Định danh vi khuẩn bacillus sp bằng chỉ thị ADN

B Y T I HC HÀ NI    BACILLUS KHÓA LUN TT NGHI HÀ NI - 2015 B Y T I HC HÀ NI  N BACILLUS KHÓA LUN TT NGHI     1.   2.    HÀ NI - 2015 LI C   tr -  -    Ths. Hà Th Thu   Xin c i Phòng Vi sinh phân t -Vin Công ngh sinh hc - Vin Hàn lâm Khoa hc và Công ngh Vit lòng giúp c hi tài tt nghip. Cui cùng xin c trong sut quá trình hc tp ti gian thc hin khóa lun.   Sinh viên   DANH MC T VIT TT DANH MC BNG DANH MC HÌNH NH  1  3 1.1. Bacillus 3 1.1.1.  3 1.1.2.  3 1.1.3.  4 1.1.4.  5 1.2.  9 1.2.1.  9 1.2.2. () 13 U 17 2.1. ng, nguyên liu nghiên cu 17 2.1.1. ng nghiên cu 17 2.1.2. Hóa cht, sinh phm 17 2.1.3. Trang thit b 18 2.2. u 19 2.2.1.  pháp tách chit ADN tng s 20 2.2.2. i ADN bng PCR 22 2.2.3. n di ADN trên gel agarose 23 2.2.4.  23 2.2.5.   n np ADN plasmid vào t bào kh bin E.coli ch. 25 2.2.6. t ADN plasmid t vi khun 26 2.2.7. t ADN bng enzym gii hn 27 2.2.8. ch ADN plasmid 28 2.2.9. i trình t ADN 28 2.2.10.  ADN 30 C NGHIM VÀ KT QU 31 3.1. Kt qu 16S rADNamyE 31 3.1.1. tách chit ADN tng s t t bào chng vi khun nghiên cu 31 3.1.2. Kt qu16S rADN 31 3.1.3. amyE 35 3.2. So sánh trình t 16S rADN, amyE nh danh chng vi khun nghiên cu 38 N 39 4.1.     nh trình t 16S rADN   amyE c     39 4.2. o sánh trình t nh danh chng vi khun nghiên cu 40 KT LUN 43  43   DANH MC T VIT TT A,T,G,C Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin ADN Acid deoxyribonucleic BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair dNTP Deoxyribonucleotid triphosphat E.coli Escherichia coli EDTA Ethylen Diamin Tetra acetic Acid EtBr Ethidium Bromid IPTG -D-1- thiogalactopyranosid LB Luria-Bertani MALDI-TOF matrix assisted laser desorption ionisation-time of flight OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction rADN ADN mã hóa cho ARN ribosom SDS Sodium Dodecyl Sulphat sp. Species TAE Tris - Acetic acid  EDTA Taq Thermus aquaticus X-gal 5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl--D-Galactosid DANH MC BNG Bng 2.1.16S rADN 17 Bng 2.2. Cp mi dùng trong phn amyE 17 Bng 2.3. Thành phn phn ng PCR 22 Bng 2.4. Chu trình nhit ca phn ng P16S rADN 22 Bng 2.5.amyE 23 Bng 2.6. Thành phn phn ng to vertor tái t hp 24 Bng 2.7. Thành phn phn ng ct plasmid 27 Bng 2.8. Thành phn phn ng gii trình t gen 29 Bng 2.9. Chu trình nhit phn c trình t 29 DANH MC HÌNH NH Bacillus subtilis 4 2Bacillus cereus 4  13 Hình 2.1. 20 Hình 2.2. 24 Hình 3.1. Kt qu tách chit ADN tng s 31 Hình 3.2. Kt qu16S rADN 32 Hình 3.3. Kt qu n di plasmid tách t các khun l gen 16S rADN 33 Hình 3.4. Kt qu ct kim tra plasmid bng enzym gii h  16S rADN 33 Hình 3.5. Kt quamyE 35 Hình 3.6. Kt qu n di plasmid tách t các khun l gen amyE 36 Hình 3.7. Kt qu ct kim tra plasmid bng enzym gii h   amyE 37 1  c s dng các ch phm cha vi khu u tr các ri long min d nên ph bin trên th gii.          Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus Bacillus, Pediococcus, Enterococcus s [5]hiu loài Bacillus i hóa trong các ch phm thc phm chB. clausii, B. subtillis,                 Lactobacillus, Bifidobacterium. Tuy nhiên, chi Bacillus   m nhiu chng có th gây b B. cereus. Ti Vit Nam, hàng lot ch phm probiotics cha thành phn chính là  Bacillus c tiêu th khá mnh. Tuy nhiên, mt v quan trng n hiu qu  an toàn ca các ch phm này là vi khui loài công b trên nhãn hay không? Mt      u ch ph     Vit Nam không ch có thành ph i thành phn ghi trên nhãn mà còn cha vi khun có kh Biosubtyl (Công ty Biophar t),             B. cereus B. subtilis[16,23]. Do vy,  nh danh chính xác vi khun probiotics. Hin nay, các công c nh danh truyn thnh danh da trên hình thái vi khun, khun lc t ra không thc s hiu qu trong vin m c bit i vi chi Bacillus gm nhii ging nhau. Bacillus sp.   1. nh trình t nucleotid ca 2 gen 16S rADN và amyE ca chng vi khun nghiên cu. 2 2. S dng các trình t gen trên làm ch th  nh danh chng vi khun nghiên cu. [...]... Bacillus n probiotics thu c c nghiên c u r ng rãi nh t là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis [12] Trong chi Bacillus, Bacillus subtilis ỉ Bacillus subtilis ằ Bacillus Bacillus pumilus và Bacillus cereus [16,23,24] B.cereus ễ [16] ừ ị probiotics 1.2 C c c ng cụ ịnh danh i h n ị ng t sinh - kh ă ị u gen, chẳng h t trình t c bi t [25] ị ừ 1.2.1... B coagulans B circulans, …[40] 1.1.4.2 Bacillus Bacillus thuringiensi ừ [19,27] B thuringiensis ừ B 7 ổ ă [19] 1.1.4.3 Trong chi Bacillus, Bacillus subtilis nhân ỳ khác bi t bào c a vi khu n [21,27] Bacillus subtilis 168 [27] 1.1.4.4 Bacillus ă ă Bacillus [32] c bi B subtilis c ph m a lên men truy n th i các vi sinh v t khác trong …[6] 1.1.4.5 a) ch c h g h Bacillus, do ă B.anthracis gây ra ă ừ ị... t bào c i vi khu n d a trên c tc a [42] Vách t bào c a vi khu tl ; tl tl cg ă c màng trong [8] Nh phân lo i vi khu n d a vào màu s l i b i các t – iodin s có màu tím khi quan Gram Vi khu n b i kính hi n vi quang h c x p vào nhóm vi khu nh ng dòng vi khu n khác không gi f tm cm ằ - c x p vào nhóm vi khu n gram âm [8] Nhu ị b) h h g i h ị ị c coi là m t tiêu chu tuy nhiên có r t nhi ịnh danh vi khu n,... gen) ễ : tích trình t gen 16S rADN L I- OF IOLO i các công c truy v d li u có cid béo, phân ị d n nh ng công c nh n d ng và trình t gen ịnh danh vi khu n [42] rARN 6 ị 30 [3] Gen mã hóa rARN 16S (g i tên là gen 16S rADN) thu c ADN ribosom (Hình 1.3) H nh 1.3 C 16S 14 Vi c phát minh ra 16S rADN c a vi khu ễ sinh v t nhân chu n 18S rADN c a ừ m ng d li t s ng [44] Gen 16S rADN ị - : ổ 16S rARN ă ị ổ [9,31]... ch [9] ị Gen 16S rADN ị [17] M ng m i trong các nghiên c u phân lo i vi sinh v ă quan tâm nh c d ng chỉ thị phân t g m m t lo t gen mã hóa ị A, B c a enzym protein thay th ARN polymerase (rpoA, rpoB), gen mã hóa ti ị A, B c a enzym gyrase (gyrA, gyrB), gen mã hóa cho m t s 16S rADN [13] o th di truy 16S rADN ị ổ 16S [30], ị 16 ằ ị u qu phân bi 6 ng h c các loài g Bacillus globisporus Bacillus psychrophilus... 1.1.4.1 ừ Bacillus 000 ă Bacillus subtilis (natto) ă ừ ă kh ừ ă là m t enzym tiêu s i huy t m nh c các b nh tim m ch [28] Bacillus : ă ỳ ă B subtilis B licheniformis [40] : Bacillus ă ă Bacillus ị ng 50% tổ Các protease serin ki ị ng enzym [40] c s n xu t b ng d tt yr Bacillus Bacillus [40] ng d ng trong m t s c ph m, lên men, d t may, và các ngành công nghi p gi y [40] ừ trong subtilis, : Bacillus. .. ổ [9,31] gen 16S [31] - Gen 16S rADN b o t n ng 1550 bp và bao g m c vùng bi ổ l s ng di truy n [9,31] - ịnh cho m t s Trình t gen 16S rADN ng l n các ch ng 20 GenBank 90000 trình t nhi u trình t u 16S rADN so sánh v i trình t c - ị t [9] rADN [44] - Gen 16S rADN [9,31] 16S rADN ị 16S rADN ằ [42] : - ị [44] 15 ị - 44 ị thu [36,37,44] [36,37] ị ổ ă [33] ị ằ 16S : rADN ổ ị - … Ch ng c d li - i là t... nhi t - Bacillus sp ă m so v i các loài không có kh ă c chi Lactobacillus: S n ph u ki n khô mà ng bào t có th c b o qu n nhi phòng 9 - Bào t có th s ng sót khi di chuy d dày, trong khi ph n l a dịch vị Lactobacillus bị tiêu di t trong t [12] Các vi sinh v t thu c chi Bacillus ă c s d ng làm probiotics từ ít nh t 50 ỉ hà khoa h cs 5 ă chi Bacillus n probiotics thu c c nghiên c u r ng rãi nh t là Bacillus. .. Mycobacterium [38] ị Bacillus phân -4 gly amyE ỉ ị ị Bacillus ị ằ ị - 17 Chƣơng 2.1 ĐỐI TƢỢNG V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đ i tƣợng, nguyên liệu nghiên cứu 2.1.1 Đ i tƣợng nghiên cứu Ch ng Bacillus sp ă b bằng hình thái b ct ị c phân l p từ , Vi n Vi sinh và công ngh sinh h ng i h c qu c gia Hà n i 2.1.2 Hóa chất, sinh ph m M i dùng cho ph n ng PCR ảng 2.1 C p m i dùng trong ph n Tên mồi Trình tự mồi 1 6SP1 (R) 5’-AGAGTTTGATCCTGGC-3’... c ti sau 16S rADN 20 M u nghiên c u Tách chi t ADN tổng s ADN tổng s Khu i gen Gen n di agarose G plasmid pCR 2.1 Bi n n p ADN Ch n dòng mang plasmid vào E.coli plasmid pCR2.1 tiêu Tách chi t ADN plasmid C t plasmid bằng enzym EcoRI Tinh s ch ADN plasmid n di agarose n di agarose n di agarose Gi i trình t gen So sánh trình t gen ị Hình 2.1 2.2.1 Phƣơng h n i dung nghiên c u t ch chiết ADN t ng s 21 . c nghiên cu rng rãi nht là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis [12]. Trong chi Bacillus, Bacillus subtilis   .  nh danh chính xác vi khun probiotics. Hin nay, các công c nh danh truyn thnh danh da trên hình thái vi khun, khun lc t ra không thc s hiu qu trong vi n.  Sinh vi n   DANH MC T VI T TT DANH MC BNG DANH MC HÌNH NH  1  3 1.1.  Bacillus 3 1.1.1.