Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và bước đầu đánh giá đặc tính sinh học của Interleukin11 người tái tổ hợp

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ QUÝ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN,TINH CHẾ VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA INTERLEUKIN-11 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ QUÝ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TINH CHẾ VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA INTERLEUKIN-11 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS TRƯƠNG NAM HẢI Viện Công nghệ sinh học TS LÊ THỊ THU HỒNG Viện Công nghệ sinh học Hà Nội – 2017 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Interleukin-11 vai trò hệ tạo máu 1.1.1 Hệ tạo máu đường tạo tiểu cầu thể người 1.1.2 Đặc tính phân tử, cấu trúc chế hoạt động Interleukin-11 1.1.3 Những nghiên cứu vai trò IL-11 mơ hình thực nghiệm 1.2 Tình hình nghiên cứu biểu interleukin-11 tái tổ hợp 12 1.3 Hệ biểu protein tái tổ hợp 19 1.3.1 Sơ lược hệ biểu protein tái tổ hợp, ưu nhược điểm 19 1.3.2 Một số chủng biểu thông thường E coli 23 1.3.3 Vector biểu chủng E coli 25 1.3.4 Một số giải pháp cải thiện mức độ biểu protein tái tổ hợp 27 1.3.5 Tinh protein khó khăn thường gặp 29 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu nghiên cứu 35 2.1.1 Nguyên liệu 35 2.1.2 Hóa chất vật tư dùng cho nghiên cứu 36 2.1.3 Thiết bị 40 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử vi sinh 40 2.2.2 Các phương pháp hóa sinh miễn dịch 44 2.2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng tăng sinh dòng tế bào IL-11 49 2.2.4 Phương pháp đánh giá tính an tồn IL-11 tái tổ hợp 50 2.2.5 Phân tích, xử lý số liệu 53 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 3.1 Biểu Interleukin-11 tế bào E coli .56 3.1.1 Biểu Interleukin-11 dạng đơn vector pET22b(+) 56 3.1.2 Biểu Interleukin-11 dạng dung hợp vector pE-SUMO3 64 3.1.3 Lựa chọn điều kiện biểu protein SUMO-IL11 67 3.2 Tinh chế tạo sản phẩm Interleukin-11 73 3.2.1 Tinh chế protein SUMO-IL11 sắc ký lực 73 3.2.2 Cắt protein SUMO-IL11 enzyme 79 3.2.3 Tạo công thức cho protein IL-11 80 3.2.4 Loại chất gây sốt sản phẩm IL-11 82 3.2.5 Đông khô sản phẩm IL-11 85 3.3 Bƣớc đầu đánh giá đặc tính sinh học protein IL-11 tái tổ hợp 87 3.3.1 Đánh giá độ tinh protein IL-11 87 3.3.2 Đọc trình tự axit amin đầu N protein IL-11 88 3.3.3 Đánh giá tác dụng tăng sinh dòng tế bào TF-1 89 3.3.4 Đánh giá tính an tồn chung chuột 90 3.3.5 Đánh giá độc tính cấp chuột nhắt trắng 91 3.3.6 Đánh giá độc tính bán trường diễn chuột cống 92 3.3.7 Đánh giá chất gây sốt thỏ 99 CHƢƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 100 4.1 Biểu Interleukin-11 ngƣời tái tổ hợp 100 4.2 Tinh chế protein IL-11 tái tổ hợp 104 4.3 Tạo sản phẩm IL-11 có khả sử dụng đƣờng tiêm 108 4.4 Bƣớc đầu đánh giá đặc tính sinh học sản phẩm IL-11 111 4.4.1 Độ tinh trình tự axit amin đầu N IL-11 111 4.4.2 Tác dụng tăng sinh dòng tế bào IL-11 113 4.4.3 Tính an tồn IL-11 tái tổ hợp mơ hình động vật 116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 123 NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 125 SUMMARY 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHỤ LỤC LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới GS TS Trương Nam Hải TS Lê Thị Thu Hồng, thầy tận tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình nghiên cứu hoàn thành luận án Luận án thực Phòng Kỹ thuật di truyền; Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ Đề tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng y học (điều trị)” (2012-2016), mã số ĐT-PTNTĐ.2012-G/04 GS TS Trương Nam Hải làm chủ nhiệm Để hoàn thành luận án nghiên cứu này, nhận nhiều giúp đỡ quý báu nhiệt tình quan cá nhân, tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến: - Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Bộ Khoa học Công nghệ tạo điều kiện thời gian, hỗ trợ kinh phí trang thiết bị để giúp tơi hoàn thành luận án - TS Đỗ Thị Huyền tập thể cán Phòng Kỹ thuật di truyền thuộc Viện Công nghệ sinh học hỗ trợ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận án - Bộ Môn Sinh lý Bệnh – Miễn dịch, trường Đại học Y Hà Nội Viện KIểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế đơn vị thực nội dung đánh giá tính an tồn sản phẩm IL-11 tạo Với tất lòng biết ơn sâu sắc tơi xin dành cho gia đình bạn bè, người động viên tinh thần suốt thời gian thực luận án Nguyễn Thị Quý i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi thực số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng Tác giả năm 2017 Nguyễn Thị Quý ii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ALT Alanine aminotransferase Alanine aminotransferase AST Aspartate aminotransferase Aspartate aminotransferase BHK Baby hamster kidney Tế bào thận chuột non BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bò CFU-GM Colony-forming unitgranulocyte, monocyte Cụm bạch cầu hạt – bạch cầu mono CFU-Me Colony-forming unitmegakaryocyte Cụm mẫu tiểu cầu CFU-Mix Colony forming unit-mix Cụm hỗn hợp CHO Chinese hamster ovary Tế bào tử cung chuột bạch COS CV-1 cells in Origin, Tế bào thận khỉ xanh châu Phi carrying the SV40 genetic material dH2O De-ionized water Nước khử ion ECM Extracellular matrix Chất nhày ngoại bào EMEA European Medicines Agency Cơ quan quản lý thuốc châu Âu EPO Erythropoietin Yếu tố tạo hồng cầu erythropoietin FBS Fetal Bovine Serum Huyết bào thai bò FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý Thuốc Thực phẩm (Mỹ) G-CFS Granulocyte colony stimulating factor Yếu tốc kích thích cụm bạch cầu hạt Gm-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor Yếu tố kích thích cụm bạch cầu hạt đại thực bào GST Glutathione S-transferase Glutathione S-transferase HEK-239 Human embryonic kidney cells 293 Tế bào thận phôi người iii IL-3 Interleukin-3 Interleukin-3 IL-5 Interleukin-5 Interleukin-5 IL-6 Interleukin-6 Interleukin-6 IL-11 Interleukin-11 Interleukin-11 IPTG Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside Chất cảm ứng IPTG Jaks Janus kinase Chất truyền tín hiệu Janus kinase LB Luria-Bertani Môi trường LB LBamp Luria-Bertani with ampicillin Môi trường LB bổ sung ampicillin tới nồng độ cuối 100 g/ml M-CSF Macrophage colonystimulating factor Yếu tố kích thích tạo cụm đại thực bào SCF Stem cell factor Yếu tố tế bào gốc STATs Signal transducer and activators of transcription Chất truyền tín hiệu chất hoạt hóa phiên mã SUMO Small Ubiquitin-like Modifier Protein cải biến có kích thước phân tử nhỏ giống ubiquitin Ub Ubiquitin Protein điều hòa ubiquitin TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u TPO Thrombopoietin Yếu tố kích thích mẫu tiểu cầu iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Trình tự kích thước số dung hợp………………… 16 Bảng 2.1 Các loại enzyme, kháng thể hóa chất dùng nghiên cứu … 36 Bảng 2.2 Môi trường dung dịch dùng cho nghiên cứu … ……………… 37 Bảng 2.3 Liều tiêm protein IL-11 cho chuột nhắt trắng … ……………… 51 Bảng 2.4 Liều tiêm protein IL-11 cho thỏ thí nghiệm … ……………… 53 Bảng 3.1 Hàm lượng endotoxin mẫu protein IL-11 tinh chế ………… 82 Bảng 3.2 Hiệu suất loại endotoxin sản phẩm IL-11 màng Ultracel 30 kDa………………………………………………………………… 84 Bảng 3.3 So sánh nồng độ protein IL-11 trước sau đông khô 86 Bảng 3.4 Trọng lượng chuột thí nghiệm ngày theo dõi 91 Bảng 3.5 Kết nghiên cứu độc tính cấp chuột nhắt trắng …………… 91 Bảng 3.6 Ảnh hưởng IL-11 đến thể trọng chuột cống……………… 92 Bảng 3.7 Ảnh hưởng IL-11 đến chức tạo máu chuột 93 Bảng 3.8 Ảnh hưởng IL-11 đến hoạt độ aspartate aminotransferase 94 alanine aminotransferase máu chuột Bảng 3.9 Ảnh hưởng IL-11 đến chức gan chuột 95 Bảng 3.10 Ảnh hưởng IL-11đến nồng độ creatinin máu chuột 97 v Phụ lục 5: Sơ đồ cấu trúc vector pE-SUMO3 (LifeSensors): Phụ lục 6: Kết giải trình tự gen il-11 vector biểu pET22b(+) pE-SUMO3: * Giải trình tự gen il-11 vector pET22_pelB_il-11: - Giải trình tự gen il-11 mồi xi: Trình tự tương đồng với trình tự mã hóa tín hiệu tiết pelB (vị trí 63-132, đánh dấu mũi tên đường liền) toàn gen il-11 kể ba mã kết thúc (tương đương vị trí Nu 133-674 trình tự, đánh dấu mũi tên đường đứt quãng): - Giải trình tự gen il-11 mồi ngược: Trình tự tương đồng với đoạn trình tự enzyme giới hạn tín hiệu tiết pelB (tương đương vị trí Nu 616-685 trình tự, vị trí mũi tên đường liền) tồn trình tự gen il-11 kể ba mã kết thúc (tương đương vị trí Nu 75-615, vị trí mũi tên đứt qng): - Trình tự nucleotit gen pelB_il-11 sau giải trình tự (trong phần ký tự in đậm trình tự pelB, phần lại gen il-11) là: CATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGGG CCACCACCTGGCCCCCCTCGAGTTTCCCCAGACCCTCGGGCCGAGCTGGACAGCACCGTGCTCCTGACCCGCT CTCTCCTGGCGGACACGCGGCAGCTGGCTGCACAGCTGAGGGACAAATTCCCAGCTGACGGGGACCACAAC CTGGATTCCCTGCCCACCCTGGCCATGAGTGCGGGGGCACTGGGAGCTCTACAGCTCCCAGGTGTGCTGACA AGGCTGCGAGCGGACCTACTGTCCTACCTGCGGCACGTGCAGTGGCTGCGCCGGGCAGGTGGCTCTTCCCTG AAGACCCTGGAGCCCGAGCTGGGCACCCTGCAGGCCCGACTGGACCGGCTGCTGCGCCGGCTGCAGCTCCT GATGTCCCGCCTGGCCCTGCCCCAGCCACCCCCGGACCCGCCGGCGCCCCCGCTGGCGCCCCCCTCCTCAGCC TGGGGGGGCATCAGGGCCGCCCACGCCATCCTGGGGGGGCTGCACCTGACACTTGACTGGGCCGTGAGGG GACTGCTGCTGCTGAAGACTCGGCTGTGAGCGGCCGC 10 - Kết so sánh trình tự nucleotit gen pelB_il-11 sau đọc từ vector pET22_pelB_il-11 (ký hiệu Query) với gen il-11opt thiết kế (ký hiệu Sbjct) phần mềm Expasy Aligment Tools: Query Sbjct Query 61 Sbjct 61 Query 121 Sbjct 121 Query 181 Sbjct 181 Query 241 Sbjct 241 Query 301 Sbjct 301 Query 361 Sbjct 361 Query 421 Sbjct 421 Query 481 Sbjct 481 Query 541 Sbjct 541 Query 601 Sbjct 601 CATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCG 60 60 GCGATGGCCGGGCCACCACCTGGCCCCCCTCGAGTTTCCCCAGACCCTCGGGCCGAGCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGATGGCCGGGCCACCACCTGGCCCCCCTCGAGTTTCCCCAGACCCTCGGGCCGAGCTG 120 GACAGCACCGTGCTCCTGACCCGCTCTCTCCTGGCGGACACGCGGCAGCTGGCTGCACAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACAGCACCGTGCTCCTGACCCGCTCTCTCCTGGCGGACACGCGGCAGCTGGCTGCACAG 180 CTGAGGGACAAATTCCCAGCTGACGGGGACCACAACCTGGATTCCCTGCCCACCCTGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGAGGGACAAATTCCCAGCTGACGGGGACCACAACCTGGATTCCCTGCCCACCCTGGCC 240 ATGAGTGCGGGGGCACTGGGAGCTCTACAGCTCCCAGGTGTGCTGACAAGGCTGCGAGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGAGTGCGGGGGCACTGGGAGCTCTACAGCTCCCAGGTGTGCTGACAAGGCTGCGAGCG 300 GACCTACTGTCCTACCTGCGGCACGTGCAGTGGCTGCGCCGGGCAGGTGGCTCTTCCCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACCTACTGTCCTACCTGCGGCACGTGCAGTGGCTGCGCCGGGCAGGTGGCTCTTCCCTG 360 AAGACCCTGGAGCCCGAGCTGGGCACCCTGCAGGCCCGACTGGACCGGCTGCTGCGCCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGACCCTGGAGCCCGAGCTGGGCACCCTGCAGGCCCGACTGGACCGGCTGCTGCGCCGG 420 CTGCAGCTCCTGATGTcccgcctggccctgccccagccacccccggacccgccggcgccc |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCAGCTCCTGATGTCCCGCCTGGCCCTGCCCCAGCCACCCCCGGACCCGCCGGCGCCC 480 ccgctggcgccccccTCCTCAGCCTgggggggCATCAGGGCCGCCCACGCCATCCTgggg |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCGCTGGCGCCCCCCTCCTCAGCCTGGGGGGGCATCAGGGCCGCCCACGCCATCCTGGGG 540 gggCTGCACCTGACACTTGACTGGGCCGTGAGGGGACTGCTGCTGCTGAAGACTCGGCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGCTGCACCTGACACTTGACTGGGCCGTGAGGGGACTGCTGCTGCTGAAGACTCGGCTG TGAGCGGCCGCATTAG |||||||||||||||| TGAGCGGCCGCATTAG 616 616 11 120 180 240 300 360 420 480 540 600 600 * Giải trình tự gen il-11opt vector pSUMO_il-11opt: - Giải trình tự gen il-11opt mồi xi: Trình tự tương đồng với gen il-11opt từ Nu 18-534 (tương đương vị trí Nu 3-523 trình tự, đánh đấu mũi tên): 12 - Giải trình tự gen il-11opt mồi ngược: Trình tự tương đồng với gen il11opt từ Nu 1-506 (tương đương vị trí Nu 518-12 trình tự, đánh dầu mũi tên) - Trình tự nucleotit gen il-11opt giải là: GGTCCGCCGCCGGGTCCGCCGCGTGTTTCGCCGGATCCGCGTGCCGAACTGGATTCTACCGTCCTGCTGACC CGCTCGCTGCTGGCGGATACCCGTCAGCTGGCAGCACAACTGCGTGACAAATTTCCGGCCGATGGCGACCAT AACCTGGATTCACTGCCGACCCTGGCGATGTCGGCAGGTGCACTGGGTGCACTGCAGCTGCCGGGTGTGCTG ACGCGTCTGCGTGCAGATCTGCTGAGCTATCTGCGTCACGTTCAATGGCTGCGTCGCGCTGGCGGTAGCTCTC TGAAAACCCTGGAACCGGAACTGGGTACGCTGCAGGCACGTCTGGATCGTCTGCTGCGTCGCCTGCAGCTGC TGATGAGTCGTTTAGCATTACCACAGCCACCACCAGACCCGCCTGCACCTCCACTGGCTCCTCCAAGTTCTGCA TGGGGTGGTATTAGAGCAGCTCATGCTATCCTGGGCGGTCTGCACCTGACGCTGGATTGGGCTGTTCGTGGT TTATTATTGTTAAAAACCCGCCTGTAA 13 - Kết so sánh trình tự nucleotit gen il-11opt sau đọc từ vector pSUMO_il-11opt (ký hiệu Query) với gen il-11opt thiết kế (ký hiệu Sbjct) phần mềm Expasy Aligment Tools: Query Sbjct Query 61 Sbjct 61 Query 121 Sbjct 121 Query 181 Sbjct 181 Query 241 Sbjct 241 Query 301 Sbjct 301 Query 361 Sbjct 361 Query 421 Sbjct 421 Query 481 Sbjct 481 GGTCCGCCGCCGGGTCCGCCGCGTGTTTCACCGGATCCGCGTGCCGAACTGGATTCTACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTCCGCCGCCGGGTCCGCCGCGTGTTTCACCGGATCCGCGTGCCGAACTGGATTCTACC 60 60 GTCCTGCTGACCCGCTCGCTGCTGGCGGATACCCGTCAGCTGGCAGCACAACTGCGTGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCCTGCTGACCCGCTCGCTGCTGGCGGATACCCGTCAGCTGGCAGCACAACTGCGTGAC 120 AAATTTCCGGCCGATGGCGACCATAACCTGGATTCACTGCCGACCCTGGCGATGTCGGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAATTTCCGGCCGATGGCGACCATAACCTGGATTCACTGCCGACCCTGGCGATGTCGGCA 180 GGTGCACTGGGTGCACTGCAGCTGCCGGGTGTGCTGACGCGTCTGCGTGCAGATCTGCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTGCACTGGGTGCACTGCAGCTGCCGGGTGTGCTGACGCGTCTGCGTGCAGATCTGCTG 240 AGCTATCTGCGTCACGTTCAATGGCTGCGTCGCGCTGGCGGTAGCTCTCTGAAAACCCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCTATCTGCGTCACGTTCAATGGCTGCGTCGCGCTGGCGGTAGCTCTCTGAAAACCCTG 300 GAACCGGAACTGGGTACGCTGCAGGCACGTCTGGATCGTCTGCTGCGTCGCCTGCAGCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACCGGAACTGGGTACGCTGCAGGCACGTCTGGATCGTCTGCTGCGTCGCCTGCAGCTG 360 CTGATGAGTCGTTTAGCATTACCACAGCCACCACCAGACCCGCCTGCACCTCCACTGGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGATGAGTCGTTTAGCATTACCACAGCCACCACCAGACCCGCCTGCACCTCCACTGGCT 420 CCTCCAAGTTCTGCATGGGGTGGTATTAGAGCAGCTCATGCTATCCTGGGCGGTCTGCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCCAAGTTCTGCATGGGGTGGTATTAGAGCAGCTCATGCTATCCTGGGCGGTCTGCAC 480 CTGACGCTGGATTGGGCTGTTCGTGGTTTATTATTGTTAAAAACCCGCCTGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGACGCTGGATTGGGCTGTTCGTGGTTTATTATTGTTAAAAACCCGCCTGTAA 14 534 534 120 180 240 300 360 420 480 Phụ lục 7: Số liệu khảo sát điều kiện nuôi cấy cảm ứng ảnh hƣởng đến mật độ tế bào chủng E coli Rosetta tái tổ hợp Bảng 1: Ảnh hƣởng nồng độ IPTG đến mật độ tế bào thời điểm thu mẫu Nồng độ IPTG Mật độ tế bào thu mẫu (OD600) Trung Bình (mM) Lần Lần Lần 5,42 5,38 5,72 5,51 0,05 4,88 5,09 5,28 5,08 0,1 2,48 2,21 2,70 2,46 0,3 1,52 1,79 2,02 1,78 0,5 1,62 1,92 1,80 1,78 1,49 1,82 1,79 1,70 1,5 1,38 1,58 1,74 1,57 1,52 1,83 1,71 1,69 Bảng 2: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến mật độ tế bào thời điểm thu mẫu Nhiệt độ Mật độ tế bào thu mẫu (OD600) Trung Bình (oC) Lần Lần Lần 20 2,2 2,45 2,64 2,43 25 5,5 5,63 6,05 5,73 30 4,76 4,92 5,57 5,08 37 5,42 4,92 5,66 5,33 40 4,52 4,02 3,82 4,12 15 Bảng 3: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy đến mật độ tế bào thu mẫu Mật độ tế bào thu mẫu (OD600) pH môi trƣờng nuôi cấy Lần Lần Lần 1,62 1,74 2,26 1,87 5,5 4,86 4,54 3,88 4,43 5,53 5,08 4,82 5,14 6,5 5,12 5,82 4,98 5,31 6,38 5,8 5,68 5,95 7,5 5,76 5,58 6,02 5,79 5,72 6,07 5,92 5,90 Trung Bình Bảng 4: Ảnh hƣởng thời điểm cảm ứng đến mật độ tế bào thu mẫu Thời điểm cảm ứng Mật độ tế bào thu mẫu (OD600) Trung Bình (OD600) Lần Lần Lần 0,4 5,85 5,62 6,85 6,11 0,8 7,78 6,3 6,74 6,94 8,12 6,6 7,18 7,30 1,5 8,05 10,52 9,42 9,33 17,48 21,2 19,02 19,23 2,5 12,7 11,6 10,5 11,60 8,68 8,12 10,56 9,12 3,5 7,84 8,12 9,48 8,48 8,02 6,64 7,06 7,24 16 Phụ lục 8: Biểu đồ 19 axit amin chuẩn dùng để phân tích axit amin giải phóng từ phản ứng phân giải Edman Phụ lục 9: Biểu đồ phân tích trình tự 15 axit amin đầu N protein IL-11 ngƣời tái tổ hợp: Biểu đồ gốc axit amin 1: G Biểu đồ gốc axit amin 2: P Biểu đồ gốc axit amin 3: P Biểu đồ gốc axit amin 4: P 17 Biểu đồ gốc axit amin 5: G Biểu đồ gốc axit amin 6: P Biểu đồ gốc axit amin 7: P Biểu đồ gốc axit amin 8: R Biểu đồ gốc axit amin 9: V Biểu đồ gốc axit amin 10: S 18 Biểu đồ gốc axit amin 11: P Biểu đồ gốc axit amin 12: D Biểu đồ gốc axit amin 13: P Biểu đồ gốc axit amin 14: R Biểu đồ gốc axit amin 15: A 19 Phụ lục 10: Số liệu khảo sát hoạt tính IL-11 tái tổ hợp dòng tế bào TF-1 C (ng/ml) 100 50 10 2.5 0.5 0.125 0.0125 0.001 Log10C 1,69897 0,69897 0,39794 -0.30103 -0,90309 -1,90309 -3 3560,05 5516,903 5409,089 5164,103 4603,274 4106,603 3509,463 3404,767 3497,592 3396,893 6000,803 5341,833 5248,871 4990,701 4044,043 3771,140 3808,297 3056,572 3324,528 3260,772 7019,369 6512,216 6051,024 5385,464 4711,997 3937,543 3888,521 3262,85 3164,494 2837,798 Trung bình 6179,025 5375,461 5487,999 4993,146 4287,548 3756,244 3735,427 3241,396 3328,871 3165,154 Độ lệch chuẩn 766,9246 47,55717 489,4323 391,1007 368,9124 189,1868 199,7593 175,0861 166,5915 291,5542 Độ hấp phụ Ghi chú: C: Nồng độ IL-11 tái tổ hợp 18 Phụ lục 11: Đồ thị biểu diễn tăng sinh tế bào TF-1 nồng độ IL-11 tái tổ hợp (đối chứng dƣơng Biovision) đo bƣớc sóng 550 nm 615 nm BV Human; control O/N phụ Độ hấp RPM 5500 4500 3500 2500 -2 -1 Log độ conc (ng/ml) Logarit nồng IL-11 - Biovision (ng/ml) Logarit nồng độ protein IL-11 tái tổ hợp (Biovision) tăng sinh tế bào (lặp lại lần): Độ hấp phụ thấp nhất: 3264 Độ hấp phụ cao nhất: 5870 Logarit nồng độ IL-11 - Biovision có tác dụng kích thích tế bào tăng lên 50%: 0,8352 Nồng độ IL-11 - Biovision kích thích tế bào tăng lên 50%: 6,843 (ng/ml) Sự chênh lệch độ hấp phụ cao độ hấp phụ thấp nhất: 2606 19 ... KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ QUÝ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TINH CHẾ VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA INTERLEUKIN-11 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP Chuyên ngành: Hóa sinh. .. Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế bước đầu đánh giá đặc tính sinh học Interleukin-11 người tái tổ hợp thực với mục tiêu sau: - Biểu protein IL-11 người tái tổ hợp tế bào Escherichia coli - Tinh chế. .. coli - Tinh chế protein IL-11 tái tổ hợp đáp ứng yêu cầu làm dược phẩm tiêm - Bước đầu đánh giá đặc tính sinh học IL-11 tái tổ hợp tạo 3 CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Interleukin-11 vai