSR có 3 dạng hình thể [8], [15]:

- Thể tư dưỡng (Trophozoite hay thể nhẫn): thể tư dưỡng non có hình nhẫn, đường kính khoảng

1/5 – 1/3 đường kính HC, gồm một nhân màu đỏ, tế bào chất màu xanh da trời và một không bào

to, chiếm phần lớn tế bào chất Thể tư dưỡng già có hình dạng giống amip

- Thể phân liệt (Schizonte): Nhân và tế bào chất đã phân chia Thể phân liệt già, mỗi mảnh nhân được một mảnh tế bào chất bao quanh (mảnh trùng/merozoite) Số lượng mảnh trùng tùy vào loài Plasmmodium.

- Thể giao bào (Gametocyte): Là thể hữu tính, hình dạng khác nhau tùy theo loài.

* Hình thể của P falciparum trên lam máu nhuộm theo phương pháp Giemsa [8], [15]:

- Thể tư dưỡng non: Nhẫn nhỏ có đường kính chỉ bằng 1/5 – 1/6 đường kính HC Thể nhẫn thường nằm ở rìa tế bào HC và hay gặp nhẫn có 2 nhân.

- Thể tư dưỡng già: Nguyên sinh chất dày hơn, nhân to ra, không bào biến mất và xuất hiện các hạt sắc tố hình que, màu nâu ánh vàng, rải rác hoặc tập trung thành từng đám trên nguyên sinh chất Thể này ít thấy ở máu ngoại vi

- Thể phân liệt: Nhân và nguyên sinh chất phân chia thành 8 – 32 mảnh Khi chín muồi, mỗi mảnh nhân có 1 vòng nguyên sinh chất bao quanh tạo thành 8 – 32 mảnh trùng Rất hiếm thấy ở máu ngoại vi, thường chỉ thấy ở thể SR nặng hoặc SR ác tính, bình thường chúng tập trung trong máu mao mạch

- Thể giao bào: Giao bào đực hình quả thận, đầu tròn, nguyên sinh chất có màu tím hoa cà, nhân không có giới hạn rõ rệt Những hạt sắc tố màu nâu, thô, ít, phân bố rải rác trong nguyên sinh chất, xen kẽ có những hạt sắc tố màu đen Giao bào cái hình quả chuối hay lưỡi liềm, nguyên sinh chất có màu xanh da trời, nhân bắt màu đỏ tập trung ở giữa, xung quanh là những hạt sắc tố màu đen [8], [15]

1.1.2 Chu kỳ phát triển

Chu kỳ của KSTSR gồm 2 giai đoạn phát triển rất phức tạp gồm 1 chu kỳ phát triển vô tính

trong người và 1 chu kỳ sinh sản hữu tính trong muỗi Anopheles.

1.1.2.1 Chu kỳ phát triển vô tính trong người

a) Giai đoạn tiền hồng cầu (Giai đoạn trong gan)

Khi muỗi đốt người, thoa trùng có trong tuyến nước bọt của muỗi SR thuộc giống

Anopheles truyền vào người, xâm nhập vào máu, chỉ tồn tại trong máu ngoại vi khoảng 30 phút

Sau đó, một bộ phận (thoát khỏi tác động của miễn dịch tế bào) xâm nhập vào tế bào gan, phát triển rồi phân chia thành thể phân liệt Thể phân liệt phát triển đầy đủ sẽ phá vỡ tế bào gan, giải phóng ra rất nhiều mảnh trùng của gan, các mảnh trùng này sẽ đi vào máu và ký sinh trong tế bào HC [4], [8], [15]

Đối với P falciparum và P malariae: Tất cả các thoa trùng vào gan đều phát triển và trưởng

thành, phân chia thành các mảnh trùng rồi vào máu trong thời gian tương đối ngắn [8], [15]

Đối với P vivax và P ovale, ngoài sự phát triển tức thì của đa số thoa trùng, có một số thoa

trùng không phát triển ngay mà tạo thành thể ngủ ở lại tế bào gan, có thể sau 1, 2, 3 – 6 tháng mới phát triển muộn hơn thành thể ẩn gây các cơn SR tái phát xa – giai đoạn ngoại HC [8], [15]

Thời gian hoàn thành giai đoạn tiền HC: P falciparum là 5-7 ngày, P malariae là 14-16 ngày, P vivax là 7-8 ngày, P ovale là 9-10 ngày [8], [15].

b) Giai đoạn phát triển trong hồng cầu (Giai đoạn trong máu)

Trong máu, các mảnh trùng được giải phóng từ tế bào gan sẽ xâm nhập vào HC, phát triển

1 chu kỳ sinh sản vô tính ở đó Lần lượt ở thể tư dưỡng non, rồi phát triển thành thể tư dưỡng già, sau đó nhân và nguyên sinh chất được phân chia ra làm nhiều mảnh để tạo thành thể phân liệt Thể phân liệt phát triển đầy đủ sẽ phá vỡ HC, giải phóng ra các mảnh trùng của HC Hầu hết các mảnh trùng này lại tiếp tục xâm nhập vào các HC bình thường mới để sinh sản vô tính trong HC Một số mảnh trùng biệt hóa thành thể hữu tính: các giao bào đực và giao bào cái Nếu không được muỗi truyền bệnh hút vào dạ dày, các giao bào này sẽ tự tiêu hủy trong máu [4], [8], [15]

Thời gian để hoàn thành một chu kỳ của KSTSR trong HC khác nhau tùy loài KSTSR: P

falciparum khoảng 48 giờ, gây sốt cách nhật hoặc sốt hàng ngày nếu nhiễm nhiều dòng khác

nhau; P vivax và P ovale khoảng 48 giờ, gây sốt cách nhật; P malariae khoảng 72 giờ gây sốt

3 ngày một cơn [8], [15]

1.1.2.2 Chu kỳ phát triển hữu tính trong cơ thể muỗi

Sau khi được muỗi Anopheles hút vào dạ dày, các giao bào đực và cái phát triển thành giao

tử Giao tử đực và cái phối hợp với nhau tạo thành hợp tử rồi trứng di động Trứng di động chui qua thành dạ dày muỗi, phát triển trên mặt ngoài của thành dạ dày, tròn lại, to dần, phân chia thành nhiều thoa trùng bên trong Cuối cùng, thoa trùng được giải phóng, di chuyển về tuyến nước bọt của muỗi, khi muỗi đốt người thoa trùng xâm nhập cơ thể người và bắt đầu chu kỳ sinh sản vô tính trong người [4], [8], [15]

1.2 TÌNH HÌNH SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.2.1 Vài nét khái quát về bệnh sốt rét

Bệnh sốt rét là bệnh lây nhiễm do ký sinh trùng đơn bào thuộc giống Plasmodium gây ra

và các tổ chức khác [10], [39]

1.2.2 Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam

1.2.2.1 Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới

Bệnh sốt rét có mặt, lưu hành rộng khắp ở vùng nhiệt đới, vùng cận nhiệt đới và các vùng khí hậu ôn hòa [10] Bệnh SR lan truyền ở vùng cận sa mạc Sahara, Châu Phi có mặt ở hầu hết mọi nơi, đến các khu vực riêng biệt không đồng đều như Đông Nam Á, Ấn Độ, Trung và Nam

Mỹ [4]

Bệnh SR vẫn là gánh nặng sức khỏe toàn cầu với gần một nửa dân số trên thế giới có nguy

cơ mắc sốt rét, mỗi năm có khoảng 250 triệu ca mắc trong đó 1 triệu ca tử vong [28] Trong đó châu Phi chiếm 90% và được cho là khu vực có SR lưu hành nặng với gần 1 triệu trẻ em dưới 5 tuổi hàng năm chết do sốt rét đơn thuần hoặc phối hợp với các bệnh khác Tính trung bình cứ

125 đứa trẻ chết trong 1 giờ và 2 đứa trẻ chết trong 1 phút [4] Sau châu Phi, khu vực châu Á –Thái Bình Dương là nơi bị ảnh hưởng nặng nề với 21 triệu người mắc sốt rét hàng năm [34] Tại các nước khu vực Đông Nam Á, mặc dù trong những năm gần đây, tỷ lệ mắc sốt rét xác định trong khu vực đã giảm xấp xỉ 75% từ 2000 đến 2011 [41], nhưng bệnh SR vẫn đang lưu hành với ở hầu hết các nước với 88% dân số trong tổng số 1320 triệu người sống trong khu vực [4]

và Đông Nam Bộ [4], [17], [41]

Từ năm 1958, chương trình thanh toán sốt rét được thực hiện ở miền Bắc và mở rộng ra cả nước năm 1976 đã thu được nhiều kết quả tốt Nhưng cuối những năm 70 – 80 do thiếu nguồn lực, di biến động dân cư, hậu quả chiến tranh và nhiều nguyên nhân khác nên bệnh sốt rét đã quay trở lại và ngày càng nghiêm trọng Năm 1991 Việt Nam chuyển sang chiến lược PCSR do WHO đề xướng đã có kết quả nổi trội theo đánh giá giai đoạn 2001 – 2005 bệnh nhân sốt rét (BNSR) giảm 69%, chết do sốt rét giảm 87% [2]

Theo báo cáo của WHO năm 2012 tỷ lệ mắc sốt rét ở Việt Nam đã giảm trên 75%, điều này chứng tỏ bệnh SR đã được y tế và cộng đồng rất quan tâm đặc biệt ở vùng sâu, vùng xa, vùng dân tộc thiểu số, nơi bà con còn chưa có nhiều kiến thức về bệnh SR [41]

1.2.3 Tình hình kháng thuốc của Plasmodium

1.2.3.1 Tình hình kháng thuốc của Plasmodium trên thế giới

Trong những năm gần đây, kháng thuốc đang là thách thức lớn trong phòng chống sốt rét

trên toàn cầu, đặc biệt là chủng Plasmodium falciparum được phát hiện từ đầu thế kỷ 20.

Năm 1910 P falciparum được phát hiện kháng quinin đầu tiên ở Brazil và hiện đã kháng ở nhiều vùng Đông Nam Á, Nam Mỹ, Châu Phi (Tanzania) [16], [40] Năm 1949, P falciparum

và P malariae kháng proguanin được phát hiện ở Brazil và sau đó lan ra Kennya, Tanzania, Chi

Lê, Malaysia, Indonesia và Việt Nam (Peter, 1970) [16] Năm 1957, trường hợp đầu tiên P

falciparum kháng chloroquin (CHQ) phát hiện ở biên giới Colombia và Venezuela, tiếp sau đó

là Thái Lan (Harinasuta, 1961) Theo thống kê của WHO, tình trạng kháng CHQ đã lan rộng khắp thế giới chiếm 75/95 quốc gia kháng thuốc, bên cạnh đó, hiện tượng kháng CHQ gấp 10 lần so với 50 năm trước [16], [20]

Ngoài ra, còn phát hiện thêm rất nhiều trường hợp P falciparum kháng thuốc khác như pyrimethamin, piperaquin (PQ), Fansidar…Đặc biệt hơn nữa là tình trạng P falciparum kháng

lại artemisinin (ART) và dẫn xuất – thuốc có hiệu lực hàng đầu hiện nay Trong đó là hiện tượng kháng với ART xảy ra tại khu vực Đông Nam Á, đáng chú ý là vùng sông Mê Kông với 4 nước: Lào, Campuchia, Thái Lan, Việt Nam [16], [20], [41]

Như vậy, hiện nay KSTSR đã kháng với hầu hết các loại thuốc SR ở rất nhiều nước trên thế giới, đây là trở ngại rất lớn cho công tác phòng chống SR [16] Vấn đề đặt ra hiện nay cho

toàn thế giới là tìm ra thuốc hoặc dẫn xuất có hiệu lực điều trị cao và không bị P falciparum

kháng

1.2.3.2 Tình hình kháng thuốc của Plasmodium ở Việt Nam

Tình trạng P falciparum kháng CHQ lần đầu tiên tại Việt Nam được ghi nhận ở Nha Trang

năm 1961, sau đó lan ra cả Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, miền Nam, như Tây Nguyên (1964), Đồng Hới (1967), Quảng Trị (1973), công trường 7 Quảng Bình (1967), Bình Định (1968), Tây Ninh (1964), Phan Thiết (1974) [11] Hiện nay, xu hướng kháng CHQ đang tăng trở lại, nghiên

cứu tại Quảng Trị năm 1999 cho thấy P falciparum có mức kháng RII với CHQ là 7,1%, tại

Quảng Trực, tỉnh Đăk Lăk tỷ lệ thất bại điều trị (RI, RII và RIII) của phác đồ CHQ là 48% [22], đến năm 2008-2009 tỷ lệ kháng CHQ ở Quảng Trị là 75%, tại Đăknông lên đến 81% [7] Fansidar ra đời năm 1964 và nhanh chóng bị kháng ở Việt Nam với tỷ lệ kháng cao trên 50% RI, RII, RIII (1986 – 1994) [15]

Đặc biệt là đã xuất hiện tình trạng P falciparum kháng lại artemisinin và dẫn xuất Theo

nghiên cứu tại tỉnh Sông Bé và Gia Lai (1996) ART dùng với tổng liều 60 mg/kg trong 5 ngày

thì tỷ lệ tái phát là 16,7%, tại miền trung Tây Nguyên (1996) với liều dùng 1000 mg/kg trong 5 ngày thì tỷ lệ tái phát là 34,5%, kể cả với phác đồ phối hợp ART + mefloquin, ART +

tetracyclin thì tỷ lệ tái phát lần lượt là 6,42%; 14,4% [24], [29] Hiệu lực điều trị artesunat với P

falciparum tuy cao nhưng tỷ lệ thất bại muộn cần cân nhắc: tại Gia Lai (2001 – 2002) với liều

dùng ngày đầu 4 mg/kg, ngày 2-4 giảm xuống 2 mg/kg thì TLTBM là 46,7%; Bình Phước (Đăk Nhau – Bù Đăng) (2009) với tổng liều 16 mg/kg trong 7 ngày thì TLTBM là 14,6% [6], [12].Như vậy việc giám sát sử dụng thuốc và tìm ra hướng dùng thuốc mới là điều quan trọng trong công cuộc chống lại KSTSR kháng thuốc hiện nay

1.3 ĐẶC ĐIỂM ARTEMISININ VÀ DẪN XUẤT

1.3.1 Nguồn gốc, tính chất của artemisinin và dẫn xuất

1.3.1.1 Nguồn gốc, cấu trúc, tính chất của artemisinin

Artemisinin là một hoạt chất chống SR được chiết xuất từ cây Thanh hao hoa vàng với tên

khoa học là Artemisia annua L., họ cúc Arteraceae [21] Năm 1971 được các nhà khoa học

Trung Quốc chiết xuất thành công và đưa vào sử dụng rộng rãi từ năm 1972, ở Việt Nam ART

bắt đầu đưa vào sử dụng điều trị cho khu vực có P falciparum kháng thuốc từ năm 1991 [4].

ART có tinh thể hình kim, không màu, điểm chảy 156 - 157⁰C, công thức phân tử là

C15H22O11, trọng lượng phân tử (TLPT) là 282 và cấu tạo như ở hình 1.1 [3], [21], [31]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của ART [21], [31].

ART là sesquiterpen lacton có cầu nối peroxid nội phân tử và hoạt tính chống SR chủ yếu

dựa vào cầu nối này [21], [31], [38] Trong công thức trên vòng A là dạng cycloxan, vòng B là vòng lacton, còn vòng C và D đều là dị vòng bão hòa trong đó vòng D là một trioxan, dạng liên quan đến hoạt tính chống SR của ART [21]

ART ít tan trong nước và dầu, rất dễ bị thủy phân vòng lacton trong dung môi phân cực [31], [38] Do vậy sinh khả dụng (SKD) và độ bền vững của ART không cao, và đây cũng chính

là hạn chế của ART khi dùng [3]

1.3.1.2 Đặc điểm một số dẫn xuất của artemisinin

Với mục đích tăng cường khả năng hòa tan, tăng hoạt lực chống SR, đầu tiên năm 1976 các nhà khoa học Trung Quốc đã tổng hợp thành công dihydroartemisinin (DHA) bằng cách khử hóa nhóm CO lacton thành OH bán acetal với tác nhân khử hóa là natri borohydric [21] Mặc dù DHA có hoạt lực mạnh hơn gấp 2 lần ART nhưng nó vẫn ít tan trong nước, dầu nên DHA được

sử dụng như là 1 chất trung gian quan trọng để bán tổng hợp các dẫn xuất khác [21]

Thông qua phản ứng ether hóa DHA, đã có các dẫn xuất mới ra đời và được ứng dụng nhiều nhất là artemether (AM) và arteether (AE) TLPT lần lượt là 298 và 312, đặc tính lý hóa tương tự ART, ưu điểm hơn ART là dễ tan trong dầu, dung môi hữu cơ như ethanol, aceton, chloroform [31], [38]

Artesunat (AS) là sản phẩm của phản ứng ester hóa DHA, cải thiện được khả năng tan trong nước của ART, được sử dụng rộng rãi ở các nước Đông Nam Á và Châu Phi để diệt ký

sinh trùng sốt rét P falciparum [14].

Ngoài ra, còn nhiều phương pháp tổng hợp các dẫn xuất của ART từ DHA đang được nghiên cứu hiện nay có khả năng mang lại nhiều hiệu quả cao [21]

1.3.2 Cơ chế tác dụng và nhược điểm chống sốt rét của ART và dẫn xuất

1.3.2.1 Cơ chế tác dụng của Artemisinin và dẫn xuất

Qua nhiều nghiên cứu về cơ chế tác dụng từ khi chiết xuất thành công ART nhưng cơ chế tác dụng của ART và dẫn xuất vẫn còn nhiều tranh cãi Nó có thể là sự phối hợp nhiều cơ chế như tác động lên màng, ức chế tổng hợp protein, gốc tự do hay oxy hoạt động… [21]

Theo kết quả của nhóm “nghiên cứu quinghaosu” Trung Quốc, ART tác động lên màng

của KSTSR là tác dụng chính Đầu tiên là làm biến đổi cấu trúc màng, sau đó tạo ra các không bào tự tiêu, cuối cùng làm tan rã bên trong KST [35]

Theo Gu H.M và cộng sự cho rằng DHA và AM có khả năng ức chế in vitro với tổng hợp protein ở hồng cầu người nhiễm P falciparum, trong đó ức chế tổng hợp acid nucleic xảy ra

chậm hơn tổng hợp protein [20] Do đó có thể thấy tác dụng của thuốc không tập trung vào quá

trình tổng hợp acid nucleic và tác dụng chọn lọc của thuốc đối với hồng cầu bị nhiễm [21].

Theo Meshnick và cộng sự, sắt đóng vai trò quan trọng trong cầu nối peroxide nội và sự tạo thành gốc tự do ART và dẫn xuất sau khi vào máu tương tác với hemozoin (sản phẩm tiêu hóa hemoglobin của KSTSR) sản sinh ra các gốc tự do có carbon trung tâm Các gốc tự do này gây tổn hại tế bào như peroxy hóa lipid, oxy hóa protein, alkyl hóa protein… và giết chết KST Tác dụng này rõ rệt nhất ở thể tư dưỡng của KSTSR Mặc dù tác dụng diệt KST của ART bắt đầu sau khi tiếp xúc chậm (4-5 giờ) hơn với CHQ nhưng tác dụng ức chế đạt tối đa rất nhanh

đặc biệt với P falciparum kháng CHQ (do có hemozoin) [21], [30], [32], [33], [38]

1.3.2.2 Nhược điểm của artemisinin và dẫn xuất

ART và các dẫn xuất có tác dụng nổi bật là cắt sốt nhanh, sạch thể vô tính của KSTSR nhanh và kể cả thể giao bào [4], [20] Nồng độ IC50 của ART từ 10-8 – 10-7 mol/L (3 – 30 μg/L), nồng độ thấp nhất ức chế là 3 x 10-8 mol/L Hoạt tính của DHA cao hơn ART từ 4 – 5 lần (IC50

từ 0,36 – 7 nmol/L), dẫn xuất khác của ART đều có hoạt tính cao hơn ART như AS cao hơn 4 –

5 lần, AM và AE hơn khoảng 2 lần [38] Đặc biệt ART và dẫn xuất có hiệu quả tốt trên KSTSR kháng thuốc hoặc đa kháng thuốc [4], [38]

Nhưng do đặc điểm cấu tạo đặc biệt của ART và dẫn xuất như khả năng tan trong nước và trong dầu kém, độ nhờn của thuốc cao, có chứa liên kết 10-hemiacetal dễ bị chuyển hóa thành DHA dưới sự oxy hóa bởi men P-450 trong gan nên SKD của thuốc giảm và thuốc hấp thu chậm [26], [37] Ảnh hưởng của chuyển hóa khiến ART và dẫn xuất có thời gian bán thải ngắn, vì vậy sau khi điều trị, bệnh nhân vẫn còn tỷ lệ tái phát lại ký sinh trùng và tỷ lệ tái phát cao hay thấp tùy thuộc vào thời gian dùng thuốc ngắn hay dài (7 ngày tỷ lệ tái phát vẫn còn 10%) [4]

Hình 1.2 Sự biến đổi của dẫn xuất ART trong huyết tương [37].

Ngoài ra, theo nghiên cứu dược lý độc tính trên thần kinh của ART và dẫn xuất trên động vật, hầu hết các dẫn xuất đều có độc tính, nhưng DHA (sản phẩm chuyển hóa của hầu hết các ete) thì ảnh hưởng nặng nề trên thần kinh trung ương [20]

Như vậy, hiện nay hướng nghiên cứu của các dẫn xuất ART với mục đích khắc phục nhược điểm của ART được phát triển theo 2 hướng: hướng thứ nhất là tạo ra các dẫn xuất mới đi từ ART và DHA, hướng thứ 2 là phối hợp 1 dẫn xuất của ART với 1 thuốc SR khác có thời gian bán thải dài hơn [20].

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ 32, 33, 39c, 39d, 39e

1.4.1 Tình hình nghiên cứu, ưu điểm của các dẫn xuất 10 – deoxoartemisinin

Tình hình kháng thuốc ngày càng gia tăng đã đòi hỏi một hướng điều trị hoặc thuốc điều trị mới và việc tổng hợp các dẫn xuất mới của ART đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu, đặc biệt là thay đổi cấu trúc lacton của DHA, tạo ra các dẫn xuất bền hơn và có hoạt tính cao hơn Ví dụ như các dẫn xuất fluoro–artemisinin, 11-aza-artemisinin [13]

Theo các nghiên cứu gần đây cho thấy các dẫn xuất non-acetal của ART, gọi là deoxoartemisinin có độ bền vững 15-22 lần hơn các dẫn xuất acetal trong điều kiện mô phỏng của dạ dày [27] Bên cạnh đó dẫn xuất mới 10-deoxoartemisinin với dị vòng, amin và nhóm thân

10-nước đã thể hiện hoạt tính chống sốt rét in vitro cao hơn 10 – 25 lần so với ART [36].

Điều này cho thấy những hợp chất có bộ khung cơ bản của ART nhưng không chứa nhóm chức lacton, acetal mà thay vào đó là các dẫn xuất chứa liên kết 10-C-C, chứa nitơ có khả năng tan tốt trong nước và trong dầu, tiện lợi cho việc sử dụng nhờ khả năng tạo muối tan với acid nhờ tính bazơ của nitơ đang là hướng đi mới và đúng đắn trong việc phòng chống sốt rét [37]

1.4.2 Cấu trúc, tính chất của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e

Theo hướng nghiên cứu trên Viện Hóa học đã nghiên cứu tổng hợp thành công 5 dẫn xuất

từ DHA và sản phẩm trung gian 10β-allyldeoxoartemisinin

1.4.2.1 Nghiên cứu tổng hợp [(2’-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32) và [(2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (33)

10-Qui trình tổng hợp đi từ DHA (9) qua 4 bước phản ứng (tạo 34, 35, 36) thu được các chất

32, 33 theo hình 1.3 [27], [36], [37].

Hình 1.3 Qui trình tổng hợp các chất 32 và 33 [27], [36], [37].

Chất phản ứng và điều kiện phản ứng :

 Benzoyl chloride, pyridin, CH 2 Cl 2 , nhiệt độ phòng, 16h, 97%.

 Allyltrimethylsilane, ZnCl 2 , ray phân tử, 1,2-dicloetan, 0⁰C, 1h, 90%.

 m-CPBA, nhiệt độ phòng, 24h, CH 2 Cl 2 , 85%.

 Imidazol, C 2 H 5 OH/H 2 O, nhiệt độ phòng, 20h.

1.4.2.2 Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất amid 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide (39c), 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide (39d), 10- (deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide (39e) [37]

Từ hợp chất 35 được điều chế từ DHA ở trên qua 2 bước để tạo thành các dẫn xuất amid theo hình 1.4 [37].

Hình 1.4 Qui trình tổng hợp các dẫn xuất amid của ART (39a-e) [37].

Sau khi tổng hợp 5 dẫn xuất đều được đánh giá kết quả thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR để xác định lại cấu trúc hợp chất [37]

Vậy, tất cả dẫn xuất 32, 33, 39 (c, d, e) của ART là những hợp chất lần đầu tiên được nghiên cứu và điều chế ở Việt Nam đã thỏa mãn các yêu cầu về tổng hợp và hóa học Về mặt qui trình tổng hợp, đảm bảo tính ổn định, các bước dễ thực hiện (nhiệt độ phòng, thời gian vừa phải, hóa chất phổ biến), hiệu suất phản ứng cao và rất cao (85-97%) Về mặt hóa học các hợp chất trên vừa có độ bền cao (liên kết 10-C-C) và khả năng tan tốt (tạo muối tan nhờ nitơ) [37]

1.4.2.3 Tính chất của 5 dẫn xuất

Cả 5 dẫn xuất đều tan tốt trong nước và trong dầu hơn ART như Dimethyl sulfoxide (DMSO), đặc biệt các dẫn xuất 32, 33 tan tốt trong C2H5OH, còn các dẫn xuất 39c, 39d, 39e thì tan tốt trong CH2Cl2 [37] Độ bền hóa học cao, bền vững hơn trong môi trường pH acid dạ dày [27]

Một số chỉ số cơ bản về đặc tính lý, hóa cơ bản của 5 dẫn xuất được nêu chi tiết ở bảng 1.1 sau: