Chủng P. falciparum kháng CHQ (K1) được nuôi liên tục trong labô theo phương pháp bình nến của Trager và Jensen, thực hiện trên nguyên tắc vô trùng trong thu thập mẫu và nuôi cấy.
Các bước tiến hành Bước 1: Chuẩn bị
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy đầy đủ (RPHS): Từ môi trường RPMI 1640 (RP) thêm NaHCO3 5% (42μl/ml), huyết thanh người nồng độ 10%. Bảo quản ở 4 C trong vòng 1 tuần. Chuẩn bị huyết thanh: Máu không chống đông cho vào chai hoặc lọ thủy tinh, để lọ nằm
nghiêng ở nhiệt độ phòng 1 – 2 giờ sau đó để tủ lạnh 4 C qua đêm, dùng pipet hút nhẹ nổi ở trên chia vào lọ nhỏ theo yêu cầu công việc nếu có lẫn HC thì li tâm, bất hoạt huyết thanh ở 56 C trong 30 phút, để nguội bảo quản ở tủ lạnh đá trong 30 ngày.
Chuẩn bị HC lành: Máu tĩnh mạch có chứa chất chống đông sau khi li tâm 2 lần, hút bỏ phần huyết thanh ở trên, thêm môi trường RP theo tỉ lệ 5:1, li tâm 2000 vòng/ 5 phút, hút bỏ phần nổi, rửa 2 lần với môi trường RP và rửa lần 3 với môi trường đầy đủ huyết thanh 10% (RPHS). Trộn cặn hồng cầu với môi trường RPHS để có dịch treo 40% (4:6). Chia nhỏ vào lọ, bảo quản ở 4 C trong 30 ngày.
Chuẩn bị HC nhiễm: Dùng panh kẹp lấy mẫu chứa 500μl máu có chủng P. falciparum K1 cần nuôi cấy trong bình nitơ lỏng, tan đông bằng tủ ấm trong 5 phút. Cho máu vào tube li tâm, thêm đồng lượng sorbitol 27% (500l), li tâm 2000 vòng/5 phút. Hút phần trong ở trên, trộn đều với 1000μl sorbitol 5%, li tâm 2000 vòng/5 phút (2 lần). Hút hết phần nổi ở trên,
thêm 5ml RPHS, li tâm 2000 vòng/5 phút (làm 3 lần). Hút bỏ phần nổi, thêm môi trường RPHS với 20% huyết thanh (2ml môi trường + 200μl HC lành) trộn đều, cho ra đĩa nuôi.
Bước 2: Nuôi chủng
Cho đĩa nuôi vào bình nuôi, đốt nến đợi khi nến gần tắt, khóa vòi của bình nuôi để tạo nồng độ khí: 5% CO2, 5% O2 và 90% N2.
Đặt bình nuôi vào tủ ấm 37 0,5 C.
Bước 3: Thay môi trường và lấy lam máu theo dõi hàng ngày
Pha môi trường RPHS và đặt vào tủ ấm ít nhất 30 phút trước khi thay môi trường hàng ngày. Lấy bình nuôi ra khỏi tủ ấm, mở khóa, lấy giếng hoặc đĩa để lên bàn inox.
Nhẹ nhàng nghiêng đĩa nuôi tránh xáo trộn HC và môi trường, dùng pipet Pasteur vô trùng hút bỏ phần môi trường phía trên (tránh hút HC).
Dùng pipet vô trùng lấy khoảng 2μl làm tiêu bản lam giọt đàn.
Sau đó, cho môi trường mới vào, lắc nhẹ để trộn đều, cho vào bình nuôi, đốt nến, khóa vòi và đặt vào tủ ấm.
Khi lam khô, cố định bằng cồn methanol tuyệt đối, nhuộm Giemsa với dung dịch pH=7,2. Để lam khô tự nhiên hoặc dùng máy sấy.
Bước 4: Soi lam và tính mật độ ký nhiễm sinh trùng
Soi lam dưới kính hiển vi vật kính dầu 100.
Đếm HC nhiễm KST thể vô tính theo 10000 HC (khoảng 30 vi trường). Tỷ lệ HC bị nhiễm KST = x100 (%)
Bước 5: Cấy chuyển
Chuẩn bị HC lành : Tính toán số lượng HC lành cần dùng để thay, pha loãng HC lành với môi trường RPHS thành dịch treo 4% (pha loãng dịch treo 40% với môi trường RPHS 10 lần )
Hạ mật độ KST nhiễm xuống còn 0,5% bằng cách trộn HC và đưa vào nuôi cấy, 3 ngày cấy chuyển 1 lần.