Định danh vi khuẩn bacillus sp bằng chỉ thị ADN

MỤC ỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH .... DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A,T,G,C Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin ADN Acid deoxyribonucleic BLAST Basic Local Alignment Searc

H IỀU NH

Đ NH D NH VI HU N

BACILLUS SP ẰNG CHỈ TH DN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

Nơi thực hiện: 1

2

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

tr :

-

-

:

TS Phùng Thanh Hương Ths Hà Thị Thu

Xin c ị i Phòng Vi sinh phân t -Vi n Công ngh sinh h c - Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t lòng giúp c hi tài t t nghi p Cu i cùng xin c ổ

trong su t quá trình h c t p t i gian th c hi n khóa lu n

i h g

Sinh viên

i h

MỤC ỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1

: 3

1.1 ổ Bacillus 3

1.1.1 3

1.1.2 3

1.1.3 4

1.1.4 5

1.2 ị 9

1.2.1 9

1.2.2 ( ) 13

2 ỐI ƯỢ À ƯƠ Á IÊ ỨU 17

2.1 ng, nguyên li u nghiên c u 17

2.1.1 ng nghiên c u 17

2.1.2 Hóa ch t, sinh ph m 17

2.1.3 Trang thi t bị 18

2.2 u 19

2.2.1 pháp tách chi t ADN tổng s 20

2.2.2 i ADN bằng PCR 22

2.2.3 n di ADN trên gel agarose 23

2.2.4 23

2.2.5 n n p ADN plasmid vào t bào kh bi n E.coli ch O 0F’ 25

2.2.6 t ADN plasmid từ vi khu n 26

2.2.7 t ADN bằng enzym gi i h n 27

2.2.8 ch ADN plasmid 28

2.2.9 i trình t ADN 28

2.2.10 ADN 30

3 ỰC NGHI M VÀ KẾT QUẢ 31

3.1 K t qu 2 16S rADN amyE 31

3.1.1 tách chi t ADN tổng s từ t bào ch ng vi khu n nghiên c u 31

3.1.2 K t qu 16S rADN 31

3.1.3 amyE 35

3.2 So sánh trình t 16S rADN, amyE ịnh danh ch ng vi khu n nghiên c u 38

4 À L ẬN 39

4.1 ịnh trình t 16S rADN amyE c

39

4.2 o sánh trình t ịnh danh ch ng vi khu n nghiên c u 40

KẾT LUẬN 43

43

ÀI LI ẢO

Ụ LỤ

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

A,T,G,C Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin

ADN Acid deoxyribonucleic

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

dNTP Deoxyribonucleotid triphosphat

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylen Diamin Tetra acetic Acid

IPTG I β-D-1- thiogalactopyranosid

MALDI-TOF matrix assisted laser desorption ionisation-time of flight

PCR Polymerase Chain Reaction

rADN ADN mã hóa cho ARN ribosom

SDS Sodium Dodecyl Sulphat

TAE Tris - Acetic acid – EDTA

Taq Thermus aquaticus

X-gal 5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid

Bacillus, Pediococcus, Enterococcus

s [5] hi u loài Bacillus i hóa trong các ch ph m th c ph m ch ă B clausii, B subtillis,…

ổ ừ Lactobacillus,

Bifidobacterium Tuy nhiên, chi Bacillus m nhi u ch ng có th gây

b B cereus T i Vi t Nam, hàng lo t ch ph m probiotics ch a thành ph n chính là Bacillus c tiêu th khá

m nh Tuy nhiên, m t v quan tr ng n hi u qu an toàn c a các ch ph m này là vi khu i loài công b trên nhãn hay không? M t u ch ph Vi t Nam không chỉ có thành ph i thành ph n ghi trên nhãn mà còn

ch a vi khu n có kh ă Biosubtyl (Công ty Biophar

L t), B

cereus B subtilis [16,23] Do v y,

ịnh danh chính xác vi khu n probiotics Hi n nay, các công

c ịnh danh truy n th ịnh danh d a trên hình thái vi khu n, khu n l c t

2 S d ng các trình t gen trên làm chỉ thị ịnh danh ch ng vi khu n nghiên c u

Chương : T NG QU N

1.1 T ng an ề i h n Bacillus

1.1.1 h i niệ

Chi Bacillus n hình que, sinh bào t [27,29,32] thu

F - vi khu n G [29]

[27] 1.1.2 Đ c t nh 1.1.2.1

Chi Bacillus là m t phân b r ng rãi nh t trong t ng phân l p từ c [27,35]

ị ễ ừ

[27]

1.1.2.2

Bacillus [27]

ỉ

[27,32] ă ị :

c x , s khô h n và ch t kh trùng [27,32]

B anthracis

sinh bào t [32] 1.1.2.3

Ph n l n các loài trong chi Bacillus có th phát tri

ng hay th ch máu [27]

a các loài [27]

H nh Bacillus subtilis

[21]

H nh Bacillus cereus

[21]

1.1.2.4

Bacillus : ừ

ị [27]

Bacillus ă [27]

1.1.3 Ph n nh  3 :

- : n sinh bào t

ng b c bào t : B anthracis, B cereus, B megaterium, B mycoides, B thuringiensis, B pumilus, B subtilis, B licheniformis - 2: ổ i các bào t hình elip

: B alvei, B circulan, B macerans, B polymyxa - 3: ổ

B sphaericus [15]  Bacillus

6 :

- : ỳ u lo

yêu c ă

B polymyxa - 2: ng loài ti t ra nhi u carbohydrase ngo

amylase, glucanase (

: B subtilis : B amyloliquefaciens, B licheniformis và

B pumilus Nh

u h t các vi khu u

ch ng có kh ă ng và phát tri n t

glucose và t ch t nh n t cu i cùng M t s B

anthracis, B cereus, B licheniformis và B thuringiensis, vi khu n k khí tuỳ

t ra nhi u enzym ngo i bào bao g m nhi i quan tr β-glucanase và protease

- 3: Brevibacillus brevis - m

ừ các lo bao

g m B.badius và B freudenreichii

- 4: : B sphaericus : B insolitus, B psychrophilus và m t s loài khác T t c u khí

, phân bi t v i t t c các tr c khu các axit meso-diaminopimelic trong peptidoglycan c a vách t ằ c

c bi t, B sphaericus không s d ng cho s ă

ă ừ histidin và glutamat

s n xu t m t lo t các s n ph c kháng

sinh và thu c trừ … Bacillus

ỉ

1.1.4.1

Bacillus ừ ừ 000 ă Bacillus subtilis (natto)

ă ừ

ă là m t enzym tiêu s i huy t m nh c kh ă các b nh tim m ch [28] Bacillus

: ă ỳ ă B subtilis B licheniformis [40] Bacillus :

ă ă

Bacillus ng 50% tổ ị ị ng enzym [40] Các protease serin ki c s n xu t b Bacillus

ng d t t y r [40]

Bacillus ng d ng trong m t s

c ph m, lên men, d t may, và các ngành công nghi p gi y [40] ừ Bacillus

trong : ansucrase ừ B circulans, ừ B subtilis, ừ B subtilis, B coagulans B circulans, …[40] 1.1.4.2

Bacillus

Bacillus thuringiensi

ừ [19,27] B thuringiensis

t bào c a vi khu n [21,27] Bacillus subtilis 168 [27]

Bacillus n m t lo t các

b nh nhiễm trùng bao g m c các ổ áp xe, nhiễm khu n huy t, nhiễm trùng v t

ng, nhiễm trùng tai, viêm n i tâm m ễ

c và hô h p và nhiễ ng ti t ni

L n các lo i nhiễm trùng là B cereus, ti B

licheniformis và B subtilis L c p, các loài Bacillus có th làm tr m

tr ễ ằng cách s c t y mô

ho c ch t chuy ă ị [32]

b) g h h g i h

Bacillus u c

bào t o ra b i Bacillus d ng trong u trị là bacitracin B licheniformis, gramycidin S tyrotricidin

B brevis, polymyxin B polymixa B circulans [4,40,46] Riêng Bacillus subtilis n xu : subtilin, bacilysin, subsporins A-C, và rhizocticins A-D [40] enzym penicillinamidase do B megatherium sinh ra

6- ổ β-lactamase [4] c) i i i s ị

v t s ng có l i cho s c kh e v t ch ừ [45]

ă ừ

[16]

ă

Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus ổ

Bacillus, Pediococcus, Enterococcus

s [5] ỉ Bacillus sp ă

Bacillus có nhi m so v i các loài không có kh ă

t c chi Lactobacillus: - S n ph ng bào t có th c b o qu n nhi phòng u ki n khô mà

- Bào t có th s ng sót khi di chuy a dịch vị

d dày, trong khi ph n l Lactobacillus bị tiêu di t

trong t

[12]

Các vi sinh v t thu c chi Bacillus c s d ng làm probiotics từ ít nh t 50 ă hà khoa h ỉ c s n probiotics thu c chi Bacillus 5 ă c nghiên c u r ng rãi nh t là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis [12] Trong chi Bacillus, Bacillus subtilis

ỉ ằ

Bacillus subtilis Bacillus Bacillus pumilus và Bacillus cereus [16,23,24]

B.cereus

ễ [16]

ừ ị

probiotics 1.2 C c c ng cụ ịnh danh i h n ị

ng t

sinh - kh ă ị c có th

u gen, chẳng h t trình t c bi t [25] ị

ừ [26]

1.2.1 Phương h t ền th ng dựa i h nh

ị n th i gian, và r chu n hóa và gi i thích [7] Tuy nhiên, các xét nghi m truy trị ị [7]

1.2.1.1

a) h

ị ị

m G 850- 938 ằ i vi khu n d a trên c t c a thành t bào c [42]

Vách t bào c a vi khu t l ;

t l t l c g

c màng trong [8] Nh ă phân lo i vi khu n d a vào màu s l i b i các t Gram Vi khu n b – iodin s có màu tím khi quan

i kính hi n vi quang h c x p vào nhóm vi khu

nh ng dòng vi khu n khác không gi c m - ằ

t m f c x p vào nhóm vi khu n gram âm [8]

Nhu

ị

b) h h g i h

ị

ị

c coi là m t tiêu chu ịnh danh vi khu n,

tuy nhiên có r t nhi t tên theo hình d ng (ví d Bacillus,

Streptococcus, Staphylococcus) và nó là m m quan tr nh n d

: …

ă ị [8]

Ư :

-

:

-

-

c) h h h i h

ễ ằ

:

- Hình d : u ho ễ

- ng kính c : , vừa, l n - ừ a m : …

- m t: mị n sóng, thô, d ng h t, có gai thịt nh ho c sáng l …

- : …

- : c, m ho c trong su t - M ă :

- : ễ … [42]

:

- ễ

- [41]

:

-

- ổ

-

-

1.2.1.2

ị

ị

m hóa sinh ị :

1) IMViC 2)

3)

4) Test urease 5) Lên men các carbohydrat 6) t 7)

8)

9) Test oxidase 10) Kh o nghi [22]

ị ị

: I

(bioMerieux SA, La Balme-les-Grottes, France), BBL F

…[7]

Ư :

- ễ [7]

-

:

- ị

[7]

- ă

1.2.2 Phương h hiện i (dựa i gen)

ị ễ

: cid béo, phân tích trình t gen 16S rADN L I- OF IOLO ị i các công c d

truy v d li u có n nh ng công c nh n d ng và trình t gen ịnh danh vi khu n [42] rARN 6 ị 30

[3] Gen mã hóa rARN 16S (g i tên là gen 16S rADN) thu c ADN ribosom (Hình 1.3) H nh 1.3 C 16S

Vi c phát minh ra

16S rADN c a vi khu 18S rADN c a

sinh v t nhân chu n ễ ừ m ng d li

:

- ị [44]

- ị 44

ị thu [36,37,44] [36,37]

- ị

ổ ă [33]

M ng m i trong các nghiên c u phân lo i vi sinh v c quan tâm nh ă d ng chỉ thị phân t g m m t lo t gen mã hóa protein thay th ị A, B c a enzym

ARN polymerase (rpoA, rpoB), gen mã hóa ti ị A, B c a enzym gyrase

(gyrA, gyrB), gen mã hóa cho m t s [13]

16S rADN o th di truy 16S rADN

ị

ổ 16S [30],

ị

ằ

ị u qu ng h 6 phân bi c các loài g

Bacillus globisporus Bacillus psychrophilus [30] chi Mycobacterium [38]

Bacillus ị phân -4 gly amyE -

ỉ ị ị Bacillus

ị

ằ ị

Chương ĐỐI TƯỢNG V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đ i tượng, nguyên liệu nghiên cứu

 Dung dịch tách plasmid:

- Sol I: Tris HCL, pH 8:25mM, EDTA, pH 8: 10mM, glucose: 50mM

- Sol II: NaOH: 0,2M, SDS: 1%

- III: m acetat kali 3M, pH 5,5

- Dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1)

- Dung dịch TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM EDTA)

- m tra m u ADN 5X: Tris-HCl 1M pH 8,0: 1mL EDTA 0,5 M pH 8,0: 0,2mL, glycerol: 2mL, xanh bromophenol 1%: 2mL

 B kit chi t tách ADN Pure Link Genomic DNA Mini Kit c a hãng Invitrogen

 tách dòng gen, s d ng b kit TA cloning kit (Invitrogen) Trong b kit này

g m các thành ph : 2 u dính T), enzym

m ligase 10X, t bào E.coli ch O 0F’

 B kit tinh s ch vector tái tổ h p ph c v cho m i trình t gen (Fermentas)

2.1.3 T ang thiết bị

ịnh trình t ADN t ng ABI 3100 Sequencer (Applied Biosystems, M ị ® Terminater v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems), máy ly tâm l nh (Microcentrifuge – Sorvall,

M ), m n di ADN (Mupid, Nh t B n), máy soi ch p nh gel (Bio – Rad), máy PCR (MJ Research, M ), máy ổn nhi c (Memmert), máy quang phổ huỳnh quang (Nanodrop 3300, M n t , lò vi sóng

(Samsung), t l nh 40C, t l nh sâu -200C (Sanyo, Nh t B n), t l nh sâu -800C, t

m CO2 (INNOVA CO-170), t c y sinh h c an toàn c p II, máy li tâm (Universal 320R)

2.2 Phương h nghiên cứu

Nghiên c c ti sau 16S rADN

amyE:

Hình 2.1 n i dung nghiên c u 2.2.1 Phương h t ch chiết ADN t ng s

Gi i trình t gen

Bi n n p ADN

plasmid vào E.coli

C t plasmid bằng enzym EcoRI

Tách chi t ADN plasmid

G plasmid pCR 2.1

n di agarose

n di agarose

So sánh trình t gen ị

n di agarose

Quy trình tách chi t ADN s d ng b kit chi t tách ADN PureLink Genomic DNA Mini Kit c a hãng Invitrogen g c sau:

-

- 4o -20o

2.2.2 Phương h h ếch i ADN bằng PCR

 Nguyên tắc: DN ị n

gen có trình t ị c khu i từ m t khuôn ADN d a trên s c

hi u c a c p m i và ADN khuôn theo nguyên t c bổ sung và ph n ng kéo dài chu i K t qu là t o thành m t s ng l n b n sao ADN sau m t s chu kì nhi t trong th i gian ng n